基于“辨状论质”理论对唐古特大黄外观性状与内在质量的相关性研究△

唐进程，祁晓娟，赵江怡，张媛，2，刘凤波，2，赵婷，2*，魏胜利，2*

1.北京中医药大学 中药学院，北京 102488；

2.中药材规范化生产教育部工程研究中心，北京 100102

大黄为蓼科大黄属植物掌叶大黄Rheum palmatumL.、唐古特大黄R.tanguticumMaxim.ex Balf.或药用大黄R.officinaleBaill.的干燥根及根状茎，具有泻下攻积、凉血解毒、逐瘀通经等功效，临床上主要用于实热便秘、积滞腹痛、泻痢不爽等[1]。大黄应用广泛，是常用大宗药材之一，也是传统的出口中药材之一[2-3]。

对中药材的质量评价主要包括外观性状和内在成分两方面，其中传统性状特征在鉴别中药材真伪优劣和保障临床用药安全有效方面发挥着重要作用。大黄传统以根粗大、质坚实、颜色棕红或黄色、味苦为佳[4-5]。而对于大黄的内在质量，已有研究认为双蒽酮类和结合蒽醌类成分是其发挥泻下攻积功效的主要成分[6-7]，游离蒽醌类是其发挥清热泻火功效的主要成分[8]，而鞣质类成分是其发挥逐瘀通经功效的主要成分[9]。但是，以上大黄的外在性状与其内在质量之间有无显著的相关性、能否基于“辨状论质”理论对大黄质量进行快速综合的评价还有待进一步研究。代婉莹等[10]研究了铨水大黄外观性状与5个蒽醌类成分含量的关系，刘书斌等[11]基于性状与灰色关联法对不同规格大黄饮片质量进行比较研究，结果均表明，大黄的外观性状与成分含量有一定的相关性。但是，上述研究中大黄颜色、硬度、味道等性状指标的数量化和系统性不足；另一方面，由于大黄在野生资源为主时期的主流药用部位是根状茎，所以优质大黄的性状特征主要指根状茎，而目前栽培大黄的主要药用部位既有根状茎也有根，过去“辨状论质”的颜色、粗度和硬度是否适合栽培药材，目前未见报道。本研究以栽培4 年的唐古特大黄为研究对象，在大范围取样的基础上，系统探讨大黄部位（根状茎及不同粗度的根）、硬度、颜色、苦味与主要药效成分5 个游离蒽醌（大黄素、芦荟大黄素、大黄酸、大黄酚、大黄素甲醚）、番泻苷A、番泻苷B、没食子酸、儿茶素、总蒽醌含量之间的相关性，旨在为唐古特大黄的“辨状论质”理论提供实验支撑，为建立客观、科学的唐古特大黄质量评价方法提供参考。

1 材料

1.1 样品

在青海、四川、甘肃3 个省的栽培试验地采集4 年生唐古特大黄7 批，经北京中医药大学中药学院魏胜利教授鉴定为唐古特大黄Rheum tanguticumMaxim.ex Balf.。为了探究药材部位与内在质量的相关性，处理样品时将每批大黄药材根状茎和根分开加工，根按照直径分为＜3 cm、3～5 cm、＞5 cm 3个水平[12]，60 ℃烘干48 h，用于后续实验的测定。28 份样品信息见表1。

表1 唐古特大黄样品信息

1.2 试药

对照品没食子酸（批号：Y19M8C36143）、儿茶素（批号：P20O7F23087）、番泻苷A（批号：P01S8F42887）、番泻苷B（批号：Y23M8Y17128），大黄酸（批号：T30A8F42628）、大黄酚（批号：T23A8F42188）、大黄素（批号：C18F8Q29652）、芦荟大黄素（批号：T28D6F8264）、大黄素甲醚（批号：T26A8F34784），纯度均≥98%，均购自上海源叶生物科技有限公司；水（杭州娃哈哈集团有限公司）；甲醇、浓盐酸、三氯甲烷（分析纯，北京化工厂）；甲醇、乙腈（色谱级，赛默飞世尔科技有限公司）；磷酸（色谱级，天津市光复化工研究所）。

