柚皮素对高脂与高糖诱导的小鼠非酒精性脂肪肝病的干预作用

葛晶晶，阮征*

（1 南昌大学食品学院 南昌330047 2 食品科学与资源挖掘全国重点实验室（南昌大学）南昌 330047）

非酒精性脂肪肝（Non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）是一种高度流行的肝脏疾病，它与肥胖和代谢性疾病密切相关，其特点是在没有过度饮酒和其它继发性肝脂肪变性的情况下，脂肪在5%以上的肝细胞内积聚。NAFLD 是非酒精性肝炎（NASH）的早期阶段，也是肝细胞癌的主要原因，同时增加一系列疾病的发病风险。近年来，也有人提出代谢性脂肪肝病（metabolic dysfunction-associated fatty liver disease，MAFLD）的术语来替代NAFLD，提供更广泛的诊断标准，即存在脂肪变性，同时存在以下一种或多种症状，包括超重或肥胖、Ⅱ型糖尿病、两种或两种以上代谢风险异常[1]。欧洲和亚洲的患病率最高，其次是北美。一项历时4.6 年，6 873 人参与的队列研究调查了MAFLD 在中国的流行和发病率[2]，报告显示，NAFLD和MAFLD 的患病率分别为40.3%和46.7%。近年来，NAFLD 在我国的发病率有较明显的增长趋势，到2030 年，中国NAFLD 患者总数预计将增至3.1458 亿人[3]。

研究证明，肠道菌群紊乱引起的肠道通透性增加，在NAFLD 的发生、发展中起着重要作用[4]。通过提升肠道通透性，增加循环中的有毒细菌代谢产物，如乙醇和脂多糖（Lipopolysaccharides，LPS）。这些代谢物将通过门静脉进入肝脏，引起炎症和脂肪变性[5]。另外，有研究[6]发现NAFLD 患者肝脏中存在高水平的菌群来源的LPS 定位，提示菌群来源的LPS 在NAFLD 的进展中发挥重要作用，同时强调了肠-肝轴的作用。综上，肠道通透性的降低对解决非酒精脂肪肝病具有潜在影响。

柑橘类黄酮是柑橘中的活性成分，价格便宜，容易获得，具有广泛的降脂、抗炎、抗氧化和降血糖的作用。大量研究表明，柑橘类黄酮可以改善NAFLD 的症状，如调节脂质代谢、代谢紊乱[7-9]和在代谢重要组织如肝脏中减轻炎症反应。柚皮素（Naringenin）是类黄酮的一种。此前的研究表明，柚皮素对脂质积累和肝脏脂肪变性有显著影响[10]。柚皮素的保肝作用也表现在抗炎生物活力[11]，Tsuhako等[12]发现柚皮素能抑制短期高脂诱导小鼠脂肪组织的炎性浸润。此外，柚皮苷（柚皮素的糖苷形式）可以促进肠道屏障，降低肠道通透性[13]。

Asgharpour 等[14]对C57BL/6J 小鼠饲喂高脂肪、高糖饮食后发生脂肪变性和脂肪性肝炎，小鼠表现出与人类疾病相似的代谢特征、脂质积累和组织学改变。此外，果糖在NAFLD 中有额外的作用，果糖损伤肠道屏障，导致肠道渗漏、内毒素血症[15-16]。动物模型表明，果糖诱导的NAFLD 与肠道微生物过度生长引起的肠道通透性增加有关[17-18]。本试验选择高脂、高糖饮食诱导小鼠NAFLD，研究柚皮素对小鼠NAFLD 的缓解作用，同时通过检测肝脏菌群衍生LPS 定位，研究柚皮素是否通过肠肝轴效应影响NAFLD。

