氯盐胁迫下施氮对西瓜生理特性和氮素吸收利用的影响*

王西娜 ,柳 雪 ,李雪芳 ,王湘银 ,赵伟杰 ,孙晶晶 ,谭军利

(1. 宁夏大学农学院 银川 750021;2. 宁夏大学土木与水利工程学院 银川 750021)

西瓜(Citrullus lanatus)是宁夏的主要经济作物之一,由于当地干旱少雨,种植中农民长期使用含氯30 mmol·L-1左右的地下微咸水进行补灌[1],长期灌溉引起的盐分累积可能成为限制生产力的主要因素,导致忌氯作物西瓜产生氯盐毒害现象,使西瓜产量和品质下降。盐胁迫是限制作物生产力最普遍的非生物胁迫之一,土壤盐胁迫对植物的不利影响包括渗透胁迫、离子毒害及氧化应激和营养紊乱等次生胁迫[2]。首先,高盐环境会破坏离子稳态,影响细胞中的K+、Na+分布[3],同时由于高Na+和高Cl-影响,硝酸还原酶(NR)活性降低,植物氮吸收减少,氮素利用效率降低。其次,在盐胁迫下活性氧(ROS)大量累积,造成细胞膜氧化损伤。ROS 作为生物和非生物胁迫下细胞损伤的主要来源,植物已发展出各种保护机制来消除或减少ROS[4],包括抗氧化酶的诱导、离子运输和分隔、有机溶质合成和积累。氮素是植物生长所必需的大量营养元素,施用氮肥可在一定程度上缓解盐毒害作用。因此,研究氯盐胁迫下不同氮用量对西瓜生长生理的影响,对于氯盐胁迫下合理施用氮肥和西瓜氯毒害调控具有重要意义。氮素积极参与酶活性调节、光合作用、蛋白质合成、抗氧化剂和渗透液代谢[5],被认为是缓解盐胁迫,改善植物生长的最有效方式之一。已有研究报道盐胁迫下添加氮素营养可以提高植物耐盐性。隋利等[6]指出,NH4+-N∶NO3--N=25∶75 时,比全铵态氮、全硝态氮和全酰胺态氮更有利于减轻盐胁迫对紫苏[Perillafrutescens(L.) Britt]的生长抑制,促进生物量增加,维持抗氧化酶、氮代谢酶活性。贾向阳等[7]发现,叶面喷施一氧化氮可增加红砂[Reaumuria song-arica(Pall.) Maxim]可溶性蛋白和硝态氮含量。张艳艳等[8]指出,NO 可促进玉米(Zea maysL.)根系对K+的吸收运输,提高植株体内K+/Na+值;田甜等[9]研究指出,所供应氮肥的缓解效果与其供应的浓度有关,适量施氮可以缓解盐分对油菜(Brassica napusL.)的毒害,而过量施氮则会加重盐分对油菜的负面影响,抑制油菜体内渗透调节物质积累。可见,氮素可通过多种途径调控和缓解盐胁迫对植物生长的抑制作用。施氮作为农业生产中减轻多种非生物胁迫的方法之一,目前的研究多关注于盐胁迫或施氮对植物的单独效应,而对于添加氮素对盐胁迫调节作用研究较少。本研究通过土培试验,研究氯盐胁迫下不同氮水平对西瓜生理抗性和氮素吸收利用的影响,以期揭示氮素调节西瓜盐胁迫的机制,为调控西瓜氯盐毒害提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试作物为西瓜,以当地普遍使用的嫁接苗为试验材料,接穗西瓜品种为‘金城5 号’,砧木为‘金城雪峰’白籽南瓜[Cucurbita moschata(Duchesne ex Lam.)Duchesne ex Poir.]。供试土壤为灌淤土,基本化学性质见表1。