1.3 仪器

CM-5 型分光测色仪（日本柯尼卡美能达有限公司）；α-Astree Ⅱ型电子舌（法国Alpha MOS 公司）；TMS-PRO 型质构仪（北京盈盛恒泰科技有限责任公司）；e2695 型高效液相色谱仪（美国Waters公司）；KQ5200D 型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；RE-3000 型旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器有限公司）；BT 25S 型十万分之一电子分析天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司）；AL204型万分之一电子分析天平[梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司]；FW100 型高速万能粉碎机、LG-01型手提式高速粉碎机（瑞安市百信制药机械有限公司）；JA31002 型电子天平（上海衡平仪器仪表厂）；DZTW型电子调温电热套（北京鑫润科诺仪器仪表有限公司）；0201001 型游标卡尺（上海三圈刃具销售有限公司）；KD0248 型切片铡刀（广州膳道信息科技有限公司）。

2 方法

2.1 性状特征客观量化

2.1.1 粗度 将唐古特大黄分为根状茎和根，使用游标卡尺测量唐古特大黄根的直径，按＞5 cm、3～5 cm、＜3 cm 进行分类。

2.1.2 硬度

2.1.2.1 测定方法 以上述干燥唐古特大黄的根与根状茎为材料，根据前期预实验结果，选择采用穿刺法对药材硬度进行测定。

2.1.2.2 条件 采用P/2n 针状探头（直径2 mm）；力量感应元量程：1000 N；分辨率：0.01 N；起始力：1.5 N；试验检测速度：30 mm·min-1；穿刺距离：15 mm；回程速度：40 mm·min-1；回程距离：20 mm。将样品放置在水平台上，通过探头下压直至样品达到设定的穿刺深度，每批样品重复测试3次。

2.1.2.3 精密度考察 取同一供试品，按2.1.2.2项下条件重复测定6次，记录硬度值，RSD为0.85%，表明仪器精密度良好。

2.1.2.4 样品测定 按照2.1.2.2 项下条件重复测定9次，记录硬度值。

2.1.3 颜色 按本课题组前期建立的方法[13]，采用分光测色仪测定唐古特大黄样品的明度值（L*）、红色值（a*）、黄色值（b*）。

2.1.4 味道 大黄味苦，因此本研究只测定样本的苦味值（SCS）。

2.1.4.1 电子舌分析条件 电子舌经过诊断、预平衡、校准，确保仪器采集的数据可靠、稳定。采集温度：25 ℃；采集时间：120 s；采集周期：1 s；搅动速度：1 r·s-1；清洗液：纯化水。正式检测前用清洗液清洗传感器30 s，重复5 次。样品体积25 mL，每份样品按照上述条件平行测定9次，取后3次测定结果进行数据分析。

2.1.4.2 供试品溶液的制备 取药材0.5 g，加入沸水50 mL，煎煮10 min，趁热滤过，滤液加蒸馏水定容至50 mL，5000 r·min-1离心10 min（离心半径为4 cm），取上清液，0.45 μm微孔滤膜滤过，取滤液25 mL于样品杯中测定。

2.2 药效成分含量测定

按本课题组前期建立的方法[14]测定大黄素、大黄酸、芦荟大黄素、大黄素甲醚、大黄酚、番泻苷A、番泻苷B、没食子酸、儿茶素9个成分（以下简称9 个成分）的含量。采用《中华人民共和国药典》（以下简称《中国药典》）2020 年版（一部）[1]大黄药材游离蒽醌、总蒽醌的含量测定方法，分别测定水解前游离蒽醌和水解后游离蒽醌含量，总蒽醌含量为5 个水解后游离蒽醌含量之和，按公式（1）计算5 个结合蒽醌（大黄素苷、大黄酸苷、芦荟大黄素苷、大黄素甲醚苷、大黄酚苷）含量。

