SEPT9甲基化检测在结直肠癌早期诊断中价值的研究进展

董优优 综述,陈昌国 审校

解放军总医院第六医学中心检验科,北京 100048

结直肠癌(CRC)是多种致癌因素相互作用导致的一种恶性肿瘤,IRAC2020年的统计数据显示其发病率居全球第3位[1],我国癌症研究中心的统计数据显示其病死率居我国第4位[2]。CRC发病相对隐匿,患者初期临床表现不明显,多数患者在就诊时已经处于中晚期,导致其预后不良。早发现、早诊断、早治疗是降低CRC病死率的有效手段。目前,常用的CRC筛查方式主要有粪便隐血试验和结肠镜检查[3]。结肠镜是诊断CRC的金标准,但由于其是一种侵入性检查,患者需要经受一定痛苦,甚至有可能导致一些肠道并发症且成本相对较高,不易为患者所接受。粪便隐血试验价格相对较低,操作简便、快速,但影响检测结果的因素较多,且特异度和灵敏度均较低。随着CRC发病率逐年增加,CRC的预防及探索适宜的早期诊断标志物成为目前研究热点之一[4]。近年研究指出,SEPT9基因在CRC病变前或早期存在异常甲基化现象,其作为CRC早期检测标志物具有较大的潜在临床应用价值[5]。本文将就SEPT9甲基化检测在CRC早期诊断中的应用进展进行综述。

1 CRC发生相关的诱发因素

CRC的发病过程较为复杂,其发病机制尚不明确,环境、饮食习惯、遗传、生活方式等因素都可能参与CRC的发生。常见饮食方面的诱因包括:蛋白质、脂肪摄入过多而钙、维生素D和膳食纤维摄入较少,经常食用腌制、油炸及烟熏食品,以及食用受到污染或未合理使用添加剂的食品等;生活方式方面的诱因主要有日常活动量的减少、经常熬夜、作息不规律等。此外,遗传因素、肥胖也与CRC发病密切相关[6]。对于存在上述高危因素的人群,为降低CRC的发病率除应尽早去除这些诱因,针对高危人群进行早期筛查并采取恰当的干预措施,对患者的预后评估起着至关重要的作用。

2 CRC临床常见诊断方法

目前,CRC的筛查方法有:粪便隐血试验、血清肿瘤标志物、CT结肠造影、柔性乙状结肠镜检查和结肠镜检查。粪便隐血试验是一种无创、低成本的筛查方法,但存在患者依从性不好,且灵敏度有限等问题。有研究显示,粪便隐血试验用于CRC筛查的检出率为11.4%[7],而且易受饮食因素干扰,特异度相对较低,已逐渐被人血红蛋白特异性粪便免疫化学实验(FIT)所取代。然而,FIT因受到血红蛋白降解和间歇性出血干扰会导致近四分之一的CRC病例在诊断时已处于晚期,通常预后不良[8]。CT结肠造影也是CRC早期筛查的方法之一,与结肠镜检查相比具有更低的侵袭性,但同样需要检查前做肠道准备,结果判读也依赖较高的专业知识,用于检查的造影剂、设备等成本也相对较高。结肠镜检查是诊断CRC的金标准,该方法对CRC具有95%以上的特异度,但需要肠道准备、专业的医生进行操作,成本较高,而且侵袭性操作伴随一定风险。除具有上述弊端外,乙状结肠镜还无法检测近端结肠病变。目前用于CRC筛查的血清肿瘤标志物在早期诊断中的临床价值不高,其临床价值更多地体现在预后判断、治疗效果监测等方面[9]。癌胚抗原(CEA)是从CRC和胚胎组织中提取的一种肿瘤相关抗原,血清CEA对Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期CRC患者的灵敏度分别为4%～11%、25%～30%、38%～44%和50%～71%[10],即便如此,CEA也不被推荐用于CRC的早期筛查。肿瘤DNA的甲基化通常体现为甲基化整体水平的下降与CpG岛的高甲基化。甲基化会导致相关基因转录受限,原癌基因的去甲基化会导致基因异常表达及抑癌基因的甲基化导致基因表达降低均会促进肿瘤的发生。LEON ARELLANO等[11]研究显示,SEPT9基因甲基化检测CRC早期诊断的灵敏度和特异度分别为88.9%和100.0%,且手术切除后患者肿瘤的复发与SEPT9基因持续高甲基化之间存在明显相关性。此外,有研究提示,CRC患者体内SEPT9 v2 转录本启动子甲基化水平与肿瘤发生时间及病情严重程度高度相关[11]。

