高压静电场下发酵牛肉风味品质及微生物群落特性研究

沙 坤 李思源 张松山 张泽俊 刘海杰

(1.中国农业大学烟台研究院, 烟台 264670; 2.中国农业大学食品科学与营养工程学院, 北京 100083;3.河北旅游职业学院, 承德 067000; 4.中国农业科学院北京畜牧兽医研究所, 北京 100193)

0 引言

发酵牛肉是一种具有高附加值的便捷特色牛肉产品,符合消费者日益改变的生活方式及消费需求,对牛肉产业发展具有重要意义[1]。发酵过程是发酵牛肉品质形成的重要工艺环节,发酵过程中,肉中的自由水转化为结合水形成了其特殊的质地,蛋白质、脂肪等氧化降解形成了其独特的风味[2-3]。

高压静电场(High-voltage electrostatic field,HVEF)是一种人工综合效应场,发生装置通常由直流电源、高压发生器、处理室3个核心装置组成,直流电源先产生一个较低的电压,再通过高压发生器将电压升高,最终作用于处理室的电极形成静电场[4-5],根据电极形状不同可形成均匀或非均匀电场,通常平板电极间的电场被默认为匀强电场,针板、线板等非平板电极间的电场为非匀强电场[6]。

HVEF作为一种新型非热加工技术,节能高效,能够最大限度地保持食品的营养物质,在肉类冷冻解冻、食品保鲜等方面已有广泛研究[7-9]。目前,已有学者研究将HVEF用于发酵食品的生产过程。文献[10]研究HVEF对食醋成分变化的影响,结果表明,经HVEF处理后,食醋中乙醛、乙醇、异丁醇等具有刺激性气味成分的含量降低,总酸和具有芳香气味的酯类含量升高,这对提高食醋等级非常有利。文献[6]通过HVEF辅助发酵余甘子酵素,将发酵时间由49 d缩短至8 d,与无HVEF辅助发酵制备的余甘子酵素比,HVEF辅助发酵的样品必需氨基酸质量浓度由0.674 mg/mL提高至1.214 mg/mL,酯类中乙酸乙酯和水杨酸甲酯所占比例显著提高。 文献[11] 研究HVEF对干腌牛肉冷藏期间品质及挥发性有机物的影响,结果表明,HVEF处理可以延缓冷藏期间干腌牛肉pH值及含水率的降低速率,提高颜色的稳定性能,可以提高苯甲醛、三甲基吡嗪及麦芽酚等特征性风味成分的含量,HVEF可以应用于干腌肉类的贮存。文献[12]采用HVEF辅助腌制牛肉,结果表明,HVEF处理可以提高腌制完成后产品的产率,促进水分和NaCl在肉样中的扩散。但还鲜有研究将HVEF用于发酵肉制品的生产过程。

气相-离子迁移谱(Gas chromatography-ion mobility spectrometry,GC-IMS)是一种新兴的挥发性化合物检测手段,具有操作简单、响应迅速等优点,已广泛应用于食品风味分析领域[13-14]。目前采用GC-IMS技术对肉品风味研究主要集中在不同种类肉品的风味鉴别、掺伪鉴别、新鲜度检验等,也有研究开始用于比较不同加工方式(如干燥、炖煮、发酵、老化、干腌等)对肉品风味特性的影响[15]。文献[16]采用GC-IMS技术在混菌发酵香肠中共鉴定出33 种挥发性物质,可以直观地看出添加不同种类发酵剂及发酵过程中风味物质种类和含量的变化。高通量测序技术可以对物种基因组进行全面分析,特异性强、灵敏度高,可以全面、客观地了解某一微生态系统中微生物群落结构[17]。文献[18]采用高通量测序技术对不同来源的传统发酵腊肉中细菌多样性进行了解析,结果显示不同来源腊肉样品在细菌组成方面相似性较高。文献[19]采用通量测序技术评价腊肠发酵过程中细菌多样性,发现乳酸菌对腊肠的发酵成熟和风味品质的形成有重要影响。

本文以牛肉为原料,通过HVEF结合自然发酵方法制备发酵牛肉,通过电子鼻、电子舌及GC-IMS分析技术研究发酵和HVEF处理对牛肉风味品质的影响,同时,采用高通量测序技术测定不同处理组发酵牛肉中的微生物群落结构,以期为揭示高压静电场对发酵牛肉品质的影响提供理伦依据。

