烟草青枯病发病程度与土壤环境间的响应关系

白茂军, 高正锋, 张力元, 范成平, 潘首慧, 董延鑫, 杨 索, 王 莹, 陈 汶, 杨小龙, 岑 浩, 田玉琴, 昝建朋, 吴 海

(1.贵州省烟草公司安顺市公司,贵州 安顺 561000;2.云南农业大学,云南 昆明 650201;3.贵州中烟工业有限责任公司,贵州 贵阳 550009)

烟草是中国重要的经济作物,由于耕地土壤养分失衡,加上中国烟草难以实现轮作与休耕,导致土传病害频发[1-2]。其中,青枯病是烟草主要的细菌性土传病害之一,病原菌入侵植株后,会破坏维管束组织,从而造成烟草枯萎,因此青枯病是烟草生产上的一大毁灭性病害,造成的损失较大[2-3]。目前,种植抗性品种[4]、化学防治[5-6]、生物防治[7]、烟田轮作[8-9]等是防治烟草青枯病的主要方式,但在病害发生时,化学防治可能会导致病原菌抗药性增强并造成环境污染,而生物防治效果不稳定,在复种指数高的烟田上只依靠农业防治措施的效果也十分有限。因此,通过探究发病程度与土壤微环境间的关系来筛选预防青枯病的原生微生物用于防治青枯病是必不可少的。有研究发现,土壤理化性质等对烟草青枯病发生的影响较大[10-12]。还有研究发现,提高土壤pH值及增加土壤有机质、钾含量等可提高烟株对青枯病的抗性[13]。此外,植株根际中土壤微生物数量及群落结构的变化也会影响病害的发生。如樊俊等[14]研究发现,根瘤菌属、鞘氨醇单胞菌属细菌的操作分类单元(Operational taxonomic unit,OTU)数量是导致烟草青枯病发生的重要因素。同时,在青枯病发生过程中,健康烟株根际中土壤细菌拟杆菌门(Bacteroidetes)、放线菌门(Actinobacteria)细菌的相对丰度均大于发病烟株根际中土壤相应微生物的相对丰度,而在根际土壤真菌中,发病程度较轻的烟株根际土壤真菌群落的α多样性更高[15]。在青枯病发病过程中,致病微生物[雷尔氏菌属(Ralstonia)细菌等]和有益微生物[芽单胞菌属(Gemmatimonas)、鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)、假单胞菌属(Pseudomonas)细菌等]的相对丰度明显升高[16]。然而,根际不仅是病原菌侵染的场所,也是有益微生物和病原菌相互作用的场所[17]。但是,目前通过发病程度与土壤微环境间的关系来筛选防治青枯病原生微生物的报道较少,因此本研究拟通过田间调查,收集烟草青枯病不同发病程度的根际土壤,测定根际土壤酶活性及理化性质,分析细菌、真菌的群落结构,以期探究根际土壤环境因子与发病程度间的关系,并筛选出致病微生物及关键土壤因子。

1 材料与方法

1.1 试验地概况

土壤取样地位于贵州省安顺市紫云县大田坝村,地理坐标106°18′19″E,25°34′40″N,海拔1 044 m。取样区域为同一地块且肥力均匀、地块平整,土壤质地为沙质土,种植的烟草品种为云烟87。

试验地的基础理化性质:pH值5.21,有机质含量24.28 g/kg,全氮含量1.42 g/kg,碱解氮含量162.74 mg/kg,硝态氮含量19.18 mg/kg,铵态氮含量9.74 mg/kg,全磷含量0.03%,速效磷含量3.33 mg/kg,全钾含量0.15%,速效钾含量54.08 mg/kg。

1.2 青枯病的分级处理

参照GB/T 23222-2008《烟草病虫害分级及调查方法》中病虫害的分级及调查方法[18],以株为单位调查各烟株青枯病的发病等级。0级:全株无病,烟株正常生长,记为0;1级:茎部偶有褪绿斑,或在有条斑一侧有少数叶片凋萎,记为1;5级:茎部黑色条斑到达顶部,或病侧2/3以上叶片凋萎,记为5;7级:病株基本枯死,记为7。

