碘铂酸盐比色法测定葱属植物中总硫化物的含量

朱艳雯，陈琭璐，刘 玲，颜廷才，檀德宏，白冰

（沈阳农业大学食品学院 沈阳 110866）

葱属、菌菇类和藻类中所含的硫化物主要是硫取代的半胱氨酸衍生物[1-5]，它们包括3 类：烷基（烯基）半胱氨酸、烷基（烯基）半胱氨酸亚砜（蒜氨酸）和γ-谷氨酰-烷基（烯基）半胱氨酸肽类[6-7]，它们都是葱属植物（如大蒜、洋葱、韭菜等）中风味硫的来源[8-11]，且具有生理活性[12]，如：降血糖[13-14]、降血脂[15]、抗菌[16]、抗肿瘤[17]、抗炎[18-19]、清除自由基[20]等。在食品工业或功能活性研究中定量分析葱属硫化物具有重要意义[21]。

目前，常用的毛细管电泳法（CE）[22-23]和气相色谱法（GC）[24]仅局限于检测半胱氨酸亚砜类物质[25]，且需要衍生化处理，GC 还受含硫氨基酸衍生物不易气化和高热敏性的限制。液相色谱法（HPLC）检测前需进行柱前衍生[26]（丹磺酰氯苯、邻苯二甲醛/叔丁基硫醇、芴甲基氯甲酸酯等）处理，且仅有丹磺酰氯衍生处理才能同时实现样品中半胱氨酸巯基取代物、亚砜类硫化物以及γ-谷氨酰-半胱氨酸衍生物的测定[27-29]。不论是CE、GC还是HPLC 均属于大型仪器检测法，不仅需要复杂的衍生化处理，还需要标准品定量。其它比色法，如用于检测氨基酸的茚三酮法[30]，检出限低（mg/mL），对含硫氨基酸（如Cys、Met）显色差；DTNB法[31]只能测定含有二硫键或游离巯基的硫化物。因此，开发出一种简单、快速、线性和重现性好、干扰小并能同时检出总有机硫化物的方法是非常有意义的。

本文研究一种可用于检测葱属硫化物的碘铂酸盐比色法，以谷胱甘肽（GSH）为标准品，对该比色法评价，指标包括：标准曲线、最低检出限（LOD）、最低定量限（LOQ）、可重复性、摩尔消光系数（ε）、重现性、准确度、精密度。以国内外公认的高效液相色谱-电喷雾电离-质谱联用（HPLCESI-MS）技术[32]进行验证，比较6 种葱属作物（白皮蒜、紫皮蒜、大葱、韭菜、黄洋葱及紫洋葱）的总硫化物含量。

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

白皮蒜、紫皮蒜、大葱、韭菜、黄皮洋葱、紫皮洋葱，购于沈阳农业大学农贸市场；谷胱甘肽（GSH）、六氯铂酸、碘化钾、乙二胺四乙酸（EDTA）、四硼酸钠、丹磺酰氯等，购于鼎国生物技术有限公司；12 种硫化物的标准品：S-甲基-L-半胱氨酸（SMC）、S-烯丙基-L-半胱氨酸（SAC）、S-丙基-L-半胱氨酸（SPC）、S-丁基-L-半胱氨酸（SBC）、S-甲基-L-半胱氨酸亚砜（MCSO）、S-烯丙基-L-半胱氨酸亚砜（ACSO）、S-丙基-L-半胱氨酸亚砜（PCSO）、S-丁基-L-半胱氨酸亚砜（BCSO）、γ-谷氨酰-S-甲基-L-半胱氨酸（GSMC）、γ-谷氨酰-S-烯丙基-L-半胱氨酸（GSAC）、γ-谷氨酰-S-丁基-L-半胱氨酸（GSBC）、γ-谷氨酰-S-丙基-L-半胱氨酸（GSPC），通过化学合成以及离子交换层析得到，经过高效液相色谱-电喷雾电离-质谱联用（HPLC-ESI-MS）、核磁共振氢谱（1H和13C NMR）以及圆二色谱检测确定，其纯度>95%[15-16]。