1 材料与方法

1.1 材料

牛肉(小黄瓜条),购买于河北燕城食品有限公司;腌制用中性大粒盐、蔗糖、胡椒粉、辣椒、香叶等,食品级,购于北京物美超市。

1.2 仪器与设备

BS 200S-WEI型电子天平,北京赛多利斯天平有限公司;HI99163型pH计,美国HANNA仪器有限公司;CR-400型色差仪,日本柯尼卡-美能达公司;BMT-JD020(2.0 kV)型、BMT-JD010(3.0 kV)型静电场发生装置,山东博美特厨业有限公司;PEN3型电子鼻、SA402B型电子舌,北京盈盛恒泰科技有限责任公司;FlavourSpec型风味分析仪,山东海能仪器股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1发酵牛肉制备

腌制剂组成:腌制剂使用按腌制剂与原料肉质量比添加,食盐3%,蔗糖0.15%,亚硝酸钠0.02%,胡椒粉1%,辣椒0.3%,香叶0.5%,腌制前混合均匀。

腌制:将原料牛肉在0～4℃冰箱内解冻,修整外形,将腌制剂均匀地涂抹在原料肉表面,在4℃下腌制10 d,期间每2 d翻整1次。

发酵:腌制完成后,洗去肉表面腌制剂,装入尼龙网袋。进行编号,实验设计对照、2.0 kV处理组、3.0 kV处理组,对照组样品吊挂在发酵间(温度 15～20℃、相对湿度60%～65%)发酵42 d,2.0 kV组和3.0 kV组分别将2.0、3.0 kV静电场发生装置接至吊挂发酵牛肉的铁架上,其他条件与对照组一致。

取样:3组处理分别取发酵第0、42天的肉样用于指标的测定。

1.3.2含水率

参照GB 5009.3—2016《食品安全国家标准 食品中水分的测定》,采用直接干燥法测定。

1.3.3pH值

参照GB 5009.237—2016《食品安全国家标准 食品pH值的测定》。

1.3.4肉色

使用色差计测定样品的L*、a*和b*值。肉样切开后,于室温(20℃)氧合40 min后测定,每个样品测定3次,结果取平均值。

称取1 g样品于10 mL顶空瓶中,将顶空瓶密封,室温平衡20 min,60℃水浴30 min,室温平衡 30 min,平衡结束后使用PEN3型电子鼻进行检测分析。进样流量600 mL/min,洗脱时间300 s,检测时间300 s。选用296～300 s响应值进行数据分析。使用的电子鼻传感器类型及性能如下:WIC,对芳香成分敏感;W5S,对氮氧化物敏感;W3C,对氨、芳香类化合敏感;W6S,对氢化物有选择性;W5C,对烷烃、芳香化合物敏感;W1S,对甲烷敏感;W1W,对无机硫化物敏感;W2S,对醇类及部分芳香化合物敏感;W2W,对芳香成分、有机硫化物敏感;W3S,对长链烷烃敏感。

1.3.6电子舌

称取5 g样品于离心管中,加入20 mL预热至38℃的超纯水,涡旋仪处理30 min,再加入20 mL预热至38℃的超纯水,37℃超声30 min,室温8 000 r/min、离心10 min,取上清液用砂芯漏斗抽滤,滤液稀释 2倍, 通过SA402B型味觉分析系统检测分析。选择Sample_Measurement(2steps_washing)测试方法:第 1次 清洗溶剂90 s,第2次清洗溶剂60 s,第3次清洗溶剂60 s,调解溶剂30 s、样品液30 s,第4次清洗溶剂3 s、第5次清洗溶剂3 s、标准清洗溶剂30 s。使用的电子舌传感器为:AEE(鲜味)、CA0(酸味)、CT0(咸味)、C00(苦味)、AE1(涩味)。

1.3.7挥发性风味物质

称取2 g样品于20 mL顶空瓶中,60℃孵育 20 min 后进样。

自动进样单元:进样体积500 μL,孵育时间 20 min,孵育温度60℃,进样针温度85℃,孵化转速500 r/min。

气相-离子迁移谱单元:FS-SE-54-CB-1型色谱柱(15 m×0.53 mm),色谱柱温度为60℃,载气为N2,IMS温度45℃,分析时间25 min。应用VOCal软件内置的NIST数据库和IMS数据库对物质进行定性分析。