1.3 样品的采集与制备

通过系统调查并确定青枯病发病地块后,于烟株旺长期在田间对不同青枯病发病等级的烟株根际土壤进行取样,按照青枯病发病等级,相同病级取3株以上烟草,采用抖根法收集根系周围0～2 mm根际土壤,充分混匀后装袋,一部分放于-80 ℃冰箱中保存,用于提取土壤DNA,另一部分储存在4 ℃冰箱中,用于测定土壤酶活性、土壤养分含量。

1.4 土壤理化性状、酶活性的测定

1.5 土壤微生物的测定

用HiPure Soil DNA Kits提取土壤中的DNA;通过NanoDrop微量分光光度计、琼脂糖凝胶电泳检测DNA的纯度和完整性,将纯化的PCR产物进行文库构建。经过Qubit和Q-PCR验证文库合格后,使用NovaSeq6000对DNA文库进行测序。测序数据通过Qiime V1.9.1去除平均质量分数低(Q<20)和长度短(<100 bp)的低质量序列,得到最终的有效数据(Effective tags)。使用Usearch软件进行聚类,去除聚类过程中检测到的嵌合体,获得OTU的丰度和OTU代表序列。基于OTU的序列、丰度数据,开展物种注释、物种组成分析、Alpha多样性分析、Beta多样性分析、相关性分析等。

1.6 数据处理

用Excel 2010进行数据处理,用SPSS 25.0进行方差分析和多重比较(Duncan’s新复极差法),显著性水平为0.05,用R语言进行图形绘制。

2 结果与分析

2.1 烟株根际土壤理化性状

由表1可以看出,不同青枯病发病程度的烟株根际土壤理化性状存在显著差异。青枯病发病烟株根际土壤的有机质、总氮、碱解氮、硝态氮、速效磷和速效钾含量均高于未发病烟株根际土壤。在发病烟株根际土壤中,随着烟株发病程度的加重(病级由1级升至7级),pH值、有机质含量、总氮含量、铵态氮含量降低,硝态氮含量升高。

表1 不同发病程度烟株根际土壤理化性状

2.2 烟株根际土壤酶活性

病害的发生会影响根际土壤酶活性,具体表现为根际土壤中蔗糖酶、过氧化氢酶活性随发病程度的加重呈下降趋势。由图1可以看出,青枯病5级烟株根际土壤的蔗糖酶活性显著低于不发病、青枯病1级烟株根际土壤,过氧化氢酶活性以青枯病1级烟株根际土壤最高,但是各等级病害间的差异未达到显著水平。以上结果表明,病害的严重程度与土壤酶活性有关,且与蔗糖酶活性间的关系较密切。

不同处理间标有不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。

2.3 青枯病不同发病程度根际土壤微生物群落多样性

2.3.1 微生物α多样性变化 由表2可以看出,各处理的覆盖度均大于97%。土壤中细菌与真菌多样性对病害发生的响应不同。在真菌中,随着发病程度的加重,Shannon指数、Simpson指数、Chao1指数和Ace指数均在青枯病1级时最高,且只有Chao1指数、Ace指数显著高于其他病级,其余均未达到显著差异(t-test检验和wilcox秩和检验)。在细菌中,各指数也是青枯病1级时最高,但各病级间的差异均未达到显著水平。