2.2.1 对照品溶液的制备

2.2.1.1 9 个成分对照品溶液的制备 分别精密称取芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚、番泻苷B、番泻苷A 对照品适量，加甲醇定容，配制成质量浓度分别为0.233 0、0.225 0、0.172 0、0.242 0、0.176 0、0.278 0、0.372 0 mg·mL-1的对照品储备液；分别精密称取没食子酸、儿茶素对照品适量，加甲醇定容，配制成质量浓度分别为0.092 8、0.147 6 mg·mL-1的对照品储备液。

2.2.1.2 总蒽醌对照品溶液的制备 按《中国药典》2020 年版（一部）[1]大黄药材总蒽醌含量测定项下对照品溶液制备方法制备。

2.2.2 供试品溶液的制备

2.2.2.1 9 个成分供试品溶液的制备 精密称取样品粉末0.25 g，置具塞三角瓶中，精密加入60%甲醇25 mL，称定质量，超声提取1 h（200 W，40 Hz），放冷，称定质量，用60%甲醇补足损失的质量，摇匀，0.22 µm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.2.2.2 总蒽醌供试品溶液的制备 按《中国药典》2020年版（一部）[1]大黄药材总蒽醌、游离蒽醌含量测定项下供试品溶液制备方法。

2.2.3 色谱条件 Agilent ZQRBA SB-C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈（A）-0.05%磷酸水（B），梯度洗脱（0～5 min，2%～10%A；5～13 min，10%～15%A；13～20 min，15%～16%A；20～25 min，16%～22%A；25～30 min，22%～23%A；30～36 min，23%～24%A；36～45 min，24%～26%A；45～55 min，26%～36%A；55～61 min，36%～60%A；61～86 min，60%～80%A）；流速：1.0 mL·min-1；检测波长：254 nm；柱温：40 ℃；进样体积：10 μL。该条件下对照品及供试品色谱图见图1。总蒽醌及5个结合蒽醌含量测定流动相洗脱条件按《中国药典》2020 年版（一部）[1]大黄中总蒽醌含量测定项测定，该条件下对照品及供试品色谱图见图2。

图2 5个蒽醌类成分对照品及唐古特大黄供试品色谱图

2.3 统计分析方法

采用SPSS 26.0 软件对数据进行分析，对唐古特大黄外观性状指标（粗度、硬度、颜色、苦味）与主要药效成分（5 个游离蒽醌及其苷类、番泻苷A、番泻苷B、没食子酸、儿茶素、总蒽醌）含量进行相关性分析和聚类分析，绘制聚类图。

3 结果

3.1 外观性状指标测定结果

对唐古特大黄不同药用部位的硬度、颜色、苦味3 项性状指标进行量化测定（表2）。方差分析结果表明，不同部位的硬度、a*、b*、SCS 差异有统计学意义（P＜0.05）。多重比较结果表明，根状茎的以上4个指标水平均显著高于3～5 cm根及＜3 cm根（P＜0.05），且与＞5 cm 根的差异无统计学意义。以上结果表明，根状茎的外观性状与＞5 cm 根差异无统计学意义，而与3～5 cm 根及＜3 cm 根的差异有统计学意义（P＜0.05）。

表2 唐古特大黄根状茎及各粗度根外观性状指标测定结果（±s,n=7）

表2 唐古特大黄根状茎及各粗度根外观性状指标测定结果（±s,n=7）

注：不同小写字母表示P＜0.05；表3同。

3.2 药效成分指标测定结果

对唐古特大黄根状茎及各粗度根药效成分含量进行测定（表3）。方差分析结果表明，不同部位的没食子酸、番泻苷B、芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚、大黄酚苷、大黄素甲醚苷及总蒽醌含量差异有统计学意义（P＜0.05）。多重比较结果表明，根状茎的没食子酸含量显著低于＜3 cm根（P＜0.05），番泻苷含量显著高于各粗度根（P＜0.05），芦荟大黄素、大黄酸含量显著高于＜3 cm 根（P＜0.05），大黄酚、大黄素甲醚及总蒽醌含量显著高于3～5 cm根及＜3 cm根（P＜0.05），大黄酚苷含量显著高于3～5 cm根（P＜0.05），大黄素甲醚苷含量显著低于各粗度根（P＜0.05）。以上结果表明，根状茎的药效成分含量与各粗度根差异有统计学意义（P＜0.05），且与3～5 cm根及＜3 cm根的差异较为明显。