3 SEPT9基因结构及功能

Septin基因家族是HARTWELL等于1971年在酿酒酵母中筛选可影响细胞分裂周期的温度灵敏度突变基因时被发现的,SEPT基因家族由14个成员(SEPT1～SEPT14)组成,其编码产物为Septin[11]。Septin是一类含鸟苷三磷酸(GTP)结合结构域的一个家族,该家族蛋白成员均具有非膜相结构,在真核生物中广泛存在,但罕见在植物中发现。Septin与多种细胞生物学过程有关,包括细胞质的分裂,细胞膜的转运和融合,胞吐作用及细胞凋亡[13]。SEPT9是Septin蛋白家族成员之一,基因定位于人体染色体17q25.3,长度在2.4×105bp左右,共包含17个外显子,可编码15种多肽[14]。SEPT9可转录出18种产物,在SEPT9 5′端可产生SEPT9 v1～5和4*共6种变异剪切体,而在SEPT9 3′端的变异剪切又可产生3种不同的mRNA——SEPT9 v1、2和3[15]。目前,大部分研究认为,Septin的6或8个亚基可以形成稳定的聚合体:SEPT2、SEPT6和SEPT7各2个分子可形成六聚体,SEPT2、SEPT6、SEPT7和SEPT9各2个分子可形成八聚体[16]。FRANCOIS等[17]通过对SEPT9八聚体的分析发现,SEPT9处于终端位置,在亚基的聚合中发挥关键作用,并保持整个八聚体的稳定;SEPT9在子代细胞分裂,特别是在最后的细胞质分离阶段发挥关键作用[13]。SEPT9表达降低或缺乏可能会严重影响细胞的细胞质分裂。SEPT9在八聚体中的作用可能是SEPT9高度甲基化导致转录抑制从而引起CRC的关键因素[18]。SEPT9甲基化水平不仅在CRC中升高,在胃癌、乳腺癌、前列腺癌等疾病中也有升高。ZHAO等[15]研究结果提示,SEPT9甲基化用于胃癌早期诊断的灵敏度优于CEA、糖类抗原CA19-9和糖类抗原724(CA724),且SEPT9甲基化水平与胃癌的临床分期呈正相关;ZHANG等[19]研究发现,乳腺癌细胞系及乳腺癌组织中SEPT9呈现高度甲基化状态,外泌体中SEPT9表达水平降低,提示SEPT9高度甲基化可能发挥了促乳腺癌细胞生长的作用。HE等[20]用甲基化特异性PCR定量方法检测高危人乳头瘤病毒阳性患者宫颈脱落细胞中SEPT9基因的甲基化程度,结果表明,SEPT9甲基化率和水平随宫颈病变的严重程度加重而增加。KRAUSEWITZ等[21]利用癌症基因组图谱(TCGA)数据库对前列腺癌相关数据分析发现,前列腺癌患者SEPT9存在高甲基化现象,可用于区分健康人群和前列腺癌患者,并有助于确定肿瘤负担和侵袭性。LEON ARELLANO等[11]对CRC患者的前瞻性研究发现,CRC患者血浆中存在高甲基化SEPT9 DNA片段。