表2 青枯病不同发病程度下根际土壤真菌、细菌群落α多样性的变化

2.3.2 不同发病程度对土壤微生物β多样性的影响 由图2可以看出,在不同发病程度下,土壤真菌及细菌群落β多样性有一定差异。主坐标分析(Principal co-ordinates analysis,PCoA)图给出了基于Anosim相似性分析计算出的r值,r值越接近1,说明组间差异越大于组内差异。真菌和细菌中PCoA的结果均有显著差异(P<0.05)。在PCo1轴上,随发病程度的增加,真菌群落逐渐分离,但正常土壤与青枯病7级烟株根际土壤有部分重合(图2A),表明青枯病7级烟株根际土壤真菌群落与正常土壤相似。在PCo1轴上,正常土壤细菌群落与发病土壤能显著分开,而青枯病5级烟株根际土壤和青枯病7级烟株根际土壤未能明显分开(图2B),表明正常土壤与发病土壤间存在差异,青枯病5级、7级烟株根际土壤细菌群落结构较为相似。

A:不同发病程度对真菌群落β多样性的影响;B:不同发病程度对细菌群落β多样性的影响。D0:全株无病;D1:青枯病1级;D5:青枯病5级;D7:青枯病7级;PCo1:第一主成分;PCo2:第二主成分。

2.3.3 不同发病程度青枯病烟株根际土壤微生物属水平的差异 发病程度对根际土壤微生物群落相对丰度有一定影响(图3)。随着烟株发病程度的增加,真菌群落中被孢霉菌(Mortierella)、球托霉属(Gongronella)菌的相对丰度呈此消彼长的态势,与正常土壤相比,发病烟株根际土壤中镰刀菌属(Fusarium)菌、柱孢霉菌属(Cylindrocarpon)菌的相对丰度提高,毛霉属(Mucor)菌相对丰度有降低趋势。随着烟株发病程度的加重,肠杆菌属(Enterobacter)菌在青枯病5级、7级烟株根际土壤中的相对丰度高于正常土壤,鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)菌相对丰度在青枯病1级烟株根际土壤中较高,不动杆菌属(Acinetobacter)菌只出现在发病烟株根际土壤中,产黄杆菌属(Rhodanobacter)菌相对丰度随着烟株发病程度加重而逐渐增加。

对相对丰度排名前7的细菌、真菌属进行差异性分析(Duncan’s新复极差法),详见表3。真菌群落中被孢霉菌(Mortierella)、球托霉属(Gongronella)菌、毛霉属(Mucor)菌,细菌群落中鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)菌相对丰度的变化达到显著水平。结合指示物种分析,推测出与青枯病发病相关的差异物种,结果见图4。

D0:全株无病;D1:青枯病1级;D5:青枯病5级;D7:青枯病7级。图A中,Chaetothyriales:刺盾炱目;Plectosphaerellaceae:小不整球壳科;Glomerellales:小丛壳目;Cylindrocarpon:柱孢霉菌属; Microascaceae:小囊菌科;Microascales:小子囊菌目;Staphylotrichum:圆孢霉属;Sordariales_fam_Incertae_sedis:未中文命名;Mucor:毛霉属;Mucoraceae:毛霉科;Umbelopsis:伞状霉属;Umbelopsidaceae:伞枝泡囊霉科;Umbelopsidales:伞形霉目;Umbelopsidomycetes:伞形霉纲。图B中,Blastocatellaceae:酸杆菌科;Blastocatellales:酸杆菌目;RB41:未中文命名;Pyrinomonadaceae:未中文命名;Pyrinomonadales:未中文命名;Blastocatellia_Subgroup_4:未中文命名;Subgroup 6:未中文命名;Intrasporangiaceae:间孢囊菌科;Streptomycetaceae:链霉菌科;Streptomycetales:链霉菌目;Flavisolibacter:未中文命名;Lactococcus:乳球菌属;Streptococcaceae:链球菌科;Lactobacillales:乳杆菌目;Parcubacteria:未中文命名;Allorhizobium_ Neorhizobium_Pararhizobium_Rhizobium:未中文命名;Sphingomonas:鞘氨醇单胞菌属;Sphingomonadaceae:鞘酯单胞菌科;Sphingomonadales:鞘脂单胞菌目;Alphaproteobacteria:α-变形菌纲;Bordetella:波氏杆菌属;Burkholderia_Caballeronia_Paraburkholderia:未中文命名;Nitrosomonadaceae:亚硝化单胞菌科;SC_I_84:未中文命名;Lysobacter:溶杆菌属;Rokubacteriales:罗库菌属;NC10:未中文命名;Candidatus_Udaeobacter:未中文命名;Chthoniobacteraceae:未中文命名;Chthoniobacterales:未中文命名。

