丝光椋鸟肠道微生物组成特征及其影响因素研究

吴玉芬，苏英钰，胡晓龙，张微微*

（1.华南农业大学 林学与风景园林学院，广东 广州 510642；2.江西农业大学 野生动植物与自然保护地研究中心，江西 南昌 330045）

【研究意义】肠道微生物及其群落具有多样性，它们大多数存在于人和动物的胃肠道中[1]，参与人类和动物的生命活动。动物的肠道是一个独特的微生态系统[2]，通过了解动物肠道微生物在宿主体内的群落组成动态与环境之间的关系，有利于开展动物保护的研究[3-4]。【前人研究进展】鸟类作为一个进化成功且在世界上占据着广泛生态位的世系代表，其现存物种超过10 000种[5]；和其他脊椎动物一样，鸟类肠道中也含有参与体内免疫、营养和代谢等功能的各种微生物[5]。相较于哺乳动物，鸟类直肠短、鸟巢高度复杂的环境及野生鸟类多样的饮食类型、飞行习性和发育策略[6-12]，使得鸟类的肠道菌群可能更具高可塑性且组成更复杂[9,13]。然而，鸟类肠道微生物的研究相对滞后，相关研究数量仅占脊椎动物肠道微生物研究的十分之一[14]。目前鸟类肠道菌群的研究中，大多集中于鸭科（Anatidae）和雉科（Phasianidae），并且以家禽为主[14-16]。野生鸟类肠道微生物研究较少，其中一个主要原因是野外采集的粪便难以区分个体。鸟类肠道微生物群落的门组成大致相似，但不同鸟种、或同一鸟种不同个体的肠道微生物组成会存在一定变化。有研究[17]表明，斑头雁（Anser indicus）的雏鸟和成鸟肠道微生物含量最高的前5个门种类及其各自含量有较大的变化；白额雁（Anser albifrons）的肠道微生物因时空变化、食性差异，其肠道微生物组成及微生物群落间的互作等都存在明显的差异[16]；Hird 等[18]研究表明微生物群落更多的是环境中的微生物，而不是鸟类本身的特征。综上所述，影响鸟类肠道微生物菌群因素为多方面的，包括内源因素与外源因素。因此，对野鸟肠道微生物及其与年龄、性别、环境等之间的关系研究有助于了解内源、外源因素对鸟类肠道微生物群落组成结构的影响和塑造作用，进而根据微生物群落特征对鸟类进行更好的保护。【本研究切入点】丝光椋鸟隶属于雀形目、椋鸟科（Sturnidae），是单型种，无亚种分化[19]，为我国南方一种常见食虫庭园鸟，广泛分布于华东和东南地区[19-20]。目前对丝光椋鸟的研究主要集中在食性分析及消化道形态特征[21-22]、代谢及体温调节[23]、种内巢寄生现象及繁殖行为[24-25]、越冬时的夜栖集群行为[26]、遗传进化[27]等方面，然而，其肠道微生物的研究尚未见报道。【拟解决的关键问题】试验拟对丝光椋鸟肠道微生物组成及其影响因素进行探究，以初步明晰丝光椋鸟肠道微生物群落组成特征及其与性别、空间的关系，为该物种以及雀形目鸟类的肠道微生物研究提供基础资料。

1 材料与方法

1.1 样品采集

2019 年至2020 年5 月在江西省南昌花鸟市场、向塘、德兴市海口镇及浙江省衢州等地收集15 只机场为鸟防设置的鸟网上死亡的、市场死亡的丝光椋鸟个体，取得肌肉组织、肠道内容物，储存在实验室-80 ℃超低温冰箱。样本信息见表1，具体采样点分布见图1。

图1 丝光椋鸟采样点位置Fig.1 Location of sampling points of the Sturnus sericeus

表1 丝光椋鸟样本采样信息Tab.1 Sample sampling information of Sturnus sericeus

1.2 肌肉组织DNA提取、性别鉴定及肠道组织16SrRNA测序

1.2.1 肌肉组织DNA 提取、性别鉴定 肌肉组织的DNA 提取按照生工生物工程（上海）股份有限公司“动物基因组DNA 快速抽提试剂盒”的说明书步骤获取。对组织样本提取出来的DNA 进行性别鉴定，PCR 扩增引物序列为P2和P8[28]，PCR 产物进行10 g∕L琼脂糖凝胶电泳，单条带为雄性，双条带为雌性，每个样本至少重复3次，结果一致后判定性别。

1.2.2 肠道组织16SrRNA 测序 将获得的肠道组织样品送往北京诺禾致源生物信息科技有限公司，经过总DNA 提取、PCR 扩增、产物纯化后，使用Illumina 公司TruSeq DNA PCR-Free Library Preparation Kit建库试剂盒进行文库的构建，构建好的文库经过Qubit 定量和文库检测，合格后，使用NovaSeq6000 进行上机测序。