4 SEPT9的致癌机制

4.1缺氧诱导因子-1(HIF-1)信号通路 缺氧诱导因子是核转录因子的一种,在调节细胞低氧反应的过程中发挥核心作用。肿瘤组织的低氧环境既可以限制肿瘤细胞的生长和转移,又可促进其转化为浸润力更强、生长速度更快的表型。HIF-1共包含两个亚基,即HIF-1α和HIF-1β[22]。HIF-1α在正常状态下可以迅速产生和降解,该过程需要泛素介导的蛋白酶帮助;在低氧环境中,HIF-1α与HIF-1β结合,导致其乙酰化和水解过程受阻,形成的二聚体与目的基因启动子区低氧反应元件相结合,进而激活下游多种基因转录,如促红细胞生成素(EPO)、血管内皮生长因子(VEGF)、糖酵解酶和葡萄糖转运体-1(Glut-1)等,有利于肿瘤细胞的生存与增殖[23]。SEPT9与哺乳动物的MSF-A为同源物,当MSF-A在细胞内过量表达可使HIF-1α的降解和泛素化受到阻碍,从而使HIF-1α表达量增加、细胞增殖加速,同时使其下游基因Glut-1、VEGF、碳酸酐酶Ⅸ(CA-Ⅸ)及内皮素-1(ET-1)的表达增加。MSF-A通过激活HIF通路,参与新血管的形成[24]。GONZALEZ等[25]将SEPT9转染到可无限繁殖的人乳腺上皮细胞后发现,SEPT9 v1高表达可使细胞呈现肿瘤细胞的一些特征,如增殖加速、侵袭性增加及染色体异倍体增多等;同时,这些肿瘤的生长特性会随着SEPT9 v1的高表达而受到抑制,提示某些乳腺癌的发生与SEPT9 v1的高表达有关。

4.2c-Jun 氨基末端激酶(JNK)信号通路 c-Jun 氨基末端激酶是促分裂原活化蛋白激酶家族成员之一,可在细胞内激活物及紫外线、细胞因子和炎症等细胞外因素的刺激下激活;JNK不但可加速促凋亡分子的释放来诱发细胞凋亡,在细胞增殖、凋亡、分化、形态改变、周期调控及肿瘤的出现及增长过程中有重要作用,这些过程受到如磷酸化等诸多因素的精确调控[26]。GONZALEZ等[27]研究发现,SEPT9 v1通过抑制JNK降解,使JNK1、JNK2表达处于一种稳定状态,从而使其转录活性被激活并促进下游细胞周期蛋白D1(Cyclin D1)表达升高,提示Septin蛋白可通过激活JNK信号通路参与细胞增殖的调控。

4.3Rho信号通路 Rho蛋白是一种具有GTP酶活性的小分子蛋白,通过控制下游基因的靶效应分子直接影响细胞骨架的形成,间接介导细胞间黏附作用,从而有助于肿瘤细胞转移与侵袭[28]。此外,有学者通过建立小鼠模型向其体内注射Rho蛋白,发现小鼠胚胎的SEPT9结构被破坏进而影响SEPT9生物学功能,如细胞分裂和增殖等生理过程[29]。

5 SEPT9基因甲基化的检测方法

目前常用的甲基化检测方法有3种。第1种,采用SmaⅠ和HpaⅡ等(用于识别甲基化CpG的限制性内切酶)处理样本,再用免疫印迹或凝胶电泳检测甲基化区域,该种方法中较为常用的是限制性标记基因组扫描;第2种,利用甲基化结合蛋白2(MECP2)、甲基化CpG结合域蛋白2(MBD2)等(甲基化结合蛋白)富集甲基化的DNA,再采用测序或探针杂交等方式对DNA甲基化水平进行检测;第3种,最常用的甲基化特异性PCR,先用亚硫酸氢盐对样本进行处理,可使非甲基化的胞嘧啶(C)变成尿嘧啶(U),而甲基化的C则不变,再对处理后的样本进行测序或者PCR检测,从而得出DNA甲基化水平或者该基因的某些片段是否发生甲基化[30]。随着甲基化检测技术的发展,已经可以实现对全基因组DNA甲基化进行检测。DNA甲基化检测已经从特异位点扩展到全基因组范围,获得的数据也更为全面和精确,为进一步研究提供了更为坚实的技术支撑[31]。

6 SEPT9甲基化检测与CRC诊断

近年有研究显示,SEPT9基因在CRC早期筛查中灵敏度为62%～75%,特异度为89%～95%[32]。一项包括300例受试者的研究显示,早期CRC(Ⅰ期和Ⅱ期)的总体灵敏度为90%,特异度为87%[33]。LIU等[34]对CRC患者和非CRC患者血浆中SEPT9甲基化水平检测结果显示,SEPT9甲基化检测在CRC诊断中的灵敏度为85.6%,特异度为90.1%。MA等[35]采用微滴式数字PCR(ddPCR)技术对10个CRC细胞系(SW480、DLD1、HT29、HCT116、Colo205、Colo320、LoVo、LS123、SW1116和HCT15)的甲基化状态进行验证,其中8个CRC细胞系中甲基化率和丰度较高(P<0.05)。SHAFIEI等[36]对CRC患者和健康对照者血液SEPT9基因甲基化水平进行检测,发现其对于CRC诊断的灵敏度和特异度分别为80%和80%。LEON ARELLANO等[37]研究发现,SEPT9诊断CRC的灵敏度为55.6%,特异度为100.0%。

