基于多元统计学方法的维药没食子药材红外光谱研究△

杨青青，米尔扎提·麦麦提，陈星，赵璐，马璇，

1.新奇康药业股份有限公司，新疆 乌鲁木齐 830011；

2.新疆医科大学药学院，新疆 乌鲁木齐 830054；

3.新疆奇沐医药研究院，新疆 乌鲁木齐 830011

没食子是壳斗科植物没食子树Quercus infectorinOliv.幼枝上的干燥虫瘿，是由没食子蜂Cynips gallae-tinctoriaeOliv.寄生而成，主要产于地中海沿岸阿拉伯、土耳其、巴基斯坦等地区[1]。没食子药用历史悠久，是维吾尔族医常用药，维吾尔药物名为莫扎。没食子药性温，入肺、脾、肾经，具有固气、涩精、敛肺、止血的功效[2]。以没食子为原料，采用现代制剂工艺生产的西帕依固龈液，是国家基本药物目录品种，在临床用于治疗口腔疾病，包括牙龈出血肿痛、牙齿松动、咽喉肿痛、疮疡腐烂、伤口不愈等。

没食子化学成分复杂，主要含有固醇类、黄酮类、生物碱类、鞣质类、挥发油、皂苷、蒽醌类等[3]。在这些成分中，以鞣质为主，占总成分的50%～70%[4-5]，迄今，已确定了约10 种鞣质类化合物[4]。中药化学组成复杂，常用的定量检测方法只测定其中的1 种或者几种成分，存在着一定局限性；另外，采用大型精密仪器测定多成分含量的成本较高，检测样品需要进行前处理、建立方法较费时、整体操作繁琐，且过程中使用一定毒性试剂的情况较多，长期使用对环境不利。红外光谱技术具有灵敏度高、特征性强、快速、无损等特点，具有较强的整体性、客观性、科学性，能反映药材内部复杂成分峰的叠加，一定程度上也可以反映药材大类成分及其比例，故可较全面地体现药材的质量。有关没食子药材的红外鉴别结合多元统计分析在其质量差异方面的研究未见报道。因此，本研究构建了不同来源没食子药材的红外光谱，采用二阶导数红外光谱和多元统计相结合的方法对25 批没食子药材进行了鉴别，以补充其鉴别信息，使研究结果能够相互印证，为分析和评价其质量差异提供参考。

1 材料

1.1 样品

没食子药材共25批（编号S1～S25），其中S1～S5来源于广西玉林市、S6～S10 来源于广东广州市、S11～S15来源于安徽亳州市，采购时间为2019—2021年；S16～S20产于伊朗哈吉阿巴德、S21～S25产于土耳其约兹加特，采购时间为2018—2020 年。所有药材经新疆维吾尔自治区药品检验研究院苏来曼·哈力克主任药师鉴定，均为壳斗科植物没食子Gall ofQuercus infectoriaOliv.。

1.2 试药

溴化钾（光谱纯，批号：20200408）、无水乙醇（分析纯，批号：20220528）均购于天津市鑫铂特化工有限公司；水为纯净水。

1.3 仪器

Spectrum Two 型傅里叶变换红外分光光度计（美国PekinElmer 公司）；YP-15 型粉末压片机[中世沃克（天津）科技发展股份有限公司]；FW-80 型粉碎机（北京市永光明医疗仪器有限公司）；ME204T型万分之一电子天平[梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司]。

2 方法与结果

2.1 红外光谱的建立

2.1.1 样品制备与数据处理 除去没食子药材中的杂质，粉碎，200 目过筛，密封保存，存放在干燥处。将没食子样品粉末3 mg与干燥溴化钾300 mg研磨混合；将混合好的样品150 mg 放入专用压片模具中，以30 MPa压制3 min，得到1块均匀、半透明的薄片，同法制备溴化钾作为空白片。数据处理通过利用Spectrum 5.0.1 软件，二阶导数红外光谱处理参数：平滑点13。