1.3 数据处理与分析

测序得到的数据，对其进行拼接、过滤，得到有效数据。基于上述有效数据，综合使用Silva 数据库、Unite数据库、PyNAST 软件（Version 1.2）、SVG 软件、Qiime（Version 1.9.1）、R（Version 3.1.0∕Version 2.15.3）和LEfSe软件（Version 1.0）完成。使用Unite数据库，采用Blast方法，选取最优比对结果[29]。使用PyNAST软件（Version 1.2）与GreenGene数据库中的“Core Set”数据信息进行快速多序列比对建立所有OTUs序列的系统发生关系[30]。采用QIIME 软件[31]对16S rRNA 基因测序数据进行分析。使用Uparse v7.0.1001 以97%的识别率将序列分类到相同的操作分类单元（OTU）中。随后，利用SILVA 138数据库对应的mother方法将OTUs注释为微生物类群[32]。

输入物种数目表使用R（Version 2.15.3）绘制稀释曲线；使用SVG软件绘制物种丰度柱形图；使用Qiime（Version 1.9.1）软件计算α 多样性指数，绘制observed_species 指数箱形图；使用R（Version 2.15.3）WGCNA，stats和ggplot2软件包绘制PCoA图进行主坐标分析；使用LEfSe软件（Version 1.0）进一步分析物种差异。所有图片由SVG软件及R（Version 3.1.0∕Version 2.15.3）生成。

2 结果与分析

2.1 丝光椋鸟肌肉样本DNA性别鉴定结果

丝光椋鸟肌肉样本DNA 性别鉴定结果见图2，15 只鸟中，共9 只雌性、6 只雄性，由于江西丝光椋鸟样本（采自南昌、向塘和海口）中雄性样本过少，在后续分析中仅对浙江丝光椋鸟样本进行性别分组。

图2 浙江省（a）、江西省（b）丝光椋鸟肌肉样本DNA性别鉴定结果Fig.2 DNA gender identification results of muscle samples of Sturnus sericeus from Zhejiang Province（a）and Jiangxi Province（b）

2.2 丝光椋鸟肠道内容物样本稀释曲线

本试验测序所有样本总共得到下机数据2 541 334 条reads，经过对样本所得序列进行一系列操作后，组装得到1 127 641 条有效序列，这些序列的平均长度约253 bp，生成了7 292 个OTUs。对上述操作所得的OTUs进行物种注释后，得到物种稀释性曲线（图3）。

图3 浙江省、江西省丝光椋鸟肠道内容物样本稀释曲线Fig.3 Rarefaction curve of intestinal contents samples of Sturnus sericeus from Zhejiang Province and Jiangxi Province

从图中可看出，随着测序条数的增加，有大量物种被发现，当样品序列在近9 298 左右时出现转折点，此时的物种在900左右，此后曲线渐进平坦，说明测序信息可靠，当前测序深度已获得样本的大部分信息，涵盖了绝大多数的微生物，也充分展现了其多样性，保证了后续分析的可靠性[15]。

2.3 丝光椋鸟肠道微生物组成特征

丝光椋鸟肠道微生物群落组成（图4）：在门水平上，含量最高的为变形菌门（Proteobacteria，47.49%）和厚壁菌门（Firmicutes，32.18%），其次是蓝藻门（Cyanobacteria，5.91%）和放线菌门（Actinobacteria，2.38%）、弯曲杆菌门（Campylobacterota，0.73%）等。在纲水平上，含量最高的为γ-变形菌纲（Gamaproteobacteria，44.15%）和杆菌纲（Bacilli，26.32%）。

图4 浙江省、江西省丝光椋鸟肠道微生物相对丰度Fig.4 The histogram of relative abundance of gut microorganisms of Sturnus sericeus in Zhejiang Province and Jiangxi Province

2.4 不同性别丝光椋鸟肠道微生物群落分析

根据性别鉴定结果将浙江省的样本编为雌性组（Femal）与雄性组（Male），通过α多样性指数和PCoA图比较二者之间差异。α 多样性分析结果（图5）表明雄性组内各样品注释到的物种数目差异比较大，平均比雌性组注释到的物种数目要少，雌性组的微生物多样性高于雄性组。从PCoA图中可以发现（图6），雌性组和雄性组样本不存在明显的分离现象，组间差异不显著（R=-0.1151>-1，P=0.779）。

图5 基于observed_species指数的浙江省不同性别丝光椋鸟组间差异Fig.5 The box diagram of Sturnus sericeus with different gender in Zhejiang Province based on observed_species index

图6 浙江省不同性别丝光椋鸟肠道微生物的PCoA距离分析Fig.6 PCoA distance analysis of gut microorganisms in Sturnus sericeus of different gender in Zhejiang Province