表1 供试土壤化学性质Table 1 Soil basic physical and chemical properties

1.2 试验设计

土培试验于2022 年5 月在宁夏大学农科实训基地日光温室中进行。根据本课题组前期的研究结果,当土壤Cl-含量达到156.82 mg·kg-1时,西瓜生长受到明显抑制[10],因此,本试验以160 mg(Cl-)·kg-1(烘干土)为氯胁迫浓度。在此基础上,设置5 个氮水平(以烘干土计),分别为0 g·kg-1、0.10 g·kg-1、0.15 g·kg-1、0.20 g·kg-1、0.25 g·kg-1,每个处理设置3 个重复。采用盆栽试验,试验用盆为聚乙烯塑料盆,直径31 cm,高21 cm,每盆栽3 株大小一致的西瓜苗,每隔7 d 浇灌1 L 去离子水,及时除虫除草。

施肥: 氮源为尿素(含N46%),磷肥选用重过磷酸钙(含P2O512%),用量0.10 g(P2O5)·kg-1(烘干土),钾肥选用KCl (含K2O 60%),用量0.05 g(K2O)·kg-1(烘干土),均在移栽前与土壤混匀施入。每盆装土7 kg,其中土壤中含Cl-0.06 g·kg-1,施入的KCl 中含Cl-0.28 g,还需再用水灌入0.41 g Cl-(以11.23 mmol·L-1Cl-分两次灌入,每次灌水1 L)才能将土壤Cl-含量调至胁迫浓度。氯源用CaCl2和NaCl,按当地微咸水中含量以5∶7 施入。施入的总NaCl 浓度为10.74 mmol·L-1,该浓度并不会对西瓜造成钠胁迫[11],但会对植物产生氯胁迫,因为植物对Cl-比对Na+更敏感[12]。

1.3 样品采集与测定方法

西瓜幼苗土培43 d 后,每个处理取3 盆,共取9株西瓜幼苗。然后,取其中3 株(每盆1 株)用来测定生物量和养分含量。生物量测定时将根、茎、叶分开,擦洗干净之后,称鲜重,然后在105 ℃杀青30 min,后75 ℃烘干,称量干重;烘干的样品用研钵磨细,用来测定Na+、K+、Cl-、N 等养分含量,其中Na+和K+含量用火焰光度计法测定、Cl-含量用莫尔法测定、N 含量用凯氏蒸馏法测定。另6 株样品摘下所有叶片,混匀,分别采用硫代巴比妥酸法[13]测定丙二醛(MDA)含量,采用酸性茚三酮法[14]测定脯氨酸含量,采用蒽酮法[14]测定可溶性糖含量,采用氮蓝四唑(NBT)法[13]测定超氧化物歧化酶(SOD)活性,采用高锰酸钾滴定法[14]测定过氧化氢酶(CAT)活性,采用离体法[14]测定硝酸还原酶(NR)活性,并用紫外吸收法[14]分别测定根、茎、叶的硝酸根(NO3-)含量。

1.4 数据计算与处理

采用Microsoft Excel 2003 软件进行数据处理和作图,利用DPS 进行方差分析,Origin 2019 作图。

2 结果与分析

2.1 施氮对氯胁迫下西瓜幼苗生物量的影响

施氮显著影响氯胁迫下西瓜的鲜重和干物质累积(图1)。与不施氮处理相比,施氮0.15 g·kg-1和0.20 g·kg-1时,西瓜鲜重显著增加96.9%和73.9% (P＜0.05),干物质累积量增加29.0%和17.5%,施氮0.10 g·kg-1和0.25 g·kg-1处理的增加量不显著。经曲线拟合,鲜重和干物质累积与施氮量间均具有显著相关关系(P＜0.05),相关系数r分别为0.8440*和0.8817*,最高鲜重和干物质累积量时对应的施氮量均为0.15 g·kg-1。可见,适量施氮可增加盐胁迫下西瓜生物量累积,对缓解氯盐胁迫下西瓜生长抑制具有积极作用。

图1 氯胁迫下施氮水平对西瓜幼苗生物量的影响Fig.1 Effects of N rate on biomass of watermelon under chlorine stress