表3 不同烟草发病程度对烟株根际土壤微生物相对丰度的影响

2.3.4 不同发病程度烟株根际土壤中差异物种 为了获得不同发病程度烟株根际土壤细菌、真菌群落的主要差异物种,用LEFse软件进行lefse分析(LDA effect size),对OTU数据进行统计意义和生物差异分析。如图4所示,在属水平上,对于不同青枯病发病程度烟株根际土壤的真菌而言,伞状霉属(Umbelopsis)的LDA值较大,为正常土壤中的差异物种,青枯病1级烟株根际土壤中的圆孢霉属(Staphylotrichum)为差异物种,青枯病5级烟株根际土壤中的毛霉属(Mucor)为优势种群,青枯病7级烟株根际土壤中的柱孢霉菌属(Cylindrocarpon)为优势种群。图3A结果表明,发病烟株根际土壤中毛霉属(Mucor)菌的相对丰度高于正常土壤,说明毛霉属(Mucor)可能是不同青枯病发病程度烟株根际土壤真菌群落在属水平产生差异的主要物种。

细菌中,与发病烟株根际土壤相比,Allorhizobium_Neorhizobium_pararh属的LDA值高,为正常土壤中的差异物种,且随发病程度的加重,溶杆菌属(Lyesobacter)、RB41、Flarisolibacter和鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)(来自青枯病1级烟株根际土壤),乳球菌属(Lactococcus)(来自青枯病5级烟株根际土壤),波氏杆菌属(Bordetella)(来自青枯病7级烟株根际土壤)逐渐成为特异种群。由图3B可以看出,肠杆菌属(Enterobacter)菌在青枯病5级、7级烟株根际土壤中的相对丰度高于正常土壤;鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)菌在青枯病1级烟株根际土壤中的相对丰度较高,而后随着发病程度的加重逐渐下降,表明鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)可能是青枯病不同发病程度烟株根际土壤细菌群落在属水平产生差异的主要物种。

A:属水平真菌群落组成与土壤因子的冗余分析;B:属水平细菌群落组成与土壤因子的冗余分析。RDA1:排序轴1;RDA2:排序轴2;D0:全株无病;D1:青枯病1级;D5:青枯病5级;D7:青枯病7级;SOM:有机质;AK:速效钾;TN:总氮;AP:速效磷;:硝态氮;Mortierella:被孢霉属;Gongronella:球托霉属;Fusarium:镰刀菌属;Mucor:毛霉属;Cylindrocarpon:柱孢霉菌属;Bacillus:芽孢杆菌属;Acinetobacter:不动杆菌属;Sphingomonas:鞘氨醇单胞菌属;Rhodanobacter:产黄杆菌属;Enterobacter:肠杆菌属。