2.1.2 测定条件 傅里叶变换红外分光光度计扫描范围为4000～400 cm-1，设置自动扣除CO2和H2O 的干扰，扫描频率为16 次/s，扫描速度0.2 cm·s-1，光谱分辨率4 cm-1，实验室环境温度为25～30 ℃，相对湿度为25%～40%。

2.1.3 精密度试验 将没食子样品（编号S1）的粉末按2.1.1 项下的步骤配制，按2.1.2 项下条件，连续测6 次，并用Spectrum 软件进行红外光谱图对比。结果表明，该方法的红外光谱相关系数分别为1.000 0、0.998 4、0.996 9、0.997 1、0.998 6、0.998 1，RSD 为0.11%，说明该方法的精密度较好。

2.1.4 重复性试验 取没食子样品（编号S1）的粉末6 份，按2.1.1 项下方法配制供试样品片，按2.1.2 项下条件进行测定，并用Spectrum 软件进行红外光谱图对比。结果显示，谱间相关系数为1.000 0、0.998 4、0.996 9、0.996 2、0.996 2、0.995 5，RSD为0.16%，表明方法重复性良好。

2.1.5 稳定性试验 将没食子样品（编号S1）粉末体按2.1.1 项下方法配制成试样，置于干燥器中，分 别在0、30、60、90、120、150、180 min，按2.1.2 项下方法测定，并用Spectrum 软件进行红外光谱图对比。结果显示，谱间相关系数分别为1.000 0、0.997 8、0.995 0、0.992 3、0.989 9、0.987 2、0.986 6，RSD为0.52%。说明该样品在常温下放置180 min，其稳定性较好。

2.1.6 红外光谱数据分析 采用2.1.1 项下方法，将25 批食子样品粉末制成供试样品片，并按2.1.2项下条件进行测定，利用Spectrum 软件采集以上药材样品的红外光谱图进行比对，共获得25 批没食子药材的红外光谱图，结果见图1。研究表明，25 批次没食子样品的红外光谱图的相关系数为0.932 7～0.995 6；所得的红外光谱图峰形、峰位基本相似，表明不同来源的没食子药材中的化学成分相近，所含的特征峰和形态基本相同，而指纹区（900～1800 cm-1）则有明显的差别。利用OMNIC 8.2软件对25批没食子样品的红外光谱图进行了分析，并将其透过率转化为吸光度，从而得出了不同来源没食子药材的平均红外光谱图，见图2。

图1 25批没食子药材样品的红外透过率叠加光谱

图2 不同来源没食子样品的平均红外光谱图

将不同产地没食子进行吸光度处理后，发现25批没食子药材样品有18个峰（图2）。中药没食子粉末主要在3380、2928、2832、2714、1718、1612、1534、1448、1374、1315、1197、1081、1027、868、757、651、590、526 cm-1附近出现吸收峰。O-H 基的伸缩振动值为3650～3200 cm-1，是判断是否存在醇类、酚类和有机酸的主要依据。当醇和酚溶于非极性溶剂（如CCl4），在3650～3580 cm-1处出现游离O-H 基的伸缩振动吸收峰，峰形较尖，不受其他吸收峰的影响，容易辨认。随着样品浓度的增大，羟基化合物出现结合现象，O-H 基的伸缩振动吸收峰向低波数偏移，并在3400～3200 cm-1处形成了一个较大的吸收峰[6-7]；在该实验中，3400～3200 cm-1的大吸收峰是分子间氢键O-H 伸缩振动吸收峰。在3000 cm-1以下，存在着饱和C-H 伸缩振动，而在3000～2800 cm-1处，取代基对C-H 伸缩振动偏移影响不大；在2928 cm-1处，是亚甲基C-H 反对称伸缩振动吸收峰；在2832 cm-1处，是亚甲基C-H 的对称伸缩振动吸收峰[8-9]。在2714 cm-1处存在醛基伸缩振动吸收峰。在1900～1650 cm-1处，C=O 产生伸缩振动，这是一种非常典型的红外光谱，可以很好地分辨出酮类、醛类、酸类、酯类及酸酐等有机物质。由于振动耦合作用，酸酐的羰基吸收带呈现出双峰。在1718 cm-1处，吸收峰为C=O伸缩振动峰，如羧酸类和酯类[10]。在1612、1448 cm-1处对应苯环骨架伸缩振动的吸收峰，结合1718 cm-1位置的峰特征，推测其为鞣质类化合物，与文献中所报告的没食子中所含的化学成分相符[2,11-13]。1534 cm-1主要表现为N-H的弯曲振动和C-N的伸缩振动，是蛋白酰胺Ⅱ带吸收峰[10]。1374 cm-1的谱带为甲基的C-H 对称弯曲振动。结合1718 cm-1处酯羰基，1197 cm-1可能为丙酸伸缩振动峰。谱图中1300～1100 cm-1处存在较强的C-O 吸收峰，1900～1650 cm-1具有较强的C=O 吸收峰，这说明其为典型的羧酸酯类化合物。在1081、1027 cm-1处，吸收峰为糖类和糖苷类成分中的C-O 伸缩振动峰。糖环振动吸收峰值为1000～800 cm-1，糖骨架振动吸收峰值为1200～1000 cm-1[14-15]，没食子药材红外光谱峰归属详见表1。