对命运的反抗，一直是陈凯歌导演作品隐藏的深层次主题，而其表现形式大多为因对信念的坚持而最终毁灭，往往呈现出悲剧性的色彩。我们可以发现，当下电影市场中优秀的电影作品总是有着深厚的人文内涵，艺术总是为人而存在，应该紧紧围绕着“人”这一主题。陈凯歌导演身上所承载的“现代士人精神”需要大力弘扬，重构“现代士人精神”是构建“中国电影学派”不可或缺的一环。

1.3.8微生物群落

使用FastDNA Spin Kit for Soil试剂盒提取样品DNA,1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA完整性,NanoDrop2000型核酸蛋白测定仪检测DNA纯度和浓度。

真菌DNA 聚合酶链式反应PCR扩增引物分别为ITS1F和ITS2R,序列分别为5′-CTTGGTCATTT AGAGGAAGTAA-3′和5′-GCTGCGTTCTTCATCGAT GC-3′。ITS1F-ITS2R引物PCR反应体系包括:10 ng 模板DNA,2 μL 10×Buffer,2 μL 2.5 mmol/L dNTPS,0.8 μL 5 μmol/L各引物,0.2 μL rTaq Polymerase聚合酶,0.2 μL BSA(牛血清白蛋白),补二次蒸馏水至20 μL。

细菌DNA聚合酶链式反应 PCR扩增引物分别为338F和806R,序列分别为5′-ACTCCTACGGG AGGCAGCAG-3′和5′- GGACTACHVGGGTWTCTA AT-3′。338F_806R引物PCR反应体系包括:10 ng 模板DNA、4 μL 5×FastPfu Buffer、2 μL 2.5 mmol/L dNTPS、0.8 μL 5 μmol/L 各引物、0.4 μL FastPfu Polymerase聚合酶、0.2 μL BSA、补二次蒸馏水至 20 μL。PCR反应参数为:1×(95℃,3 min)、27×(95℃,30 s;55℃,30 s;72℃,45 s)、1×(72℃,10 min)。

2%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物,检测合格后通过上海美吉生物医药科技有限公司高通量测序平台进行检测,并通过美吉生信云平台进行数据分析。

1.4 数据分析

试验数据用IBM SPSS Statistics 26进行方差分析,用Origin 2018制图。

2 结果与分析

2.1 理化指标的分析

不同处理组牛肉发酵后的理化指标如表1所示(表中ΔE表示色差)。

表1 不同处理组发酵牛肉的理化指标Tab.1 Physicochemical indexes of fermented beef in different treatment groups

2.1.1含水率

由表1可知,发酵42 d,3组样品含水率均大幅下降,对照组、2.0 kV组、3.0 kV组样品含水率分别为54.75%、45.17%、40.40%,2.0 kV组和3.0 kV组均显著低于对照组(P<0.05)。结果表明,发酵时间对样品含水率有极显著影响(P<0.001),HVEF会极显著促进牛肉的脱水干燥过程(P<0.001),且电压越高,效果越显著。含水率降低,使水溶性的游离氨基酸和还原糖等物质浓缩,这些物质是美拉德反应的底物,能生成醛、酮、烷烃和酯类等一系列挥发性物质,有利于发酵肉制品风味的形成[20];而且,水分损失会增高牛肉中的盐浓度,盐一方面可以为发酵牛肉提供咸味,另一方面可以抑菌,有助于发酵牛肉的长期保存[21]。

2.1.2pH值

由表1可知,发酵42 d,3组样品的pH值均显著增加(P<0.05),且3.0 kV组显著高于2.0 kV组与对照组(P<0.05)。发酵过程中,产品pH值的上升与蛋白质水降解产生碱性物质有关[22],较高电压处理可能会使蛋白水解加剧,促进pH值增加,但整体来看HVEF对pH值没有显著影响(P>0.05)。

