基于网络药理学的健脾通络解毒方治疗慢性萎缩性胃炎作用机制研究Δ

罗 楠,李 萌,夏晨曦,田志华,陈丁铭,王少丽,刘 震#

(1.中国中医科学院广安门医院脾胃病科,北京 100053;2.北京中医药大学研究生院,北京 100029)

慢性萎缩性胃炎(chronic atrophic gastritis,CAG)指胃黏膜上皮受到反复损害,引起固有腺体变少的一种慢性胃部疾病,伴有或者不伴有肠腺化生、假幽门腺化生[1]。目前,现代医学干预CAG以对症治疗为主,如根除幽门螺杆菌(Hp),给予环氧化酶-2抑制剂、阿司匹林,补充维生素、叶酸等[2-3],尚缺乏特异性的治疗药物。检索文献发现,中医药在治疗CAG方面有明显的优势,能够减弱黏膜炎症反应、修复受损胃黏膜、抗Hp感染等,改善患者的临床症状[4]。研究结果显示,可采用化浊解毒和益气活血法等逆转CAG的肠上皮化生、异型增生,防止胃癌的发生[5]。健脾通络解毒方是首都国医名师、中国中医科学院广安门医院脾胃病科学术带头人姚乃礼教授以“脾虚络阻毒损”为基本病机,根据多年临床经验形成的专家经验方,重点通过补益脾胃、活血通络和解毒散结来辨证论治[6]。健脾通络解毒方组成为太子参、莪术、炒白术、茯苓、法半夏、丹参、三七粉、藤梨根和甘草。前期研究结果发现,该方根据证型加减能够有效改善患者的临床症状和胃黏膜相关状态,效果明显[7]。但作用机制尚不明确。中药对于疾病通常是多靶点、多途径进行作用,网络药理学可以建立成分-药物-靶点-疾病之间的联系,在一定程度上探求其作用机制。因此,本研究就健脾通络解毒方对CAG的作用机制进行网络药理学相关探讨。

1 资料与方法

1.1 健脾通络解毒方活性成分及靶点筛选

在中药系统药理学数据库与分析平台(TCMSP,http://tcmspw.com/tcmsp.php)上查询健脾通络解毒方组成药物的活性成分,以口服生物利用度(OB)≥30%、类药性(DL)≥0.18进行筛选,获取有效活性成分。在TCMSP中查询其对应靶蛋白,录入UniProt数据库(https://www.uniprot.org/),选定“Homo Sapiens”物种,查询对应基因,即为该方靶点。

1.2 CAG靶点筛选

以“chronic atrophic gastritis”作为关键词,从GeneCards数据库(https://www.genecards.org)、人类孟德尔遗传综合数据库(OMIM,https://www.omim.org)以及DrugBank数据库(https://www.drugbank.ca)中查询CAG有关基因,将所得全部基因合并,去除重复后即为CAG靶点。

1.3 药物-疾病共同靶点的获取

将CAG与健脾通络解毒方靶点相交,得到共同靶点。

1.4 蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)网络的建立

将靶基因输入STRING数据库,获取健脾通络解毒方治疗CAG靶点的PPI网络,导入Cytoscape 3.7.2软件中,运用CytoNCA,以自由度、中介中心性、紧密度、特征向量中心性和局部边连通性为参数,对节点进行打分,以连续2次>参数中位值作为筛选标准,筛选出健脾通络解毒方治疗CAG的靶点。

1.5 药物-活性成分-作用靶点-疾病网络图的建立

采用Cytoscape 3.7.2软件,建立健脾通络解毒方药物-活性成分-作用靶点-疾病网络图。以度值作为主要参考依据进行拓扑分析,评估活性成分和作用靶点的重要性。

1.6 基因本体(GO)功能富集分析和京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路富集分析

运用R软件和Bioconductor平台(https://www.bioconductor.org/)进行GO和KEGG分析,筛选排序靠前的生物过程和信号通路等。

1.7 分子对接

利用PubChem,下载筛选得到的核心蛋白及活性成分的SDF结构文件,导入Chem3D,调整空间构象,进行能量优化并存为mol2格式;通过PDB(http://www.rcsb.org/)下载核心蛋白的受体文件;导入AutodockTools软件,进行去水、加氢,输出为PDBQT文件,运用AutoDockVina来实现分子对接,得到最小结合能,在PyMOL中实现可视化。

