天然产物应用于蜜蜂病毒病防控的研究进展

黄知楚，刘 瑶，周倪红，黄 伦，郑火青

（1.浙江大学动物科学学院，浙江 杭州 310058；2.四川省甘孜州蜂业管理站，四川 甘孜 626000）

1 前言

蜜蜂是重要的经济昆虫，也是现代农业中最具经济价值的传粉者，约1/3 的农作物依赖于蜜蜂授粉，其授粉服务使世界各地的农作物增值约9.5%[1]。蜂产业的健康发展不仅关系着蜂产品的产量和质量、农作物的增产效益，也关系着生物多样性维护和生态系统平衡。

尽管世界粮农组织统计数据表明近几十年来全球蜂群总数增长了45%[2]，但其授粉服务仍不能满足日益增长的世界人口数量和粮食产量需求[3]。蜜蜂面临各种生物因素与非生物因素的侵扰，每年仍有大量蜂群损失[4]。引起蜂群损失的因素是双重的。在蜂群内部，蜜蜂面临营养水平失衡[5]、蜂王生育性能下降[6]等挑战，高密度的饲养管理模式下的蜜蜂也极易遭受细菌、真菌、病毒等病原体感染和寄生虫侵扰[7,8]；在蜂群外部，气候和环境变化[9]、农业中化学药物的使用[10]、觅食地的减少与越冬损失[11]等都是影响蜂群健康的重要因素。

在前述众多因素中，蜜蜂病毒感染很常见但又是在养殖过程中容易被忽视的问题。因为蜜蜂病毒具有极强的隐蔽性，以低浓度的隐性方式感染蜜蜂，只有少数病毒能够产生可鉴别的临床症状，难以引起养蜂人的重视。目前有二十多种蜜蜂病毒被分离鉴定并广泛分布于世界各地的蜂群中，其中7 种病毒在蜂群中高度流行，分别是残翅病毒（D eform ed W ing V irus,D W V）、急性蜜蜂麻痹病毒（A cute Bee Paralysis V irus, A BPV）、 囊 状 幼 虫 病 毒（Sacbrood Bee V irus,SBV）、黑蜂王台病毒（Black Q ueen CellV irus,BQ CV）、以色列急性麻痹病毒（IsraeliA cute Paralysis V irus,IA PV）、慢性蜜蜂麻痹病毒（Chronic Bee Paralysis V irus,CBPV） 和克什米尔病毒（K ashm ir Bee V irus,K BV）。大多数种类蜜蜂病毒的遗传物质为正义单链R N A，归属仿小核糖核酸病毒目（Picorna-likevirus），仅有蜜蜂丝状病毒（A pis M elliferaFilam entous V irus,A m FV） 和蜜蜂虹彩病毒（A pis iridescentvirus,A IV） 是D N A 病毒。近年来，随着高通量测序技术与生物信息学的发展，又有越来越多的病毒从世界各地的蜂群中被发现，其中还包括一些负义单链R N A 和双链R N A 病毒[12,13]。病毒通过食源性传播、性传播以及媒介传播等水平途径在同一代不同个体间传播，或以垂直传播方式借助蜜蜂的繁育行为从亲代传递到子代[14]。蜜蜂病毒的宿主非常广泛，并不仅限于蜜蜂种群内，有些病毒能够在其他膜翅目甚至非膜翅目的节肢动物中检测到[15]。

蜜蜂并非对病毒疾病没有抵抗力[16]，在长期进化和自然选择过程中也形成了与其周围环境相适应的形态结构和生活方式，具备了一套完善的防御体系以保护自身安全。在个体层面，蜜蜂通过Toll、Im d、JN K 和JA K/STA T 4 条主要的先天免疫通路调控神经、内分泌及免疫系统维持机体平衡[17]；而在群体层面，蜜蜂会更多地收集储存植物的花蜜、花粉和树脂（蜂胶），并采食其中特定的植物化学物质，以此作为减少蜂群病原体负荷的一种手段[18-22]。