3 讨论

烟草青枯病的发生跟土壤养分供应水平、酸碱状况、酶活性和微生物等的相关性较大[19-20]。本研究结果表明,在烟株发生青枯病的根际土壤中,随着发病程度的加重,土壤pH值、有机质含量、总氮含量降低,硝态氮含量升高,原因可能是pH值的下降可促进土壤青枯雷尔氏菌(Ralstoniasolanacearum)相对丰度的提高[21],从而导致病害加重,而部分养分可通过增强烟株的抗逆性从而减少病害的发生[22]。何万泽[23]研究发现,加入有机肥可以提高植株抗病性,当有机氮施用量占施氮量的20%～30%时,烟草的抗病性最高。赵芳等[24]研究发现,适量的氮素水平可以提高烟株的抗性,进而使其抵御病害发生,这与本研究结果类似,发病土壤的有机质、总氮含量高于健康土壤,且随发病程度增加呈下降趋势,RDA结果还显示,有机质、氮是影响根际土壤微生物群落结构的关键因子。不同形态的氮素可以影响作物生长发育和根系形态结构,从而影响作物的抗病性[25],而硝态氮可以减少香蕉枯萎病[26]和大白菜斑点病的发生[27]。本研究结果显示,随着青枯病的发生,土壤中硝态氮含量逐步升高,但是RDA结果显示,硝态氮含量对随根际环境变化较大的微生物影响不大。本试验结果表明,随着青枯病发病程度的加重,蔗糖酶、过氧化氢酶活性先增后减,这与一些研究者如史普酉等[28-30]对不同作物的研究结果类似,表明这2种酶对土传病害的相应规律具有普遍性。在烟株发病初期,酶活性出现小幅上升的原因可能是烟株为了抵抗逆境,通过改变根系分泌物等方式促使酶活性短暂升高。因此,土壤养分含量、酶活性与青枯病的发生密切相关。

土壤微生物在作物根际土壤微生态环境中发挥着重要作用,是影响植株发病的重要因素[31-32]。本研究发现,在发病土壤中,真菌群落镰刀菌属(Fusarium)、柱孢霉菌属(Cylindrocarpon)的相对丰度高于正常土壤,且随发病程度的加重,其相对丰度呈增加趋势,毛霉属(Mucor)、被孢霉菌(Mortierella)、球托霉属(Gongronella)相对丰度的变化达到显著差异,说明以上真菌可能与烟草青枯病发生有关。目前已有研究发现,镰刀菌属(Fusarium)、柱孢霉菌属(Cylindrocarpon)是潜在的致病性真菌群落[31-32],镰刀菌属(Fusarium)真菌是一类重要的寄生性植物病原真菌,可侵染大多数植物并引起毁灭性病害[33],柱孢霉菌属(Cylindrocarpon)是一类能引发多种植物(包括人参、三七等)根腐病的常见土壤真菌[34-35],并且在发病土壤中检测出的柱孢霉菌属(Cylindrocarpon)为优势菌属,与关键土壤因子pH值、全氮含量、有机质含量等呈负相关。因此推测,柱孢霉菌属菌丰度的增加可能是造成烟株发病的原因之一,而毛霉属(Mucor)是土壤中常见的有益真菌类群[36],在本研究中属于发病土壤中的优势菌群,可能是致病菌、寄主及环境的差异,导致其发挥不同作用。球托霉属(Gongronella)、被孢菌属(Mortierella)菌为有益菌[37-38],球托霉属(Gongronella)、被孢菌属(Mortierella)虽然不是特异物种,但是随着青枯病的发生,球托霉属(Gongronella)、被孢菌属(Mortierella)菌的相对丰度变化差异达到显著水平,这或许与青枯病发生有关。在细菌群落中,肠杆菌属(Enterobacter)在青枯病5级、7级烟株根际土壤中的相对丰度高于正常土壤,鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)在青枯病1级烟株根际土壤中的相对丰度较高,而后随着发病程度的增加逐渐下降,鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)菌是土壤中的有益微生物,它的减少可能导致致病微生物增加[39]。特异性物种分析结果表明,鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)为特异物种,且与pH值、全氮含量、有机质含量、速效钾含量呈正相关,与速效磷含量、硝态氮含量呈负相关。因此推测,土壤中鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)相对丰度的降低或许是青枯病发生的关键因素,具体影响机制还有待进一步探究。

4 结论

青枯病的发生降低了细菌、真菌的多样性,微生物群落中的柱孢霉菌属(Cylindrocarpon)的相对丰度增加,毛霉属(Mucor)、鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)的相对丰度降低是影响烟草青枯病严重发生的关键菌属。提高土壤全氮含量、有机质含量能有效降低烟草青枯病的发病程度。