2.5 不同地区丝光椋鸟肠道微生物群落差异分析

将浙江省和江西省采集的丝光椋鸟样本分为两组，利用丝光椋鸟肠道微生物群落16Sr RNA基因序列构建UPGMA（Unweighted Pair-group Method with Arithmetic Mean）聚类树，并结合α多样性指数和PCoA图进行分析。结果发现，UPGMA聚类树将两个地区分成了两个大枝，右侧门水平物种丰度分布图可看出两个地区肠道微生物群落结构差异：两地区均以变形菌门和厚壁菌门为优势菌门，但比例差异较大。浙江组（ZJ）的变形菌门（38.2%）与厚壁菌门（34.71%）相差不大，但江西组（JX）变形菌门（66.06%）约为厚壁菌门（27.13%）的2倍（图7）。

图7 基于Unweighted Unifrac距离的浙江省、江西省丝光椋鸟肠道微生物UPGMA聚类分析Fig.7 Gut microorganisms UPGMA clustering tree of Sturnus sericulatus from Zhejiang Province and Jiangxi Province based on Unweighted Unifrac distance

α 多样性中observed_species 指数的箱形图（图8）显示浙江组（ZJ）的组内差异更大，其四分位数及中位数均大于江西组（JX），说明浙江组样品注释到的物种数目差异比较大且平均比江西组样本注释到的物种数目要多；PCoA图中显示（图9），两地的样品存在着明显的分离现象，组间差异显著。

图8 基于observed_species指数的浙江省、江西省丝光椋鸟肠道微生物组间差异Fig.8 Box diagram of gut microorganisms differences of Sturnus sericeus in Zhejiang Province and Jiangxi Province based on observed_species index

图9 浙江省、江西省丝光椋鸟肠道微生物的PCoA距离分析Fig.9 PCoA distance analysis of gut microorganisms of Sturnus sericeus in Zhejiang Province and Jiangxi Province

通过LEfSe软件对两地区差异物种进一步分析，从LDA值分布柱状图来看（图10，LDA Score>4），在江西组中丰度差异显著的Biomarke共12种，在浙江组中丰度差异显著的Biomarker共13种。从进化分支图看（图11），ZJ 组重要微生物群落是变形菌门和蓝藻门，向内“辐射”到β-变形菌纲（Betaproteobacteria）、γ-变形菌纲、蓝藻纲（Cyanophyceae），后到伯克氏菌科（Burkholderiaceae）、假单胞菌科（Pseudomonadaceae）；JX 组中起到重要作用的微生物类群是厚壁菌门和变形菌门，向内“辐射”到芽孢杆菌纲（Bacilli）、梭菌纲（Clostridium）、γ-变形菌纲，后到乳酸菌科（Lactobacillaceae）、梭菌科（Clostridiaceae）、肠杆菌科（Enterobacteriaceae）。

图10 浙江省、江西省丝光椋鸟肠道微生物LDA值分布Fig.10 Histogram of LDA value distribution of gut microorganisms in Sturnus sericeus in Zhejiang Province and Jiangxi Province

图11 浙江省、江西省丝光椋鸟肠道微生物进化分支图Fig.11 Phylogenetic branch graph of gut microorganisms in Sturnus sericeus in Zhejiang Province and Jiangxi Province

3 讨论与结论

3.1 丝光椋鸟肠道微生物组成特征

鸟类肠道微生物主要以变形菌门、厚壁菌门、拟杆菌门（Bcteroidetes）、放线菌门四门为主[33]，其中拟杆菌门和放线菌门含量较低，厚壁菌门和变形菌门含量较高[34]。关于丝光椋鸟肠道微生物的组成，研究结果表明丝光椋鸟肠道微生物主要由厚壁菌门和变形菌门组成，这与其他脊椎动物肠道菌群组成相似[35]，是较普遍和常见的门。厚壁菌门与碳水化合物发酵和多糖降解有关[36]，其发酵产物形成的脂肪酸，可作为能源物质被宿主直接吸收[37]，且厚壁菌门能促进脂肪沉淀[38]，与肥胖有一定的关联。在家鸡的研究中也发现，厚壁菌门与宿主免疫功能呈正相关，可见厚壁菌门在哺乳动物和鸟类中作用相似[39]。变形菌门能利用碳源物质，为宿主积累能量[40-41]，功能高度复杂。丝光椋鸟主要以直翅目、鞘翅目、鳞翅目、半翅目等农林害虫及蜘蛛等为食，是一种南方常见的食虫性鸟类[21]。丝光椋鸟所食用的昆虫体内脂肪（亚麻酸）、蛋白质、糖类（甲壳素、海藻糖等）等含量较高[42-44]，厚壁菌门可促进昆虫多糖的降解，其发酵产物作为能源物质被丝光椋鸟吸收用于生命活动，变形菌门可将食物中的糖类物质积累起来，参与丝光椋鸟的代谢。由此可见丝光椋鸟厚壁菌门与变形菌门相对丰度高，与能源的供给、代谢及免疫功能都存在一定关系。