而在一些特定条件下，在蜜蜂病毒寄主体细胞内大量复制，感染程度超过蜂群可调节能力范围时，即可表现出强烈的致病性，从而引发致死性蜜蜂病毒病的流行与爆发。由于病毒利用宿主细胞进行繁殖和存活，目前还没有研发出能够杀灭病毒而不影响蜜蜂生理的特效疗法。同时，蜂群中药物的使用给蜂产品质量安全带来很大风险，因此，在科研和生产实践中，人们期望寻求一种温和、安全且可长期使用的药物以提高蜜蜂对病毒的抵抗力并延长蜜蜂寿命，天然产物补充剂在蜂群疾病防控中的需求由此应运而生。

2 天然产物

天然产物，也称次级代谢产物，是指动物、植物或微生物等天然来源的具有药理学或生物学活性的化合物或其代谢产物[23]。与生物体生长发育所必需的初级代谢产物不同，天然产物化学结构复杂，且仅出现在特定的物种、器官、组织或细胞中。天然产物对自身无具体的生理功能，主要作用是为生物体带来某种形式的保护和益处，协助生物体适应复杂的生态环境，如作为引诱剂、驱避剂、拒食剂和抗生物质等，调节与其他生物体的相互作用，从而有利于其生存[24,25]。

天然产物来源广泛，结构类型多样，可通过已知结构的天然产物进行化学合成和结构改造，或通过代谢工程等途径生产，但最直接的获取途径仍是从生物体中提取分离。我国是植物资源大国，对中草药利用历史悠久，极大地推动了天然植物提取物行业的发展，植物来源的天然产物资源尤其丰富。

3 天然产物与蜜蜂病毒病的防控

植物来源的天然产物也是蜜蜂最常接触到的天然产物种类。在没有人工管理的野外条件下，植物花蜜和花粉是蜜蜂唯一的碳水化合物和蛋白质食物来源，蜜蜂通过采食富含天然产物的花蜜和花粉维持蜂群运转，根据植物中天然产物的浓度相应地改变自己的觅食行为，在寄生虫和疾病入侵时通过增加采集减少蜂群病原体负荷[26]。植物天然产物对蜂群几种主要病毒病的防控效果将在下文进行分类阐述。

3.1 残翅病毒（D W V）

D W V 是世界范围内蜜蜂感染最普遍的传染性软腐病毒科（Iflaviridae） 病毒，于1977年在埃及从无症状的蜜蜂中分离出来。D W V最初感染西方蜜蜂蜂群时滴度低、致病力弱、危害小，没有引起重视。而狄斯瓦螨在全世界西方蜜蜂蜂群广泛传播后，改变了D W V 流行程度及其多样性，成为D W V 最主要的传播媒介[27]。D W V 对不同性别和发育阶段的蜜蜂均有影响，发病成蜂的典型症状包括翅残缺或畸形、腹部萎缩、体色变暗且失去飞行能力，隐性感染D W V 的蜜蜂即使无发病症状也会导致寿命缩短。

Y oung 等人[28]测试了蜂群短期摄入7 种天然产物后对健康与免疫的影响，所有被测的天然产物都表现出对蜜蜂健康有益的方面，其中百里酚、地黄梓醇和尼古丁显著降低了蜜蜂D W V 的感染水平，上调了Im d 和Toll通路调控的抗菌肽基因表达，增强了蜜蜂免疫。Parekh 等人[29]后续在实验室条件下也证明了百里酚能够降低D W V 丰度，上调与免疫相关的关键R N A i基因、抗菌肽基因、卵黄蛋白原基因的表达，同时在一定程度上缓解了烟曲霉素和新烟碱农药对蜂群的负面作用。苦杏仁苷是存在于许多植物中的一种氰苷，水解后产生的氢氰酸毒性可致人或动物死亡，但蜜蜂对杏仁苷有较高的耐受性[30,31]，且摄入杏仁苷的蜜蜂在不影响其他微生物和群体免疫基因表达的情况下还能降低D W V 的病毒滴度[32]。Stam ets等人[33]观察到蜜蜂采食野生菌菇的现象，结合真菌提取物的抗病毒活性[34-36]，通过实验发现蜜蜂摄入某些多孔菌菇提取物对D W V 具有抑制作用。