2.2 施氮对氯胁迫下西瓜幼苗叶片离子稳态的影响

2.2.1 Na+和K+

施氮会减少西瓜植株内Na+含量而增加K+的含量,从而降低Na+/K+值(表2)。施氮0.20 g·kg-1处理时,叶片、茎、根和整株的K+含量均为最高,分别比不施氮提高47.3%、62.3%%、112.1%和62.2% (P＜0.05)。施氮使整株Na+含量降低16.2%～31.4%,叶、茎、根中Na+含量在施氮0.15 g·kg-1时均较低,分别较不施氮处理显著降低48.2%、13.9%、34.7% (P＜0.05)。因此,Na+/K+值亦在施氮0.15 g·kg-1和0.20 g·kg-1时较低,整株Na+/K+值分别比不施氮处理的显著降低51.3%和54.3% (P＜0.05)。可见,适量施氮可通过降低植株体内Na+累积和提高K+吸收而降低氯盐胁迫下Na+/K+值,维持阳离子的稳定。

表2 氯胁迫下不同施氮水平对西瓜幼苗离子含量的影响Table 2 Ions contents of watermelon seedlings affected by N rate under chlorine stress

2.2.2 NO3-和Cl-

施氮增加西瓜各器官硝态氮含量,降低氯离子吸收和Cl-/NO3-值(表2)。西瓜叶、茎、根、整株的NO3-含量均以施氮0.20 g·kg-1处理最高,分别比不施氮处理显著增加36.5%、176.3%、182.5%、128.6%(P＜0.05);施氮0.15 g·kg-1处理下,根系和整株NO3-含量增加140.4%和62.9%;施氮0.10 g·kg-1下,根系NO3-含量增加121.5%;其他处理西瓜各器官中NO3-含量有增加趋势但差异不显著。氯盐胁迫下施氮可使根系和整株Cl-含量显著降低32.5%～49.2%和22.6%～36.3% (P＜0.05),0.15 g·kg-1和0.20 g·kg-1氮处理时叶、茎Cl-含量较不施氮处理显著降低44.6%和30.1%、22.7%和21.7% (P＜0.05);相比不施氮处理,整株Cl-/NO3-值显著降低46.0%～69.5%,根系Cl-/NO3-值显著降低58.7%～77.7%,叶片Cl-/NO3-值在0.15 g·kg-1氮处理时可显著降低58.3%,茎的Cl-/NO3-值在0.20 g·kg-1氮处理显著降低69.1% (P＜0.05)。表明适量氮素可以增加NO3-含量,抑制Cl-吸收累积,降低Cl-/NO3-值,缓解氯盐毒害导致的营养失衡。

2.3 施氮对氯胁迫下西瓜幼苗叶片有机渗透调节的影响

可溶性糖和脯氨酸累积有利于缓解植物盐害。经曲线拟合发现,施氮量与可溶性糖、脯氨酸间均呈先增加后降低的二次曲线关系(图2)。施氮量为0.10 g·kg-1和0.15 g·kg-1时,叶片可溶性糖含量较不施氮处理显著升高44.2%和75.6% (P＜0.05),施氮0.15 g·kg-1和0.20 g·kg-1时西瓜叶片脯氨酸含量较不施氮处理显著增加70.1%和59.8% (P＜0.05)。施氮量与可溶性糖、脯氨酸含量曲线的相关系数分别为0.8650 和0.9338,分别达显著水平(P＜0.05)和极显著水平(P＜0.01),最高可溶性糖和脯氨酸含量对应的施氮量均为0.14 g·kg-1。可见,适量施氮亦可增加氯盐胁迫下西瓜幼苗可溶性糖和脯氨酸含量,提高了渗透调节能力,从而缓解氯盐胁迫。

图2 氯胁迫下施氮水平对西瓜幼苗渗透调节物质含量的影响Fig.2 Effect of N rate on organic osmoregulation substances contents of watermelon seedlings under chlorine stress

2.4 施氮对氯胁迫下西瓜幼苗叶片抗氧化酶活性的影响

适量施氮可以显著提高西瓜叶片超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)活性(图3)。叶片SOD以施氮0.15 g·kg-1和0.20 g·kg-1处理时较高,比不施氮处理显著增加55.8%和54.9% (P＜0.05);叶片CAT活性以0.15 g·kg-1氮水平的最高,较不施氮处理显著上升54.8%。经曲线拟合发现,施氮量与SOD 和CAT活性间分别呈显著(P＜0.05)和极显著(P＜0.01)相关关系,相关系数分别为0.8920 和0.9448,SOD 和CAT活性达到最高时的施氮量分别为0.18 g·kg-1和0.14 g·kg-1。可见,氯盐胁迫下适量施氮能够增加抗氧化酶活性,提高西瓜耐盐性,缓解氯盐胁迫引起的生长抑制。