3.2 性别差异对丝光椋鸟肠道微生物组成的影响

关于丝光椋鸟肠道微生物组成的影响因素，鸟类肠道微生物群落组成受多种因素的影响，内部因素有鸟种的遗传基因、性别和年龄；外部因素如食性、寄生虫等的差异对肠道微生物组成也会造成影响[45-47]。研究首先探讨了性别差异对肠道微生物的影响。各种疾病的常见特征表现为性二型，包括心血管和精神疾病等[48-49]，但性别与鸟类微生物群落构成的关系尚不清楚。目前的研究而言，关于性别对肠道微生物的影响研究结果并不一致[14]。在研究中发现雌性与雄性的丝光椋鸟肠道微生物组间差异并不显著，这与越冬白头鹤（Crus monocha）肠道微生物组成不受性别影响的研究结果一致[14]。但在前期的研究中发现，控制小鼠在特定的遗传背景下，性别差异对小鼠肠道微生物组成存在显著的影响[51]，后续越来越多的研究证明性类固醇激素的高低会影响肠道微生物群落结构的组成[50]。故研究即使控制同一时间、同一地点，每个样本的遗传背景等却难以控制。尽管基于现有的数据，性别对微生物组成没有影响，但由于样本数量不足及不可控制的遗传背景等，后续需要对性别因素进行更深入的研究。

3.3 空间差异对丝光椋鸟肠道微生物组成的影响

除性别外，研究还探讨了空间差异对微生物组成的影响。大量数据发现，环境变化对于塑造微生物群落有重要影响[52]，在不同地区丝光椋鸟肠道微生物的组间差异箱型图中发现，浙江组的组内差异更大，说明浙江衢州样品注释到的物种数目差异比较大，且平均比江西省样本注释到的物种数目要多；在不同地区丝光椋鸟肠道微生物的PCoA 分析也表明丝光椋鸟肠道微生物组成在空间变化下有显著差异。丝光椋鸟在两地均属于留鸟[53]，江西省三面环山，形成一个以鄱阳湖为中心的大盆地，冬冷、春寒、夏热、秋干[54]，浙江省地势由西南向东北倾斜，兼具着平原、丘陵、盆地、山地、海岛和海洋等复杂地形[55]。环境因子和位置的差异使得丝光椋鸟生存环境及可取食食物种类的不同，如花鸟市场样本主要喂食饲料，食品单一；其余地区鸟类采食种子、昆虫等作为食物，种类丰富[21]，可见环境因子和位置的差异引起环境温度及食物的不同，从而对丝光椋鸟肠道微生物群落组成产生重要的影响，这与Hrid 等[14]及董元秋等[18]的研究结果一致。在基于LEfSe（LDA Effect Size）的组间差异分析中，进化分支图表明，浙江组重要微生物群落是变形菌门和蓝藻门，向内“辐射”到β-变形菌纲、γ-变形菌纲、蓝藻纲，后到伯克氏菌科、假单胞菌科；江西组中起到重要作用的微生物类群是厚壁菌门和变形菌门，向内“辐射”到芽孢杆菌纲、梭菌纲、γ-变形菌纲，后到乳酸菌科、梭菌科、肠杆菌科。

在上述讨论中提到厚壁菌门可促进碳水化合物和多糖的降解，厚壁菌门的梭菌科里的梭菌属也可以促进复杂多糖和简单碳水化合物的消化[56-57]，肠杆菌能氧化多种简单有机化合物或发酵糖、有机酸或多元醇，为丝光椋鸟度过寒冷冬季提供能量。乳酸菌与人体的叶酸形成有关，江西组中乳酸菌起重要作用可能有助于促进丝光椋鸟的生殖营养和产前健康。γ-变形菌纲在浙江组和江西组中均起着重要的作用，尤其是假单胞杆菌。有研究[58]表明假单胞杆菌具有左旋酶活性。可见变形菌门的丰度高也可能是为丝光椋鸟越过寒冷冬季提供能量。

3.4 结论

综上所述，基于现有数据，丝光椋鸟肠道微生物群落以变形菌门和厚壁菌门为优势菌门；空间差异对丝光椋鸟肠道微生物群落存在较大的影响；性别差异对肠道微生物群落组成无显著影响。但性别差异对丝光椋鸟肠道微生物组成无显著影响，可能是由于样本量不足及不可控制的变量因素如不同的遗传背景引起的，后续需要控制更为严格的试验背景进行进一步研究。