2 结果

2.1 健脾通络解毒方的活性成分及靶点

在TCMSP数据库中以相应条件筛选,获取健脾通络解毒方所含药物的活性化学成分后并去重,得到有效成分共206个,靶点232个。

2.2 CAG相关疾病靶点

在GeneCards、OMIM和DrugBank数据库查询相关基因,分别得到683、88和19个CAG相关基因,合并去重后,得到CAG相关靶点783个。

2.3 药物-疾病共同靶点的获取

将健脾通络解毒方活性成分的靶点与CAG靶点取交集,共得到健脾通络解毒方治疗CAG的作用靶点91个。

2.4 PPI网络的建立

PPI网络图共有91个节点,1 952条边,见图1。利用CytoNCA功能筛选关键靶点,包括肿瘤蛋白p53(TP53)、蛋白激酶B1(Akt1)、Jun原癌基因(JUN)、白细胞介素6(IL-6)、血管内皮生长因子A(VEGFA)、肿瘤坏死因子(TNF)、信号传导与转录激活因子3(STAT3)、前列腺素内过氧化物合酶2(PTGS2)、胱天蛋白酶3(CASP3)、白细胞介素1β(IL-1β)、缺氧诱导因子-1(HIF1A)和表皮生长因子(EGF)。

2.5 健脾通络解毒方药物-活性成分-作用靶点-疾病网络图

健脾通络解毒方药物-活性成分-作用靶点-疾病网络图见图2。根据筛选,度值排序居前5位的活性成分为槲皮素、木樨草素、β-谷甾醇、山柰酚和黄芩素,说明上述成分可能是该方对CAG起治疗作用的主要活性成分。

2.6 GO功能富集分析和KEGG通路富集分析

(1)通过GO功能富集分析得到显著富集功能,分析结果表明,生物过程2 024个,细胞组成34个,分子功能120个。其中生物过程主要涉及外源性凋亡信号通路、活性氧的代谢过程和细胞对氧化应激的反应等;细胞组成主要涉及外膜、细胞器外膜和胞质囊腔等;分子功能主要涉及酶结合、转录因子、细胞因子活性以及蛋白连接酶结合等,见图3。(2)KEGG分析结果显示,主要信号通路包含脂质和动脉粥样硬化、乙型肝炎、流体剪切应力和动脉粥样硬化、晚期糖基化终末产物(AGE)-AGE受体(RAGE)信号通路在糖尿病并发症中的作用、磷脂酰肌醇3激酶-Akt(PI3K-Akt)、丝裂原激活的蛋白激酶(MAPK)、IL-17、TNF、前列腺癌、细胞凋亡、核因子κB(NF-κB)、肿瘤蛋白53(p53)、Janus酪氨酸蛋白激酶-信号转导与转录激活因子(JAK-STAT)以及T细胞受体等信号通路,说明健脾通络解毒方在治疗CAG方面可能是通过上述通路发挥作用,选取富集程度前60条,见图4。

图4 KEGG通路富集分析

A.槲皮素与TP53蛋白结合;B.槲皮素与Akt1蛋白结合;C.槲皮素与JUN蛋白结合;D.槲皮素与IL-6蛋白结合;E.槲皮素与VEGFA蛋白结合;F.槲皮素与TNF蛋白结合。

2.7 分子对接结果

选取度值最高的5种成分与前6个关键靶点来进行对接,结果见表1。结合能<-20.92 kJ/mol说明结合能力比较好[8]。由表1可知,以上对接的最低结合能均<-20.92 kJ/mol,表明核心活性成分与关键靶点之间有良好的结合力,对接稳定。选取槲皮素与TP53、Akt1等6个靶点进行分子对接展示,见图5。