图3 氯胁迫下施氮水平对西瓜幼苗抗氧化酶(SOD: 超氧化物歧化酶;CAT: 过氧化氢酶)活性的影响Fig.3 Effect of N rate on antioxidant enzymes (SOD: superoxide dismutase;CAT: catalase) activities of watermelon seedlings under chlorine stress

2.5 施氮对氯胁迫下西瓜幼苗叶片丙二醛含量的影响

施氮可以降低氯盐胁迫下西瓜叶片丙二醛(MDA)含量(图4)。与不施氮相比,施氮0.10 g·kg-1、0.15 g·kg-1、0.20 g·kg-1时叶片MDA 含量显著降低33.0%、59.3%、42.8% (P＜0.05);施氮量与叶片MDA含量可拟合为二次曲线,相关系数r=0.9340,呈极显著相关关系(P＜0.01),当施氮量为0.14 g·kg-1时叶片MDA 含量最低。表明适量施氮能够减轻盐胁迫造成的氧化损伤。

图4 氯胁迫下施氮水平对西瓜幼苗丙二醛(MDA)含量的影响Fig.4 Effect of N rate on malondialdehyde (MDA) content of watermelon seedlings under chlorine stress

2.6 施氮对硝酸还原酶及氮素吸收利用的影响

施氮可以提高硝酸还原酶(NR)活性,增加西瓜根、茎、叶中氮累积量,促进氮吸收利用(表3)。施氮使西瓜植株总氮吸收累积量显著提高64.07%～157.71% (P＜0.05),叶片和根系氮累积分别增加1.04～2.60 倍和0.39～0.79 倍;与不施氮处理相比,在施氮0.15 g·kg-1和0.20 g·kg-1处理下,西瓜茎中氮累积量分别显著增加89.11%和79.88% (P＜0.05),NR 活性分别显著增加62.40%和78.71% (P＜0.05),氮吸收效率分别提高1.39 和1.43 倍;氮表观利用率以施氮0.15 g·kg-1处理时最高,比施氮0.25 g·kg-1处理的显著提高1.45 倍。可见,适量氮素可以增加氯盐胁迫下西瓜苗的NR 活性,促进氮素累积,提高氮吸收和利用效率,减缓氯盐毒害造成的养分亏缺。

表3 氯胁迫下不同施氮水平对西瓜幼苗氮吸收利用的影响Table 3 Effects of different N rates on N uptake and utilization of watermelon seedlings under chlorine stress

2.7 聚类分析和相关性

聚类分析表明(图5a),施氮0.15 g·kg-1和0.20 g·kg-1首先聚为一类,表现为两者的西瓜生长生理指标较为接近,然后依次与施氮0.10 g·kg-1和0.25 g·kg-1聚在一起,最终与0 g·kg-1并列到一起,表现为施氮0.15 g·kg-1处理的生物量与0 g·kg-1差异最明显。层次聚类分析发现,施氮0.15 g·kg-1和0.20 g·kg-1处理与0 g·kg-1处理相比,增加了抗氧化酶(SOD 和CAT)活性、有机渗透调节物质(脯氨酸和可溶性糖)含量,维持了离子稳态(Na+/K+和Cl-/NO3-较低),提高了西瓜生物量累积。各处理对西瓜生长改善情况表现为0.15 g·kg-1＞0.20 g·kg-1＞0.10 g·kg-1＞0.25 g·kg-1。

图5 氯胁迫下不同氮水平处理西瓜幼苗相关指标聚类分析热图和相关分析图Fig.5 Heat map and correlation analysis diagram among relative indexes of watermelon seedlings of different N rates under chlorine stress

相关分析表明(图5b),生物量和干物质均与脯氨酸和可溶性糖含量、SOD 和CAT 活性、NR 活性、氮累积、氮吸收利用呈正相关关系,与Na+/K+值、Cl-/NO3-值、MDA 含量呈负相关;Na+/K+值、Cl-/NO3-值与MDA 含量呈正相关关系,与其他指标呈负相关。说明施加适量氮素有助于提高西瓜渗透调节、抗氧化系统、离子稳态维持等,降低氧化损失,减缓氯盐对西瓜的毒害。