高效液相色谱-电喷雾电离-质谱联用仪，美国Agilent 公司；紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司；RE-52A 型旋转蒸发器，上海亚荣生化仪器厂；台式高速离心机，长沙湘仪离心机仪器有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 硫化物标准溶液的配制 12 种硫化物标准品可划分为3 类，S-烷基-L-半胱氨酸类（a类）：SMC（1a）、SAC（2a）质量浓度范围：10～60 μg/mL，SPC（3a）：10～100 μg/mL，SBC（4a）：5～30 μg/mL；S-烷基-L-半胱氨酸亚砜类（b 类）：MCSO（1b）、PCSO（3b）和BCSO（4b）质量浓 度范围 为10～20 μg/mL，ACSO（2b）：2～10 μg/mL；γ-谷氨酰-S-烷基-L-半胱氨酸类（c 类）：GSMC（1c）、GSAC（2c）、GSPC（3c）和GSBC（4c）质量浓度范围均为100～600 μg/mL，配置溶液为磷酸缓冲液（0.2 mol/L，pH 7.0）。标准品GSH 质量浓度范围为0～30 μg/mL。

1.2.2 高效液相色谱-电喷雾电离-质谱联用（HPLC-ESI-MS）

1.2.2.1 丹磺酰氯衍生 分别取大蒜（白皮、紫皮）、洋葱（黄皮、紫皮）、韭菜、大葱各10 g，浸于70%乙醇（80 mL），煮沸灭酶；冷却后加入50 mL酸化甲醇（0.01 mol/L HCl）研磨至匀浆，酸化甲醇定容至150 mL 后进行旋转蒸发（40 ℃）浓缩至10 mL，0.02 mol/L 硼酸盐调节pH 值至9.2，并用酸化甲醇定容至25 mL，-20 ℃储存。取100 μL 前处理样液，加入250 μL 0.1 mol/L 丹磺酰氯-乙腈试剂和1.65 mL 0.020 mol/L 硼酸缓冲液（pH 9.2），充分振荡后放置15 min。

1.2.2.2 液相质谱色谱条件 HPLC-MS：Dikma C18（250 mm×4.6 mm ID，5 μm）；流动相：V（0.05mol/L醋酸钠）∶V（甲醇）=70/30（0 min），60/40（35 min），25/75（60 min），25/75（65 min），70/30（70 min）；10 mg/mL；20 μL；0.9 mL/min；质谱0.4 mL/min；35 ℃；250 nm；30 Pa；ESI-MS 负离子扫描模式[1]。

1.2.3 比色法样品的前处理 取6 种葱属作物样品（白皮蒜、紫皮蒜、大葱、韭菜、黄皮洋葱、紫皮洋葱）各5 g，分别浸没于乙醇（70%，80 mL），沸水浴加热5 min，冷却至室温，匀浆，70%乙醇定容至100 mL，8 000 r/min 离心15 min，取上清液备用。

1.2.4 碘铂酸盐显色剂的配置 50 μL，2×10-5mmol/L 的六氯铂酸溶液与5 mL 0.33 mol/L 的碘化钾溶液室温下充分混合，放置12 h 后用1 mol/L的冰醋酸定容至50 mL，配成碘铂酸盐显色剂备用。

1.2.5 比色法测定程序 取40 μL 上清液于试管中，40 ℃鼓风干燥箱烘干后冷却至室温，加入2 mL 磷酸缓冲溶液（0.2 mol/L，pH 7.0）和1 mL 碘铂酸盐显色剂室温下混匀后于495 nm 下测定吸光度，同时作对照。