表1 没食子药材红外光谱峰归属

2.1.7 没食子的二阶导数红外光谱分析 二阶导数红外光谱可以分离出原光谱中的一些相互重叠的吸收峰，从而提高了谱的分辨率。从图3 可以看出，在2928、2832 cm-1的亚甲基伸缩振动吸收峰原光谱中并不明显，在红外导数图谱中，可以很明显地确认。1800～1600 cm-1没食子二阶导数图可以将其在原谱图上重叠的红外吸收峰区别开，出现具有特征的三峰等。在1580～1420、1200～950 cm-1波段的谱峰特征有明显增加，1362 cm-1处在原光谱中不明显的肩峰在二阶导数图谱中表现出了不同来源没食子的差异性。

图3 没食子药材不同来源平均二阶导数红外光谱图

2.2 正态分布分析

以1027 cm-1最大吸收峰值为参考，通过Spectrum软件对共有峰峰高进行归一化处理，得出了1 个共有峰的相对峰高，由于3380 cm-1是O-H 的吸收峰，在1900～1700 cm-1处以酯类成分为主，在1700～1500 cm-1处以酸类成分为主，在1200～800 cm-1处以糖类成分为主，其余4个波数是没食子药材红外光谱中最强的吸收峰，在上述3个波段内，选取了6个共有峰进行了分析。由图4可知，1612 cm-1处5个不同来源没食子药材样品区分开来，采用Microsoft Excel 2016软件，以不同来源没食子药材样品1612 cm-1处吸收峰的相对峰高比值为横、纵坐标绘制正态分布曲线，见图5。由图5可知，广西和安徽没食子药材的正态分布曲线不相交，说明两者之间的质量有显著的差别；中国广西、广东的没食子药材与伊朗来源的没食子药材正态分布曲线有相交，说明它们之间的样品质量接近。

图4 不同来源没食子样品中6个共有峰的相对峰高

图5 不同来源没食子样品的正态分布曲线

2.3 聚类分析

从25 批没食子药材样品18 个峰中选取11 个特征 峰（3380、1718、1612、1534、1448、1374、1315、1081、1027、868、757 cm-1附近处吸收峰），以其相对峰强度为原始数据，将数据导入SPSS 22.0软件进行分析，采用组间连接法，以平方Euclidean距离为分类依据，对样品进行系统聚类分析，见图6。由图6可知，当组间距离为10～15时，25批没食子药材样品可聚为4 类，其中S1、S2、S4、S5、S9、S11、S13、S16、S17、S19、S24 聚为一类，S6、S7、S8、S10、S12、S15、S18、S20、S21、S22、S23聚为一类，S3、S25聚为一类，S14聚为一类。