2.1.3肉色

色泽是发酵牛肉的重要品质指标。L*表示肉的亮度,a*表示红度,b*表示黄度。由表1可知,发酵42 d,发酵时间和HVEF处理对样品的L*值均无显著影响(P>0.05),HVEF和发酵时间的交互作用对发酵牛肉的L*和b*值无显著影响(P>0.05),与文献[11]的研究结果一致。2.0 kV组样品的a*值发酵后显著降低,且显著低于对照组与3.0 kV组(P<0.05)。发酵42 d,不同处理组样品的ΔE有显著差异(P<0.05),对照组、2.0 kV组、3.0 kV组的ΔE值依次为2.25、9.16、4.76。a*值为预测消费者对牛肉颜色接受程度的指标,a*值较高,消费者的接受程度较高,ΔE值与肉的色泽稳定性有关,ΔE值越小,说明肉的色泽越稳定[11]。因此,2.0 kV HVEF处理可能会对发酵牛肉的色泽稳定性产生不利影响。

2.2 电子鼻结果分析

图1为发酵牛肉电子鼻检测传感器数据雷达图,4组样品的W1W、W2W、W5S传感器的响应值变化显著,W1W传感器对无机硫化物敏感,W2W对有机硫化物敏感,W5S对氮氧化合物敏感。由图1 可知,对照组W1W、W2W、W5S传感器响应值最低,其次是发酵0 d样品,HVEF处理的两组样品的响应值显著增大,且3.0 kV组最高。含硫化合物气味阈值很低,具有熟肉、青草、烧烤等气味,主要来源于含硫氨基酸和硫胺素的降解[23-24],说明HVEF处理有利于这类反应的进行。图2为10个传感器数据经主成分分析转化为2个变量PC1(59.0%)、PC2(38.9%),累计贡献率97.9%,能够解释样本总体的变异。从图2可以看出,4组样品分布在不同区域,表明各组样品之间挥发性气味成分存在明显差异,可以通过主成分分析进行较好的区分。

图1 不同处理组发酵牛肉电子鼻传感器雷达图Fig.1 Radar image of electronic nose sensor of fermented beef in different treatment groups

图2 不同处理组发酵牛肉电子鼻数据主成分分析Fig.2 Principal component analysis of electronic nose data of fermented beef in different treatment groups

2.3 电子舌结果分析

不同处理组发酵牛肉的电子舌实验结果绘制成雷达图如图3所示。电子舌传感器十分灵敏,可以检测到人的舌头无法辨别的味道,因此每个传感器都设有无味点[25-26],低于无味点的数据认为无法被人的舌头辨别。实验中苦味、鲜味、咸味、丰富度的值在无味点之上,去除无味点后,重新绘制雷达图,如图4所示。由图4可知,与发酵0 d的样品相比,发酵42 d的3组样品的鲜味、咸味和苦味传感器响应值均增加,且从小到大依次为3.0 kV组、2.0 kV组、对照组。咸味响应值增高,一方面可能是因为HVEF处理发酵后牛肉失水较多,导致牛肉中NaCl浓度升高[27],另一方面,可能是因为蛋白质水解产生了咸味肽[28]。鲜味和苦味响应值的增高可能由于发酵过程中蛋白质水解使呈鲜味及苦味的肽和氨基酸含量增加,也可能与核苷酸含量增加有关[29-30],而且氨基酸和核苷酸的协同作用也会增加鲜味[28]。发酵42 d的样品丰富度的响应值高于发酵0 d的样品,但发酵42 d的3组样品之间无差异。以上结果说明,HVEF处理会促进牛肉中的蛋白质水解,产生小分子肽和氨基酸,从而影响发酵牛肉的滋味。

图3 不同处理组发酵牛肉电子舌雷达图Fig.3 Radar image of electronic tongue sensor of fermented beef in different treatment groups

图4 不同处理组发酵牛肉电子舌雷达图(扣除无味点)Fig.4 Radar image of electronic tongue sensor of fermented beef in different treatment groups(removing tasteless point)

2.4 挥发性风味物质

不同处理组发酵牛肉中挥发性成分的二维 GC-IMS 差异对比谱图如图5所示。横坐标1.0 ms处竖线为反应离子峰(RIP峰),RIP峰两侧的每一个点代表的是一种挥发性成分。采用差异模式进行样品间的差异比较,以发酵0 d的谱图作为参比,其他样品的谱图扣减参比。扣减后的背景为白色,则挥发性成分一致,红色代表该物质浓度比参比样品高,蓝色代表比参比低。从图5可以看出,与发酵 0 d 的样品比较,发酵42 d的3组牛肉中挥发性风味物质含量表现出比较明显的差异,有不同程度的升高或降低。