3 讨论

3.1 施氮对氯盐胁迫下西瓜离子稳态的影响

离子稳态是维持植物正常生长所需的基本细胞活动,盐胁迫扰乱了植物细胞离子稳态并减少了植物的新陈代谢[16]。Na+和Cl-参与植物新陈代谢,在较高浓度下,会引发离子毒性,导致Na+/K+平衡破坏,因此,维持植物细胞中Na+/K+的稳态对于正常细胞代谢至关重要[17],为维持细胞Na+/K+平衡,植物最大限度将Na+外排,并减少从根部吸收Na+[18],过量的Na+通过Na+/H+交换剂流出到液泡或根部蛋白中,参与Na+区域化和封存的转运蛋白的改善有助于增强植物的耐盐性[19]。施氮能够截留Na+向地上部运输[20],减少Na+摄取、促进质膜结合移位蛋白的合成[21]。本研究中氮有效性介导的Na+含量下降可能是由于转运蛋白表达增加阻止了Na+在根水平的吸收,氮促进了K+吸收而抑制了Na+吸收,从而降低Na+/K+,这与孙立荣等[22]的研究结果一致。本研究还观察到,适量施氮可以降低西瓜幼苗中Cl-含量,增加NO3-含量,保持较低的Cl-/NO3-值,维持阴离子稳态,这可能是由于盐离子的竞争吸收影响了氮的吸收,而硝酸盐的吸收与盐渍土中的Cl-吸收呈竞争关系,这种相互作用导致在施氮量增加时Cl-吸收累积减少[23],缓解了盐胁迫对离子平衡的破坏,这与Duan 等[24]、苏兰茜等[25]的研究结果一致。可见,适量施氮通过增加K+和NO3-吸收和减少Na+和Cl-的摄取调节Na+/K+和Cl-/NO3-值,维持离子稳态,抵御盐胁迫对西瓜细胞的影响。

3.2 施氮对氯盐胁迫下西瓜抗氧化系统和渗透调节的影响

盐胁迫下会产生活性氧(ROS),导致蛋白质合成减少、酶失活、膜系统破坏[26],通过抗氧化酶SOD、CAT、过氧化物酶(POD)等,可以清除过氧化氢和氧自由基,使植物ROS 处于动态平衡[27],ROS 生产和清除之间的平衡决定了植物损害程度[28],MDA 通常用作氧化损伤程度的生物标志物。氮肥在狗牙根[Cynodon dactylon(L.) Pers.]中的应用已被证明可以通过调节抗氧化酶系统、降低MDA 含量来减少干旱的负面影响[29],在花铃期棉花(Gossypium herbaceumL.)中施用适量氮肥可以提高抗氧化酶活性和减少MDA 累积来缓解短期渍水对生长的抑制作用[30]。渗透调节是植物适应渗透胁迫、避免脱水的有效措施[31]。渗透调节剂的累积在维持细胞稳定性和保护细胞免受胁迫和离子毒害方面起重要作用[32]。据报道,脯氨酸和可溶性糖作为有机渗透调节剂在作物抗逆机制中发挥着重要作用,脯氨酸在盐胁迫下参与细胞渗透压维持,还有助于稳定亚细胞结构(膜和蛋白质),调节氧化还原电位平衡等[33],可溶性糖通过加固细胞壁和增加壁弹性以减少盐离子进入和维持渗透压,防止结构受到压力诱导的损害[34],在黄瓜(Cucumis sativusL.)和麻疯树(Jatropha curcasL.)幼苗中施用适量氮肥可以增加胁迫条件下脯氨酸和可溶性蛋白等有机渗透调节物质的含量,缓解胁迫造成的生长抑制[35-36]。本研究发现,在氯盐胁迫下,施用不同浓度的氮肥可以在一定程度上增加SOD、CAT 活性,提高抗氧化能力,氮作为抵御内部和外部环境氧化应激源的第一道防线,植物抗氧化能力在很大程度上取决于氮的有效性,较高的氮可通过增强植物抗氧化能力和抑制脂质过氧化来提高植物的抗逆性[37],可见氮肥的作用取决于其浓度,在本研究所采用的处理浓度中,0.15 g·kg-1氮水平对西瓜幼苗抗氧化酶SOD、CAT 的促进作用及对MDA 产生的抑制作用最显著,而高氮用量的作用效果会减弱,这可能与过量的氮破坏了西瓜体内的营养平衡有关,需进一步研究。同时施氮0.15 g·kg-1也能够最大程度增加氯盐胁迫下可溶性糖和脯氨酸含量,缓解氯盐毒害,之后继续增加氮用量,缓解作用减弱。这可能是由于施用氮肥可以促进可溶性蛋白和糖合成,稳定了特定蛋白和膜系统,同时提高了脯氨酸合成过程中吡咯啉-5-羧酸合成酶(P5CS)的活性[38],而当氮肥施用过量时,氮同化加强,更多氮被用于合成有机化合物,并且氮肥施用量高会增加蔗糖磷酸合酶和磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)羧化酶,抑制糖的合成,降低脯氨酸和可溶性糖含量,氮对盐胁迫的缓解效应下降[39]。