图6 25批没食子药材样品的聚类分析树状图

2.4 主成分分析

主成分分析是多个变量变换以选出较少重要变量的一种统计学方法，目前已被广泛用于数据统计分析[16]。以25 批没食子药材样品中11 个特征峰的相对强度为原始数据，通过SPSS 22.0 软件进行降维因子分析。结果显示，前4 个主成分的累积方差贡献率为89.565%＞85%，充分地反映没食子样品中11个特征峰的基本特征和主要信息，故选取特征值＞1的前4 个主成分特征值，分别为4.659、2.736、1.920、1.433（表2），前4 个因子斜率陡峭，后趋于平缓（图7），故将前4 个因子作为主成分进行分析。按公式（1）计算综合得分，综合得分是以各主成分的方差贡献率为权重，对主成分得分和对应权重进行加权平均，可反映没食子药材的质量，较高得分表示其质量较好。在25 批没食子药材中，广西来源的综合得分最高，而安徽来源的综合得分最低，结果见表3。

表2 25批没食子药材主成分特征值与方差贡献率

表3 25批没食子药材样品的综合得分

图7 没食子药材的主成分分析碎石图

式中A1（主成分1）、A2（主成分2）、A3（主成分3）、A4（主成分4）是4个主成分的新变量名。

2.5 正交偏最小二乘法-判别分析（OPLS-DA）

将25 批没食子样品共有峰的相对峰面积导入SIMCA 14.1 软件，进行OPLS-DA，结果见图8，25批没食子样品可很好地聚类为4 类，与聚类分析、主成分分析结果一致。提取OPLS-DA 模型中11 个变量的变量重要性投影（VIP）值并从大到小排序，以VIP 值＞1 为引起没食子药材批次间差异的主要标志性成分，是区分样品最关键的色谱峰，对样品分类作用较大[17-19]，结果见图9。共筛选出5 个影响没食子药材质量的关键波数，其VIP 值从大到小对应的波数依次为1614（1.316 3）、1373（1.117 4）、1535（1.082 2）、1027（1.070 6）、1079（1.025 1）、1448（1.012 4）cm-1，其中1614、1535 cm-1处为酸类成分的特征吸收峰，1079、1027 cm-1处为糖苷类成分的特征吸收峰。

图8 25批没食子药材样品的OPLS-DA得分图

图9 25批没食子药材共有峰波数的VIP值

3 讨论

傅里叶变换红外光谱是鉴别化学物质结构常用的方法，将其应用于中药类鉴别可避免复杂的样品前处理，且具有快速、样品无损等优点，可以对中药所含化学物质进行整体、有效地分类识别。本研究建立了红外光谱法测定没食子药材的方法，并进行了方法学考察，结果显示，该方法的精密度高、重复性好、在0～180 min 内稳定性较好。同时，在进行该方法的建立时，还考察了样品的压片情况，试验了100、150、200 mg 压片，结果表明，100 mg的样品量较少，压片成形性不好；200 mg 压的片较厚，透明度较差；150 mg 压片成型与透明度较好，最后，确定了压片使用的样品量为150 mg。此外，还考察了样品与溴化钾压片的比例（1∶100、1∶150、1∶200），其中1∶100的比例效果最佳。

通过对25 批没食子药材样品正态性分析可知，广西来源与安徽来源没食子药材质量存在明显差异，中国广西、广东来源没食子药材与伊朗来源药材样品质量相近。聚类分析将波数相似大的药材聚为一类，结果聚为4 类。根据主成分分析结果可知，广西来源没食子药材的综合得分最高，安徽来源没食子药材的综合得分最低。OPLS-DA 模型与聚类分析结果一致，VIP值分析得到了5个影响没食子药材质量的关键波数，其中1614、1535 cm-1处为鞣质类、蛋白质类成分的特征吸收峰，1079、1027 cm-1处为糖苷类成分的特征吸收峰。

本研究结果显示，没食子红外光谱图、二阶导数红外光谱、结合正态分布、聚类分析、主成分分析和OPLS-DA，结果相互补充和印证，该方法可对不同来源的没食子药材进行快速鉴别，本研究结果丰富了没食子药材的质量评价体系，为药材鉴别提供了一种新的方法。