1 材料与方法

1.1 实验动物、材料与试剂

6 周龄雄性清洁级小鼠，体质量（20±2）g，由北京斯贝福生物科技有限公司提供。

甘油三酯（TG）试剂盒，南京建成生物工程研究所；白细胞介素-6（IL-6）试剂盒、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、脂多糖LPS 试剂盒，上海酶联生物科技有限公司；鼠单克隆大肠杆菌LPS 抗体（ab35654），艾博抗（上海）贸易有限公司；苏木素-伊红（H&E）染液（B1002），武汉佰仟度生物试剂有限公司；鼠维持饲料和高脂模型饲料，江苏协同生物有限公司；果糖，山东百龙创园生物科技有限公司；柚皮素（＞90%），西安瑞林生物科技有限公司。其它试剂均为分析纯级。

1.2 仪器与设备

SMR60047 多功能酶标检测仪，USCNK；Nikon Eclipse CI 正置光学显微镜，日本尼康；Nikon Eclipse E100 倒置荧光显微镜，日本尼康；NIKONDS-U3 成像系统Image-Pro Plus 6，日本尼康；AU5800 全自动生化分析仪，Beckman Coulter 公司；3K15 高速冷冻离心机，德国Sigma 公司。

1.3 方法

1.3.1 NAFLD 小鼠模型建立 雄性健康的C57BL/6J 小鼠饲喂于SPF 级鼠房，室温（24±2）℃，相对湿度（45±3）%，光照12 h/d，小鼠适应性喂养1 周后，将18 只小鼠随机分为3 组，对照组（NCD）喂食普通饲料，模型组（HFFD）及柚皮素（NAR）组饲喂高脂饲料（60%能量来自脂肪）及果糖水（质量浓度为30 g/100 mL），NAR 组每天以0.4 g/（kg·d）剂量灌胃，NCD 组和HFFD 组分别给予等量生理盐水。所有小鼠自由摄取食物及饮水。连续喂养9 周后，所有小鼠禁食不禁水12 h，眼球取血后采用脱颈法处死小鼠，取出肝脏，最小叶用4%多聚甲醛固定，HE 染色，切片，进行组织病理学检查和免疫荧光染色；其余肝脏液氮速冻后保存于-80 ℃冰箱直到测试。

1.3.2 指标测定 采用全自动生化分析仪测定血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（AST）、脂多糖水平及二胺氧化酶（Diamine Oxidase，DAO）水平。使用商用试剂盒测定血清中甘油三酯（TG）、总胆固醇（TC）浓度、肝脏中TG 浓度。采用ELISA 法检测血清LPS 水平和肝脏促炎细胞因子、白细胞介素（IL）-6 和肿瘤坏死因子（TNF）-α 水平。酶联免疫吸附试验按照说明书的方法进行。

1.3.3 肝组织病理形态与免疫荧光组织化学分析 用苏木精和曙红（H&E）染色石蜡切片（4 μm厚），于光学显微镜下观察（200×与400×视野）。免疫荧光步骤如下：石蜡切片脱蜡至水，抗原修复，BSA 封闭，加一抗4 ℃封闭过夜，脱色后加二抗避光室温孵育50 min，DAPI 复染细胞核，封片，于尼康倒置荧光显微镜下观察并采集图像。（紫外激发波长330～380 nm，发射波长420 nm；FITC 绿光激发波长465～495 nm，发射波长515～555 nm；CY3红光激发波长510～560，发射波长590 nm）。在倒置荧光显微镜下观察（100×与200×视野）。拍照时尽量让组织充满整个视野，保证每张照片的背景光一致。应用Image-Pro Plus 6.0 软件将绿色/红色荧光单色照片转换为黑白图片，然后选取相同的黑色作为判断所有照片阳性的统一标准，对每张照片进行分析得出每张照片阳性的累积光密度值（IOD）以及组织的像素面积（AREA）。并求出平均光密度值IOD/AREA（Mean Density）。

1.4 数据处理

所有数据采用SPSS22.0 统计软件进行处理，采用一般描述性统计数据进行分析，使用Graphpad8.0 作图，数据表示为（平均值±标准差），P＜0.05 认为组间存在显著性差异，P<0.01与P<0.001 认为组间存在极显著性差异。