对D W V 的防控除了直接针对病毒自身以外，还可以通过防治狄斯瓦螨间接减少病毒载量。含有高浓度百里酚的百里香精油被证明具有良好的杀螨活性[37]，以百里酚为主要成分的天然杀螨剂产品如A piLife V ar、Thym ovar 和A piguard 等已被证明在生产实践中具有较好的防控效果，可显著降低蜂群内成年工蜂的瓦螨感染率[38-44]。

3.2 囊状幼虫病毒（S B V）

SBV 是首个发现的蜜蜂病毒，20 世纪30～40 年代在西方蜜蜂蜂群中爆发流行，造成了严重的经济损失，但现在西方蜜蜂已进化出对SBV 较强的抗性，很少引起疾病或蜂群损失。1972 年首例SBV 感染中蜂在广东被报道[45]，此后逐渐成为中蜂的主要致病病原。感染SBV的幼虫包被特征性的液体囊袋，无法化蛹，封盖后死亡率大大增加[46]。成蜂感染SBV 后采集能力下降或丧失，寿命缩短，对低温更加敏感。春、秋季节是囊状幼虫病发生的高峰期，被污染的蜂蜜、花粉饲料和携带病毒的个体是主要传染源[47]。

中草药治疗是我国中蜂养殖业中对抗SBV的常用方法。具有清热解毒功效的中草药在民间应用广泛，邓位喜等人[48]搜集了民间用于SBV 防治的中草药组方并加以改进，筛选出包括贯众、虎杖、千里光、金银花、半枝莲、地锦草、一枝黄花、板蓝根等的中草药复方“中囊消”组方。孙丽萍等人[49]进一步证明了板蓝根提取物可以抑制SBV 复制，调节蜜蜂免疫应答，提高感染SBV 蜜蜂的存活率。Jovanovic等人[50]认为给蜜蜂喂食富含复合维生素B 的植物补充剂能够减少SBV 病毒负荷，改善蜜蜂健康，提高蜂群的生产性能。

3.3 黑蜂王台病毒（B Q C V）

BQ CV 最初从死亡的蜂王幼虫和封盖王台的预蛹中分离而来[51,52]。虽然BQ CV 在蜂群中传播广泛，但对普通工蜂和雄蜂没有太大影响[53]，主要对王台中的幼虫产生危害。感染BQ CV 的蜂王在发育过程中死亡，形成一个类似于囊状幼虫病的硬质囊，其坏死的残余物将王台内壁染成黑色。BQ CV 主要通过蜂王产卵或蜜蜂交哺行为进行传播，感染的主要部位是蜜蜂的肠道或蜂王卵巢[14]，因此BQ CV 与蜜蜂肠道真菌寄生虫微孢子虫共同感染时会产生极强的致病性[54]，亚致死剂量的农药也会导致BQ CV 滴度和死亡率增加[55,56]。

由于BQ CV 主要危害蜂王，而蜂王又在蜂群中处于独特地位，有关天然产物对BQ CV 或蜂王直接作用的研究较少，更多的研究集中在与其高度关联的微孢子虫防控上，目前市面上已经有较多此类天然产物补充剂产品，如以大蒜和肉桂提取物为主要成分的A piH erb○R[57]、富含芦丁、槲皮素和桉叶脑的Protofil○R[58]等。Chaim anee[59]和O zk1r1m[60]等人分别研究了番荔枝、罗勒、番石榴、蒲桃和小酸模、西洋蓍草、车前草、丹参、百里香、迷迭香、月桂等植物提取物对微孢子虫的药效，结果表明这些物质的效果均与烟曲霉素相似甚至更优。A urori等人[61]试验中单独证明了月桂叶提取物在不影响卵黄蛋白原基因表达的情况下可以抑制工蜂体内BQ CV 的复制。