表1 分子对接结果

3 讨论

本研究结果显示,筛选得到健脾通络解毒方活性成分206个,靶点232个,CAG相关靶点783个,交集靶点91个,健脾通络解毒方治疗CAG的关键化合物有槲皮素、木樨草素、β-谷甾醇、山柰酚和黄芩素等,核心基因涉及TP53、Akt1、JUN、IL-6、VEGFA、TNF、STAT3、PTGS2、CASP3、IL-1β、HIF1A和EGF。TP53是人体的一个重要抑癌基因[9],其所编码的p53的激活能够通过促进DNA的修复、细胞周期停顿或凋亡,进而防止恶性肿瘤发展[10],在CAG进展中发挥作用。Akt1在胃癌癌变进展中的作用不可忽视,能够影响胃癌的发生、发展[11]。Akt信号通路可以通过控制炎症细胞因子、吞噬功能和小分子核糖核酸(miRNAs)起到相应的作用[12]。PI3K-Akt-NF-κB信号级联反应在肿瘤的发生、发展中至关重要[13]。VEGFA是一种刺激因子,能促进肿瘤细胞生长,在血管生成过程中生成肿瘤性血管。VEGFA mRNA与肿瘤的侵袭性、血管密度、转移、复发和不良预后相关,在大多数患者的肿瘤中都有过表达[14]。有研究结果发现,与癌旁非肿瘤组织相比,VEGFA的表达在胃癌相关组织内更高[15]。IL-6能够参与炎症和刺激作用,炎症以及细胞因子环境十分复杂,能够在一定程度上促使肿瘤的转化,使胃癌发生风险大大升高[16]。IL-6和IL-1β水平在“正常→慢性非萎缩性胃炎→CAG→胃癌前病变”过程中逐渐升高,一定程度上可以用来评估胃黏膜损伤程度[17]。TNF家族可引起细胞凋亡,过量的TNF-α能够增强微血管壁的通透性,破坏细胞,释放炎症递质[18]。IL-6、IL-1β和TNF-α共同介导炎症反应的发生、发展,有研究结果发现,IL-6、IL-1β和TNF-α在CAG状态下比正常状态下表达升高[19]。STAT3能够在生理过程中起作用,除了调控增殖分化等肿瘤的生理功能,还可以促进血管的生成和转移等[20]。PTGS2在细胞中可被促炎细胞因子、肿瘤诱导剂等诱导,产生前列腺素E2,在肿瘤发生、发展中起到一定作用[21]。有研究结果显示,CASP3、CASP9等蛋白所参与调控的凋亡通路可调控肿瘤细胞的凋亡,抑制肿瘤细胞增长[22]。

GO功能富集分析结果表明,生物过程主要包括外源性凋亡信号通路、活性氧的代谢过程和细胞对氧化应激的反应等方面;细胞组成主要涉及外膜、细胞器外膜和胞质囊腔等方面;分子功能主要涉及酶结合、转录因子、细胞因子活性和蛋白连接酶结合等多个方面。KEGG富集通路结果显示,与CAG相关的通路有很多,包含细胞凋亡、细胞因子等。在细胞凋亡方面,有p53、PI3K/Akt和MAPK信号通路。槲皮素可以抑制多种肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭[23],能够通过激活p53-AMPK-mTOR信号通路来抑制胃癌细胞增殖,诱导胃癌细胞凋亡[24]。有研究结果表明,抗菌肽LL-37可能通过激活p53,上调p53 mRNA和蛋白,诱导胃癌细胞凋亡[25]。PI3K-Akt信号通路失调的发生范围很广,除了在糖尿病等疾病中发生,在肿瘤中也会发生。PI3K-Akt信号通路和MAPK信号通路可与Smad信号通路等相互作用,促进胃部恶性肿瘤上皮间充质转化的形成[26]。郑雪[27]的研究结果发现,调控CAG大鼠PTEN-PI3K-Akt信号通路可以在一定程度上控制胃黏膜损伤。MAPK信号通路与癌症生物学密切相关[28],如猕猴桃多糖ACPS通过激活p38 MAPK通路来诱导细胞凋亡[29]。

细胞因子方面,NF-κB通过多种关键的细胞内反馈机制控制炎症和免疫激活[30]。JAK-STAT信号通路在细胞生理调节中起作用,但异常活化时可引起胃癌、肠癌等消化系统肿瘤[31]。有研究结果发现,胃癌能够通过JAK/STAT通路作用,其发生、发展与STAT3、STAT5失调有关[32]。TNF-α是一种重要的细胞因子,适量时具备一定的抗肿瘤作用,过量时则会破坏细胞,对黏膜造成影响,在胃黏膜炎症发生中的影响十分显著[33]。此外,AGE-RAGE信号通路在胃癌的发展中在一定程度上发挥着相关作用[34]。

综上所述,健脾通络解毒方通过TP53、Akt1、JUN、IL-6、VEGFA、TNF、STAT3、PTGS2、CASP3、IL-1β、HIF1A和EGF等多个靶点,PI3K-Akt、MAPK、p53和JAK-STAT等多个信号通路来治疗CAG,其作用机制可能与调节细胞凋亡、抗炎等相关。本研究为健脾通络解毒方在临床应用方面提供了相关参考。未来将设计进一步的动物实验,以验证网络药理学研究结果,更深入地探讨该方的作用机制。