表3 唐古特大黄根状茎及各粗度根药效成分质量分数（±s,n=7）%

表3 唐古特大黄根状茎及各粗度根药效成分质量分数（±s,n=7）%

3.3 性状指标与药效成分含量的相关性分析

相关分析结果表明，唐古特大黄外观性状与部分药效成分含量之间存在显著的相关性（图3）。根粗度与大黄酸、大黄酚、大黄素甲醚、总蒽醌含量呈极显著正相关（P＜0.01），与大黄素含量呈显著正相关（P＜0.05），与没食子酸含量呈显著负相关（P＜0.05）。根硬度与大黄酸含量呈极显著正相关（P＜0.01），与番泻苷B、大黄素、大黄酚含量呈显著正相关（P＜0.05）；根的L*与番泻苷A含量呈极显著负相关（P＜0.01），a*与没食子酸含量呈极显著负相关（P＜0.01），b*与大黄酚含量呈显著正相关（P＜0.05）；根的SCS与没食子酸、番泻苷A 含量呈极显著负相关（P＜0.01）。上述性状指标与药效成分含量在根茎中的相关趋势与根一致。但也有部分性状指标与药效成分含量的相关趋势在根与根茎之间有所差异。根的a*与大黄酚、大黄素甲醚含量呈显著正相关（P＜0.05），b*与大黄素甲醚含量呈显著正相关（P＜0.05）；根的SCS与大黄素甲醚含量呈显著正相关（P＜0.05）。上述性状指标与药效成分含量在根茎中的相关趋势与根相反。这表明在一定范围内，根及根状茎的粗度和硬度越大、颜色偏橙色且暗（L*小，a*、b*大）、苦味越小，药材中的没食子酸、番泻苷A、番泻苷B、大黄酸、大黄素及总蒽醌含量就越高。不同的是，大黄酚、大黄素甲醚均在颜色偏橙色（a*、b*大）的根中含量较高，大黄酚在颜色偏黄色（a*小、b*大）的根状茎中含量较高，大黄素甲醚在颜色偏褐色（a*、b*小）的根状茎中有较高含量。

图3 唐古特大黄外观性状与化学成分的相关性分析

3.4 聚类分析

聚类分析结果显示，28 个唐古特大黄样品可以分为3类（图4），各类唐古特大黄的外观性状指标及各类成分质量分数见表4。S6-G1、S17-GJ、S5-GJ、S13-GJ、S10-G1、S18-G1、S9-GJ、S1-GJ、S2-G1、S22-G1、S24-G3、S28-G3、S26-G1、S27-G2聚为第1 类，该类唐古特大黄部位主要为根状茎及＞5 cm根，硬度大，颜色偏橙（a*、b*大），苦味小，结合蒽醌及蒽酮总量、游离蒽醌总量均高于其他唐古特大黄，表明该类大黄在发挥泻下攻积和清热泻火功效上具有潜在优势。S15-G2、S20-G3、S7-G2、S16-G3、S8-G3、S19-G2、S11-G2、S12-G3、S3-G2、S4-G3 聚为第2 类，该类唐古特大黄部位主要为3～5 cm 及＜3 cm 根，硬度小，颜色偏黄（b*大），苦味小，鞣质总量为3类唐古特大黄中最高，说明该类大黄在发挥逐瘀通经功效上具有潜在优势。S21-GJ、S23-G2、S14-G1、S25-GJ 聚为第3 类，该类唐古特大黄硬度小，颜色偏淡（L*、b*小），其味较苦，游离蒽醌总量次于第1 类，鞣质总量、结合蒽醌及蒽酮总量均为3 类唐古特大黄中最低，表明该类大黄总体质量较差。值得注意的是，第1 类唐古特大黄中除S24-G3、S28-G3、S27-G2外，其他样品均为根状茎或者＞5 cm 根，这表明根状茎与＞5 cm 根在外观性状及化学成分上较为相似，这与外观性状及药效成分含量方差分析结果一致。