3.4 以色列急性麻痹病毒（IA P V）

IA PV 属双顺反子病毒科（D icistroviridae）病毒[62]，发病症状与A BPV 相似，表现为染病的成年工蜂体色变暗，绒毛脱落，伴随翅震颤麻痹症状，失去飞行能力，离巢后快速死亡。IA PV 的生物学特性和序列同源性与A BPV 和K BV 非常相近[63,64]。IA PV 于2004 年才在以色列被发现[65]，但因其在崩溃失调症（Colony Collapse D isorder，CCD） 蜂群中的流行，一经发现就引起广泛关注。CCD 蜂群的典型特征是成年工蜂短时间内突然消失，蜂巢内外找不到蜜蜂尸体，蜂巢中仅剩下蜂王、卵、幼虫和少量新出房工蜂[66]。CCD 爆发期间，美国约有23% 的蜂场受其影响，导致了近50% 的授粉服务和蜂产品损失[67]。宏基因组学数据显示IA PV 与CCD 蜂群之间的相关性高于其他可能的病原体，IA PV 序列在CCD 蜂群中的普遍存在，以及二者在时间和地理上的重叠都表明IA PV 与CCD 有密切相关性[68]，但IA PV 与CCD 的因果关系没有得到广泛认同。

H sieh 等人发现感染IA PV 的蜜蜂摄入1.5×10-5（植物源常见的自然浓度） 的咖啡因可以显著提高其存活率[69]。咖啡因是分布最广泛的植物次生代谢物之一[70,71]，蜜蜂在实验室里对含有咖啡因的蔗糖溶液表现出偏好性[72,73]，摄入咖啡因有助于提高蜜蜂对新事物的认知能力，巩固已习得的嗅觉记忆[74-76]，缓解新烟碱类杀虫剂诱导的氧化应激[77]。野外条件下受咖啡因刺激的蜜蜂舞蹈频率增加，极大地提高觅食效率[78]。对香豆酸可以特异性上调蜜蜂p450家族基因[79]和抗菌肽基因[80]的表达，触发解毒机制，调节免疫功能[81]。虽然在H sieh 等的试验中对香豆酸没有表现出对IA PV 显著的作用效果[69]，但先前的研究表明对香豆酸能够抑制人类鼻病毒rhinovirus 的复制[82]，该病毒和IA PV 一样同属小核糖核酸病毒目，因此对香豆酸仍是未来防治IA PV 的潜力物质。由于瓦螨也是IA PV 的病毒载体，因此对瓦螨具有防治作用的物质在生产实践中也可应用于IA PV的防控。

4 小结与展望

综上所述，天然产物在蜂群几种主要病毒病防控中表现出了很好的应用潜力。但由于病毒结构复杂、变异迅速，天然产物种类繁多，二者产生的抗性机制、生理益处等作用原理尚不完全清楚。因此仍需要漫长的研究过程，未来有潜力的研究方向可能在以下方面。首先，病毒感染对蜜蜂觅食行为的影响，尤其对可能有“疗效”植物产品的偏好性；其次，天然产物对蜜蜂病毒的作用机制和原理，参考人体和其他动物模型中天然产物的作用机制以及病毒结构的相似性进行推导和试验验证；第三，天然产物的组合应用，利用化合物间的拮抗与协同作用发挥天然产物的最佳效益；最后，完成实验室成果到田间试验再到生产实践的应用与推广。以上研究将极大地提高人们对“天然产物- 蜜蜂- 病毒”关系网络重要性的理解，维护蜂产品的质量安全与蜜蜂授粉服务，促进蜂产业的健康发展，对于人类健康和生态环境保护也具有重要意义。