2 结果与分析

2.1 NAR 降低诱导的NAFLD 小鼠体质量、肝脏质量及附睾脂肪质量。

如表1 所示，试验开始前，各组小鼠体质量无显著差异。9 周后，HFFD 组小鼠相对NCD 组体质量极显著增长（P<0.001），肝脏质量（P<0.001）、附睾脂肪质量（P<0.01）均极显著升高；同时，相对HFFD 组，NAR 组小鼠体质量、肝脏质量显著下降，NAR 组附睾脂肪质量与模型组无显著差异。表明NAR 干预可显著抑制高脂、高糖饮食诱导的体质量增长，减轻肝脏肿胀。

表1 NAR 降低高脂、高糖诱导的NAFLD 小鼠体质量、肝脏质量及附睾脂肪质量（n=6）Table 1 Naringenin reduce the body weight，liver weight，epididymis fat in NAFLD mice fed with HFFD（n=6）

表2 柚皮素缓解高脂、高糖诱导NAFLD 小鼠肝脏炎症（ng/mg prot）（n=6）Table 2 Naringenin alleviate the hepatic inflammation on NAFLD mice fed with HFFD（ng/mg prot）（n=6）

2.2 NAR 降低诱导的NAFLD 小鼠血清和肝脏甘油三酯水平

如图1 所示，与NCD 组相比，HFFD 组血清TC、TG、肝脏TG 水平显著升高。NAR 灌胃显著降低了血清TG 和肝脏TG 水平。这些结果表明，NAR 可以减轻NAFLD 小鼠血清与肝脏中的脂质堆积，在一定程度上能减轻NAFLD 的危害。

图1 NAR 降低高脂、高糖诱导的NAFLD 小鼠血清和肝脏甘油三酯水平（n=6）Fig.1 NAR reduce the TG levels in serum and liver of NAFLD mice fed with HFFD（n=6）

2.3 NAR 缓解高脂、高糖诱导NAFLD 小鼠肝脏组织病理学变化

普通维持饲料喂养的NCD 组小鼠：肝组织结构基本正常，视野内肝细胞结构完整、轮廓清晰、胞核圆润、胞质丰富，未见坏死、变性；肝窦大小均匀，未见扩张，肝索排列整齐紧密。高脂、高糖饲料喂养的HFFD 组小鼠：肝组织结构重度异常，轮廓不清晰，部分肝细胞坏死，视野内大面积肝细胞重度脂肪变性，胞质内可见大小不一的圆形脂滴，如红色箭头所示；NAR 灌胃的干预组小鼠：肝组织结构中度异常，视野内部分肝细胞脂肪变性，胞质内可见大小均匀的圆形脂滴，如红色箭头所示；肝细胞轮廓清晰，未见坏死；肝窦未见扩张，肝索排列规则。以上结果表明，柚皮素能缓解高脂、高糖饮食导致的肝脏组织病理损伤，减轻脂质堆积。

2.4 NAR 缓解高脂、高糖诱导NAFLD 小鼠肝脏损伤

肝酶天冬氨酸氨基转移酶（AST）和丙氨酸氨基转移酶（ALT）升高是肝损伤的标志之一，预示着肝脏功能受损。如图2 所示，与预期一样，HFFD极显著提高了小鼠血清中的AST 和ALT，表明小鼠肝脏受到损伤。而NAR 干预极显著降低了AST（P<0.01）水平，显著降低了ALT（P<0.05）水平，说明NAR 能在一定程度上缓解高脂、高糖饮食诱导的NAFLD 小鼠肝脏损伤。

图2 柚皮素缓解高脂、高糖诱导NAFLD 小鼠肝脏组织病理学变化Fig.2 Naringenin alleviate the changes of liver histopathology on NAFLD mice fed with HFFD

图3 柚皮素缓解高脂、高糖诱导NAFLD 小鼠肝脏损伤（n=6）Fig.3 Naringenin alleviate the hepatic injury on NAFLD mice fed with HFFD（n=6）