ZHAN等[38]对目前常用的几种CRC筛查方法进行评估发现,在95%特异度下的灵敏度:SEPT9甲基化为53.8%、CEA为37.2%、CA19-9为13.1%、CA724为17.5%;腺瘤检出率如下:SEPT9甲基化为23.3%,CEA为11.1%,CA19-9为2.3%,CA724为11.9%。SUN等[39]对招募的有CRC高危因素的受试者和CRC术前患者血浆中SEPT9甲基化水平进行检测,SEPT9甲基化检测用于CRC检测的灵敏度为73.0%,粪便引血试验检查为58.7%,CEA为52.4%,CA19-9为33.3%,CA724为42.9%;SEPT9甲基化检测用于结直肠腺瘤诊断的灵敏度为17.1%,FOBT为12.2%。YUAN等[40]对CRC患者SEPT9甲基化、CEA、CA19-9和糖类抗原242(CA242)检测发现,其SEPT9甲基化水平升高率为81.7%,CEA、CA19-9和CA242水平升高率分别为44.8%、16.6%和6.4%。

目前,CRC筛查的金标准仍是结肠镜检查,但由于存在侵入性操作及成本相对较高,不适合大规模早期筛查。粪便隐血试验是一种低成本的筛查方式,但由于取材不方便,患者依从性不好,灵敏度及特异度较低,故筛查效果一般。SEPT9甲基化与常规血清标志物检测,均采集血液标本进行检测,与常规血清标志物CEA、CA19-9、CA724、CA242相比,在早期诊断CRC时,SEPT9甲基化检测在灵敏度及特异度方面均表现出明显优势。因此,SEPT9甲基化检测在CRC早期诊断中具有重要的临床应用价值。

SEPT9甲基化检测的阳性率与CRC的分期存在相关性,其中Ⅰ期患者检出率约为50%,Ⅱ期和Ⅲ期患者检出率约为70%,Ⅳ期患者检出率可能达100%。石会勇等[41]研究显示,Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期、Ⅳ期患者的检出率分别为47.4%、60.2%、88.9%、88.9%,由此可以看出,SEPT9基因甲基化阳性率随着其分期增高而升高。冷霞等[42]研究显示,各期SEPT9基因甲基化的结果为Ⅰ期患者SEPT9基因甲基化检出率为14.3%,Ⅱ期检出率为40.7%,Ⅲ期检出率为61.5%,Ⅳ期检出率为81.8%,但与患者年龄、性别、肿瘤位置和病理分型无明显相关性。

7 结 语

CRC的病因包括生活方式、饮食习惯和遗传因素,但CRC的发生是在多种致癌因素互相作用下的结果,其具体发病机制尚不明确。目前,CRC的筛查、诊断、治疗和预后监测成为人们越来越关注的医学问题之一。外周血SEPT9基因甲基化水平检测对CRC早期诊断有较高的特异度和灵敏度,而且相对于结肠镜等传统方法有很多优点,如简便易行、非侵入性、患者接受度好等,且不受患者年龄、肿瘤位置影响,有望成为临床早期诊断CRC的关键方法。SEPT9基因甲基化检测联合其他标志物检测可以明显提高CRC的检出率,鉴于SEPT9基因甲基化在CRC外的其他肿瘤中也可出现,故以SEPT9基因甲基化检测作为CRC的筛查方法特异度不高,不过通过分析以上的研究发现SEPT9基因甲基化在CRC的分期及预后方面有重要的价值[41]。因此,SEPT9基因甲基化应该是CRC患者治疗后监测、预后效果及复发情况一个比较有价值的指标,有关这方面的研究结果,尚需研究者的进一步努力。