图5 不同处理组发酵牛肉挥发性成分的GC-IMS谱图Fig.5 GC-IMS spectrum of volatile components of fermented beef in different treatment groups

经过对比特征性物质的保留时间和离子迁移时间,通过GC-IMS数据库检索来对挥发性成分进行定性分析,结果如表2所示。从样品中共鉴别出43种挥发性成分,包括一些化合物的二聚体和多聚体,其中,醇类12种,酮类10种,醛类9种,烯类8种,其他4种。

为更好地分析不同处理组样品之间挥发性成分的差异,依据各组样品重复测定3次所得GC-IMS二维图谱中所有的待分析峰构建成指纹图谱,结果如图6所示。图中每一行代表一个样品中选取的全部信号峰,每一列代表同一物质在不同样品中的信号峰。从图6可以看出,红框中的物质包括4-萜烯醇、芳樟醇、α-松油醇、顺-3-己烯-1-醇、己醛、壬醛、辛醛、庚醛、α-水芹烯、3-戊酮、α-蒎烯、β-蒎烯、1-戊醇、1-己醇、3-羟基-2-丁酮、6-甲基-5-庚烯-2-酮、2-戊酮、丁酮、柠檬烯、1,8-桉树脑和乙醇等,在发酵0 d的样品中含量较高,发酵42d的3组样品中含量出现不同程度的下降,结果表明这些物质在腌制结束后就已经快速生成,它们主要来源于香辛料的添加和脂肪氧化[24,31],随着发酵过程进行,这些物质易被氧化或相互反应生成酯类物质,所以出现含量下降[32]。

图6 不同处理组发酵牛肉挥发性成分指纹图谱对比Fig.6 Comparison of volatile compounds fingerprints of fermented beef in different treatment groups

而橙框中的物质在发酵0 d的样品中含量较低,在发酵42 d的3组样品中含量不同程度上升,这些物质包括苯甲醛、2-乙酰-1-吡咯啉和3-甲基丁醇等,表明这些物质主要形成于发酵过程,这一结果与文献[33]一致。苯甲醛具有苦杏仁味,3-甲基丁醇呈清香味,这些物质主要来自于氨基酸的Strecker 降解[34]。发酵42 d,HVEF处理的牛肉中的苯甲醛含量低于对照组,且电压越高含量越低。

绿框中的物质为2-戊酮,与发酵0 d相比,发酵42 d后,对照组中的该物质含量升高,而HVEF处理组中的该物质含量下降。2-戊酮主要来自于微生物作用下的脂肪不完全β-氧化,能够赋予肉制品特殊的果香、辛辣等发酵风味[35-36]。

为进一步研究发酵时间和HVEF处理对发酵牛肉挥发性风味成分的影响,将不同处理组样品中挥发性成分指纹图谱数据进行主成分分析,结果如图7 所示,PC1和PC2累计方差贡献率达到88%,能够解释样本总体的变异。从图7可以看出,4组样品分布在3个区域,对照组和2.0 kV处理组聚集在一起,表明两组样品的挥发性成分比较接近,而 0 d 发酵组及3.0 kV处理组分布在相对较远的区域,表明3个区域样品之间挥发性成分存在明显差异,可以通过主成分分析进行较好的区分。这一结果与电子鼻结果不完全一致,可能是两种检测方法的差异导致。电子鼻是通过识别样品的整体挥发性风味成分对样品之间进行差异比较,而GC-IMS技术是通过鉴定出的挥发性物质进行差异分析,受检测数据库限制,有些物质可能不能通过GC-IMS技术检测到,如电子鼻检测结果中含硫化合物的感应信号较强,但在GC-IMS鉴定结果中并未鉴定出含硫化合物的存在。

图7 不同处理组发酵牛肉挥发性成分指纹图谱主成分分析Fig.7 Principal component analysis of volatile components fingerprint of fermented beef in different treatment groups