1.2.6 比色法的评价指标 比色法从线性指标、检出限（LOD）、定量限（LOQ）、可重复性、摩尔消光系数（ε）这5 个指标进行评价。并利用上述提到的6 种葱属作物样品从重现性、准确度和精确度验证比色法。

1.2.6.1 标准曲线 标准曲线被定义为吸光值和浓度的比值，即（S/Q）i=（Si-a）/Qi，其中（S/Q）i 表示曲线中第i 个点的吸光值（S）与浓度（Q）的比值，即斜率，其中a 表示该曲线在y 轴的截距。

1.2.6.2 最低检出限（LOD）和最低定量限（LOQ）最低检出限（LOD）：检测出的分析物的最低浓度，LOD=3.3 σ/S；最低定量限（LOQ）：能定量检测出分析物的最低量，LOQ=10 σ/S，两式中σ 表示对标准品进行3 次平行测定，所计算出的线性回归方程在y 轴截距的标准偏差；S 表示标准曲线的斜率。

1.2.6.3 可重复性 可重复性由相对标准偏差的平均值来表示，即可重复性=（RSD）eve=（SD（i）/Mean（i））eve，SD 表示在吸光度的标准偏差；Mean 表示吸光度的平均值；i 表示标准品质量浓度（μg/mL）。

1.2.6.4 摩尔消光系数（ε）摩尔消光系数ε=A/（c×l），式中：ε 的单位为cm2/μmol，A 表示吸光值；c 表示样品浓度（μmol/cm3）；l 表示光径（cm），本文选用光径为1 cm 的石英比色皿，495 nm 比色。

1.2.6.5 重现性 在第1 天、第3 天和第7 天对葱属样品一式3 份进行重现性检测，重现性表示为相对标准偏差的平均值。

1.2.6.6 准确度 通过对被测定组分进行GSH（5，10，15 mg）回收试验来评估其准确度。

1.2.6.7 精密度 精密度，即变异系数（CV%），计算方法为添加GSH 的同一样品的3 个平行样的标准偏差与平均值的比值。

1.2.6.8 溶剂干扰检测 溶剂干扰因子（k）可以表示溶剂的干扰，k=ε1/ε2，式中：ε1表示GSH（5 μg/mL）在待测溶剂中的摩尔消光系数，ε2表示GSH（5 μg/mL）在水中的摩尔消光系数。

2 结果与讨论

2.1 碘铂酸盐比色原理

碘铂酸盐中因含有深褐色的碘单质而具有弱氧化性，与还原态的硫发生氧化还原反应生成无色的络合物导致深褐色变浅。因此选用含巯基（-SH，还原态硫）的GSH 作为标准品来确定这个比色过程，如图1。碘铂酸盐在495 nm 处有最大吸收，被还原后此处吸光值下降。

2.2 比色法的评价指标（标准曲线、LOD、LOQ、可重复性、重现性、准确度和精密度）

以GSH（0～30 μg/mL）作标准品，如图2，比色法的标准曲线为y=0.54153-0.00798x，线性相关系数0.9997，说明此比色法线性关系良好，LOD 值（0.26 μg/mL）和LOQ 值（0.78 μg/mL）较低，检出限0.39 g/kg，说明此比色法灵敏度较高及检出限较低；可重复性数据90.4%，说明此比色法稳定性较好。

第1 天、第3 天和第7 天以GSH 为标准品利用此比色法测定6 种葱属样品（白皮蒜、紫皮蒜、大葱、韭菜、黄洋葱、紫洋葱）的硫化物总含量，得出相对标准偏差的平均值分别为4.0%，4.6%，3.9%，4.5%，2.5%，2.8%，均小于5%，说明该方法具有良好的重现性。通过加入已知量的GSH 计算回收率和变异系数（表1），利用这两个指标反映比色法的准确度和精密度，发现标准品GSH 的回收率均满足80%～120%，变异系数均满足0～5%，说明以GSH 为标准品的此方法具有优良的准确度和精密度。