图4 唐古特大黄样品聚类图

表4 不同类唐古特大黄外观性状指标及各类成分质量分数（±s,n=7）

表4 不同类唐古特大黄外观性状指标及各类成分质量分数（±s,n=7）

4 讨论

“辨状论质”是一种快速辨别中药材品质的方法，在判断药材质量优劣方面发挥着重要作用。《本草经集注》记载大黄“味甚苦，色至浓黑为佳”[15]。《中国药典》1963 年版记载“大黄，传统以质坚实、红棕色、味苦为佳”[4]。《中国药典》2020 年版对大黄的性状描述为“质坚实、断面淡红棕色或者黄棕色、味苦”[1]。本研究结果表明，唐古特大黄外观性状与其内在药效成分（没食子酸、番泻苷A、番泻苷B、芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚、大黄酚苷、大黄素甲醚苷、总蒽醌）具有显著或极显著的相关性，优质的唐古特大黄部位多为＞5 cm 的根及根状茎，往往具有硬度大、颜色偏橙、苦味小的性状特点。其中，硬度大与传统评价经验“质坚实”相符合。代婉莹等[10]研究表明，无糠芯大黄中蒽醌含量较高，侧面反映硬度大的大黄质量较好；颜色偏橙与部分本草记载中相符，也有其他研究表明颜色偏红黄且暗的大黄中蒽醌含量较高，质量较优[10-11,16]，与本研究结果一致。以上表明，传统经验在辨别优质药材时是非常实用的。但是，也有一些传统经验性状指标存在值得商榷之处，如大黄传统经验以“味苦为佳”则与本研究结论不符，后续需要通过进一步研究加以验证。

对根状茎和根之间的外观性状与药效成分含量进行方差分析，结果发现，根状茎的外观性状与＞5 cm根差异无统计学意义，而与3～5 cm 根及＜3 cm 根差异无统计学意义（P＜0.05）；根状茎中大部分药效成分含量与＞5 cm根差异无统计学意义，而与3～5 cm根及＜3 cm 根差异有统计学意义（P＜0.05）。以上结果表明，部位也是影响药材质量的重要因素。相关性分析结果表明，外观性状与药效成分含量相关性趋势在根状茎和根中基本一致，但也有例外，如a*、b*、SCS 与大黄素甲醚含量相关性趋势在两者中相反。

此外，研究还发现不同性状的唐古特大黄内在质量存在不同的特点，如颜色偏淡（L*、a*小）、苦味小的唐古特大黄药材中鞣质总量较高；硬度大、颜色偏橙（a*、b*大）及苦味小的唐古特大黄药材中结合蒽醌及蒽酮总量较高；部位为根状茎及＞5 cm 根，硬度大、颜色偏橙（a*、b*大）、苦味大的唐古特大黄药材中游离蒽醌总量较高。而不同类成分对应不同的药效，大黄中的鞣质类、游离蒽醌类、结合蒽醌及蒽酮类成分分别对应大黄的逐瘀通经、清热泻火及泻下攻积功效[6-9]。因此，可以通过外观性状来选择合适药效的药材，这是对“辨状论质”理论的一种新应用。

本研究基于“辨状论质”理论，探索了唐古特大黄外观性状与主要药效成分含量之间的相关性，以期为完善大黄质量评价体系奠定实验基础，为其他药材“辨状论质”研究提供方法借鉴，为阐释“辨状论质”理论的科学性奠定基础。