2.5 微生物多样性分析

2.5.1菌群结构

图8为基于属水平的发酵牛肉中真菌菌落结构图。发酵0 d牛肉中的优势菌为Penicillium、Debaryomyces和曲霉菌属(Aspergillus),所占百分比分别为45.73%、19.97%、14.29%。发酵42 d,不同处理组样品中的优势菌群都为Penicillium和Debaryomyces,但是所占比例不同,对照组、2.0 kV组、3.0 kV组中Penicillium和Debaryomyces所占百分比分别为84.69%和15.29%、62.75%和36.93%、61.72%和37.91%。Penicillium的活性作用与发酵肉制品中脂肪及蛋白质氧化分解产生的酮类、醛类、醇类等风味物质有关,Debaryomyces的活性作用与酯类和酸类风味物质的生成有关[32,36]。

图8 基于属水平的牛肉中真菌菌落结构Fig.8 Fungi community of beef based on genus level

图9为基于属水平的牛肉中细菌菌落结构图,发酵0 d牛肉样品中的优势菌为Staphylococcus,所占百分比为54.24%。发酵42 d,不同处理组样品中的优势菌群都有Staphylococcus,但所占比例不同,对照组为55.31%,2.0 kV组为78.69%,3.0 kV组为93.21%。另外,对照组还有一优势菌群,为Lactobacillus,所占百分比为27.53%。文献[34]研究发现发酵肉制品中的主要优势微生物为清酒乳杆菌(Lactobacillussakei)、弯曲乳杆菌(Lactobacilluscurvatus)和Staphylococcus,Staphylococcus普遍具有较强的蛋白酶和酯酶活性,能够有效促进风味物质的生成[23]。

图9 基于属水平的发酵牛肉中细菌菌落结构Fig.9 Bacterial community of beef based on genus level

2.5.2Alpha-多样性分析

基于OUT聚类分析结果,Sobs指数反映实际测量的OUT数目,Ace指数和Chao指数均可表征群落丰富度,Shannon指数和Simpson指数均可表征群落微生物多样性,Coverage指数代表测序文库覆盖率。由表3和表4可知,样品的Coverage指数均为0.99,说明样品可代表真实情况。发酵42 d,样品真菌及细菌的Sobs指数均下降。真菌及细菌Ace和Chao指数均下降,HVEF处理样品真菌Ace指数显著高于对照组(P<0.05),细菌Ace指数显著低于对照组(P<0.05),说明在发酵过程中真菌和细菌群落丰富度均降低,HVEF处理会增加真菌丰富度,降低细菌丰富度,不同电压处理组之间差异不显著。Shannon指数越大则多样性越高,而Simpson指数越大则多样性越低,发酵42 d,真菌及细菌Shannon指数均降低,3.0 kV HVEF处理Shannon指数显著高于其他两组(P<0.05),HVEF处理Shannon指数显著低于对照组(P<0.05);发酵42 d,真菌的Simpson指数增大,3.0 kV HVEF Simpson指数处理显著低于其他两组(P<0.05),细菌的Simpson指数减小,HVEF处理组显著低于对照组(P<0.05),以上结果表明,3.0 kV HVEF处理有利于保持样品中真菌及细菌的多样性。

表3 真菌Alpha-多样性指数Tab.3 Alpha diversity index of fungi

表4 细菌Alpha-多样性指数Tab.4 Alpha diversity index of bacterial

3 结束语

本研究将HVEF应用于发酵牛肉的生产,结果表明,HVEF处理会极显著促进牛肉的脱水干燥过程(P<0.001),对pH值、L*和b*值无显著影响,但2.0 kV HVEF处理会显著降低a*值、增加ΔE值(P<0.05),对发酵牛肉的色泽稳定性产生不利影响。电子鼻分析表明,不同处理组发酵牛肉样品之间风味差异较大,可以通过主成分分析进行较好区分。电子舌分析表明,HVEF处理会增加鲜味、咸味和苦味物质的含量。通过GC-IMS分析,共鉴别出43种挥发性风味物质,包括醇类12种,酮类10种,醛类9种,烯类8种,其他4种。高通量测序结果表明,HVEF处理会改变发酵牛肉中真菌和细菌优势菌的比例,增加具有较强的蛋白酶和酯酶活性的Staphylococcus比例。综合分析表明,3.0 kV HVEF处理对发酵牛肉品质提升有较好促进作用,在实际生产中具有较好应用前景。