2.5 NAR 缓解高脂、高糖诱导NAFLD 小鼠肝脏炎症

TNF-α 和IL-6 是LPS 在肝脏与TLR4 受体结合后刺激产生的促炎因子[19]，如图4 所示，NAFLD 小鼠肝脏中的促炎因子TNF-α、IL-6 显著升高。而灌胃NAR 使TNF-α 和IL-6 水平极显著降低（P<0.001），恢复到正常水平，表明NAR 可以减轻NAFLD 小鼠中的炎症反应，减轻肝脏损伤。

图4 柚皮素减少高脂、高糖诱导NAFLD 小鼠肝脏菌群衍生LPS 定位（n=3）Fig.4 NAR suppress bacteria derived LPS location in the liver of NAFLD mice fed with HFFD（n=3）

2.6 NAR 减少肝脏菌群衍生LPS 定位

菌群衍生的LPS 在NAFLD 的发展中起重要作用。有研究发现肝脏肠源性LPS 定位与肝损伤严重程度相关[6，20]，并且在NAFLD 和非酒精脂肪肝炎（NASH）患者中都发现了高水平的菌群衍生LPS[6]。LPS 在肝脏 中会结 合TLR4受体，激 活Kupffer 细胞和肝星状细胞（HSC），导致炎症反应，造成肝脏炎症损伤[21]。如图5 所示，免疫荧光分析显示HFFD 组肝脏具有显著的菌群衍生LPS 定位，而灌胃NAR 显著减少了小鼠肝脏中的菌群衍生LPS。

图5 柚皮素降低高脂、高糖诱导NAFLD 小鼠肠道通透性（n=6）Fig.5 NAR reduce intestinal permeability in NAFLD mice fed with HFFD（n=6）

2.7 柚皮素降低高脂、高糖诱导NAFLD 小鼠肠道通透性

高脂饮食会导致肠道微生物紊乱，导致肠道通透性上升，同时，有报道称长期高糖饮食与内毒血症有关。肠道通透性降低会导致菌群衍生的LPS 等物质进入门静脉循环，从而触发肝脏炎症，造成肝脏损伤。本试验检测了血清LPS 及DAO 水平以确定肠道通透性的变化。如图5 所示，HFFD组相对NCD 组血清LPS 与DAO 显著上升，提示该组肠道通透性上升。灌胃NAR 显著降低了血清LPS 的水平，降低了血清DAO 水平，虽然数据未达到显著水平。表明NAR 灌胃可以降低NAFLD小鼠的肠道通透性，有助于肝脏菌群衍生LPS 的减少。

3 讨论

柚皮素是广泛存在于柑橘类水果的类黄酮之一，具有良好的抗脂、抗炎作用。在本试验中，经过柚皮素灌胃后，小鼠体质量与肝质量显著降低，血清与肝脏TG 显著减少，AST、ALT 活力显著降低，组织病理损伤改善，肝脏炎症因子水平极显著降低，表明柚皮素NAR 有效缓解了高脂、高糖诱导的小鼠非酒精性脂肪肝病，减轻了小鼠肝脏脂质堆积与炎症，表明柚皮素对饮食（高脂、高糖）诱导的NAFLD 有良好的干预效果。

同时，柚皮素干预降低了肠道通透性，减少了肝脏菌群衍生的LPS。饮食通过调节肠道微生物群影响肠道通透性，如高脂和高糖饮食会导致肠道菌群紊乱，肠道通透性增加，促进内毒血症，增加进入门脉循环的脂多糖（LPS）的增加，这种肠肝轴效应是目前NAFLD 的治疗靶点之一[22]，本试验确定了柚皮素可以通过这种肠肝轴效应减轻肝脏炎症损伤。LPS 是革兰氏阴性菌的产物，过度衍生的产LPS 菌群也会导致进入门静脉循环的LPS 增加。同时乳糜微粒生物合成的增强也会导致LPS易位[23]。因此需要进一步试验确定柚皮素减少肝脏菌群衍生LPS 的原因。