3.3 施氮对氯盐胁迫下西瓜氮吸收利用的影响

氮代谢是负责植物生长发育的重要生化过程,其调控作用对植物耐盐性至关重要[40]。NR 表达和活性诱导取决于底物的存在和无机氮进入有机化合物的通量,盐处理的植物NR 活性降低伴随着氮累积量的降低[41]。本研究表明,施氮可以诱导氯盐胁迫下西瓜体内NR,增加氮累积量。研究氮素高效吸收利用对减少氮肥使用量、提高氮肥利用率、改善农田生态环境、提高作物产量具有重要意义,氮吸收和利用为氮素高效利用奠定了基础[42],张智猛等[43]研究表明轻度干旱胁迫下花生(Arachis hypogaeaL.)植株氮肥利用率随施氮量增加而先增加后降低,与上述研究结果类似,本研究发现,施氮促进了氮素吸收利用,同样,施氮对氮素的吸收利用也表现出了浓度效应,施氮0.15 g·kg-1处理有利于保持较高的氮素吸收利用效率。

3.4 施氮对氯盐胁迫下生物量的影响

盐胁迫是农业中最常见的非生物胁迫因素之一,限制了植物幼苗正常生长发育,导致作物产量下降[44]。生物量累积是植物耐盐性的直接指标[45],增施氮肥施用量是缓解作物受到盐分胁迫影响的一个重要方式,氮肥能够促进盐胁迫下的作物生长,增加植株生物量和干物质[46]。武荣等[47]研究表明在相同的盐分胁迫下,增加氮肥使用量有利于促进小麦(Hordeum vulgareL.)分蘖成穗,提高其产量;宁建凤等[48]的研究也表明外源氮会显著增加芦荟[Aloevera(L.) Burm.f.]幼苗的植株干重,但存在浓度效应。与上述研究结果类似,本研究中施氮对氯盐胁迫的调控作用也表现出低促高抑的现象,适量施氮可以促进西瓜氮钾吸收,提高氮素利用效率,增加SOD 和CAT 活性及渗透调节物质可溶性糖和脯氨酸含量,进而改善氯盐胁迫下植株生长,增加西瓜幼苗生物量累积。

4 结论

在氯盐胁迫(160 mg·kg-1)下,适量施氮可以通过增加K+和NO3-的吸收以抵抗Na+和Cl-的摄入,维持离子稳态,同时可提高抗氧化酶(SOD 和CAT)活性和减少MDA 累积,从而减轻氧化损伤;并且通过增加有机渗透调节物质(可溶性糖和脯氨酸)含量来提高植株的渗透调节能力,从而增强西瓜生理抗性,维持较强的生长势,缓解氯盐胁迫下的生长抑制作用;还可通过提高硝酸还原酶(NR)活性而促进氮素吸收利用,从而促进西瓜生长。综合各指标与施氮量之间的关系来看,在本研究条件下,施氮量为0.14～0.18 g·kg-1时可有效缓解氯盐胁迫对西瓜的生长抑制作用。