2.3 碘铂酸盐比色法测定6 种葱属样品中总硫化物含量

以GSH 作为标准品，分别利用碘铂酸盐比色法测得6 种葱属样品中硫化物总量，得到白皮蒜、紫皮蒜、大葱、韭菜、黄洋葱、紫洋葱分别为（6.57±1.09）g，（13.87±1.23）g，（13.96±0.98）g，（2.34±1.09）g，（1.59±0.74）g，（1.77±0.35）g。为进一步验证此方法实际应用中的准确性，引入HPLC-ESIMS 法进行校对。

2.4 HPLC-ESI-MS 法测定6 种葱属样品中总硫化物含量

以12 种硫化物标准品为外标，经HPLC-ES-I-MS 结合丹磺酰氯衍生测得6 种葱属作物（白皮蒜、紫皮蒜、大葱、韭菜、黄皮洋葱、紫皮洋葱）中相应的硫化物含量。以白皮蒜样品为例（图3），总离子流图中显示出6 种有机硫化物，分别是GSPC（2c）、PCSO（3b）、SAC（2a）、SPC（3a）、GSMC（1c）、GSBC（4c），对应质谱图（图3，ⅰ～ⅵ）。ESI-MS 正离子扫描模式下，GSPC（2c）对应质谱信息如下：GSPC（2c，C11H18O5N2S，保留时间5.3 min，[M+H]+，m/z 290.9），并以外标法计算白皮蒜中含GSPC（0.50±0.17）mg/g；同理，PCSO（3b，C6H13O3NS），（0.86±0.06）mg/g；SAC（2a，C6H11O2NS），（3.86±0.29）mg/g；SPC（3a，C6H13O2NS），（1.25±0.12）mg/g；GSMC（1c，C9H16O5N2S），（0.91 ±0.23）mg/g；GSBC（4c，C12H22O5N2S），（0.78±0.22）mg/g，相加得到硫化物总量为（8.08±0.88）mg/g。其它5 种葱属样品依次按照此方法得出相应硫化物含量及总量，结果如表2 所示。

2.5 HPLC-ESI-MS 法与碘铂酸盐比色法的对比分析

以HPLC-ESI-MS 法测得6 种葱属样品的结果为依据，评价以GSH 为标准品时碘铂酸盐比色法瞬时检出总有机硫化物结果的准确性。以GSH作标准品，比色法所得结果与HPLC-ESI-MS 法无显著性差异。因此，碘铂酸盐比色法（GSH 为标准品）所得结果接近实际值（HPLC-ESI-MS 法），进一步证明检测葱属总硫化物时此比色法可替代HPLC-ESI-MS 法。

本文推荐的碘铂酸盐比色法，具备操作简便、稳定性好、成本低廉、不需要衍生的预处理过程、可一次性检出有机硫化物总量的优点，适用于快检分析。本比色法显色快，且室温下放置1 周不褪色，稳定性好，适用于葱属硫化物检测（>1 g/kg），同时也适用于硫化物含量低的豆类、菌类及十字花科类。本法可检测多种硫化物，如半胱氨酸衍生物，γ-谷氨酰半胱氨酸衍生物和亚砜衍生物，抗干扰能力强，不受样品中蛋白及氨基酸影响。

本比色法需注意的是碘铂酸盐在中性或酸性环境下稳定，另外某些溶剂具有漂白性，也会影响比色结果。本文利用吸光值（495 nm）下降比以及溶剂干扰因子k 比较了几种常见溶剂对比色法的影响，见表3。干扰作用越强，吸光下降越多；k 越接近1，说明溶剂的干扰效果越小。

表3 溶剂干扰因子k值Table 3 Solvent interference factor k value

3 结论

综上可见，本比色法具有操作简便、灵敏度高、适用范围广、利用GSH 作标准品时可一次性检测有机硫化物总量等特点，可适用于现场样品快速检测分析，是大型仪器检测分析的有益补充和替代方法。