重庆市野生黄精中17种氨基酸的分析与评价

罗长琴，肖国生，蒋忠岑，樊汶樵，吴英

（1.重庆市万州食品药品检验所，重庆 万州 404100； 2.重庆三峡学院 生物与食品工程学院，重庆 万州 404100；3.重庆文理学院，重庆 永川 402160）

黄精为百合科（LiliaceaeJuss.）黄精属（Polygonatum）多年生草本植物，为药食两用植物，以根茎入药［1］。目前全世界普遍认可的黄精属有87种，主要分布于北温带和北亚热带国家，我国有40余种，广泛分布于32个省级行政区［2-3］，其中西南地区（四川省、重庆市、云南省、贵州省等）多达23种，是黄精属植物的热点地区和多样性中心［4］。黄精性平味甘，具有润肺健脾，滋阴益肾，提高机体免疫力及降糖、降脂、抗菌、抗病毒和抗肿瘤等作用，常用于治疗脾虚胃弱、糖尿病、高血糖、高血脂、高血压等疾病［5-6］。目前对黄精的文献报道多集中在多糖类和甾体皂苷类［7-9］，对氨基酸类化合物的研究较少。氨基酸作为人体合成蛋白质和形成多种酶、抗体及激素的原料［10］，具有调节营养物质代谢和增强机体免疫功能的作用［11］。王俊杰等人［12］研究发现黄精中富含18种氨基酸，具有可观的食用价值。

目前氨基酸的检测方法主要包括气相色谱法、氨基酸自动分析仪法、高效液相色谱法、离子色谱法等［13-14］，其中氨基酸自动分析仪法，能实现柱后在线衍生，具有操作简单、快捷、安全和准确率高等优势。因此本研究采用氨基酸自动分析仪法对野生黄精的氨基酸类成分进行含量分析，为后续黄精在食品、保健食品的深入开发利用提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 主要仪器

S433D全自动氨基酸测定仪（塞卡姆科学仪器有限公司）；QUINTIX224-1CN分析天平（德国赛多利斯公司）；Milli-Q Advantage A10超纯水机（美国Millipore公司）；SIGMA 3-30离心机（德国SIGMA公司）；Turbovaplv氮吹仪（瑞典Biotage公司）；BPGP240A电热鼓风干燥箱（上海-恒科仪器有限公司）；PB-21型pH计（上海仪电科学仪器股份有限公司）；IKAMS3 digital涡旋仪（德国IKA公司）；KQ-800DB数控超声清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。

1.1.2 主要试剂

柠檬酸三钠、硼酸、乙酸钾、三水乙酸钠、茚三酮、苯酚（优级纯，成都市科龙化学品有限公司）；盐酸、柠檬酸、无水乙醇（分析纯，重庆川东化工集团有限公司）；氢氧化钠、乙酸（优级纯，天津市科密欧化学试剂有限公司）；乙酸钠、抗坏血酸（优级纯，天津市光复科技发展有限公司）；甲醇（色谱纯，迪马科技有限公司）。

17种氨基酸混标（天冬氨酸、苏氨酸、丝氨酸、谷氨酸、脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、胱氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、络氨酸、苯丙氨酸、组氨酸、赖氨酸、精氨酸）浓度为2.5 µmol/L（胱氨酸为1.25 µmol/L），购自德国塞卡姆公司。

1.1.3 样品采集与制备

从重庆市奉节县、万州区、梁平区、石柱县、巫山县等地采集野生黄精根茎样品34份，以湖北省襄阳市种植黄精根茎样品作为参比样品。将样品清洗后切成约1 mm厚的薄片，置于60℃电热鼓风干燥箱中干燥12 h，冷却后用研磨仪制成粉末状，备用。

1.2 方法

1.2.1 标准溶液的配制

吸取氨基酸混标1.00 mL至10 mL容量瓶中，用样品稀释液（pH 2.20的柠檬酸三钠-柠檬酸缓冲溶液）定容至刻度，制成标准中间液，再分别吸取标准中间液0.20、0.40、0.60、0.80、1.00、2.00 mL至于10 mL容量瓶中，用样品稀释液定容至刻度，制成标准曲线系列。

1.2.2 样品溶液的配制

参照GB 5009.124—2016《食品中氨基酸的测定方法》［15］，称取样品0.5 g（精确至0.0001 g）于顶空瓶中，加入6 mol/L盐酸溶液10 mL，加盖，涡旋30 s，置入135℃电热鼓风干燥箱内水解4 h，取出用纯水冲洗水解液至50 mL容量瓶中，并定容至50 mL，混匀，8000 r/min离心5 min备用。取上清液0.20 mL于氮吹管中，50℃水浴氮吹至近干，再加0.50 mL纯水氮吹至近干，加入样品稀释液1.00 mL复溶，超声至残渣溶解，过0.45 µm水相滤膜，待测。

1.2.3 仪器方法

色谱柱：氨基酸专用柱（4.6 mm × 150 mm，7 µm）；进样量：50 µL，波长：440 nm和570 nm；衍生试剂：20 g/L茚三酮溶液；流动相：A为pH 3.45的柠檬酸钠-柠檬酸溶液；B为pH 10.85的柠檬酸钠-氢氧化钠溶液；C为200 g/L氢氧化钠溶液；流动相的梯度比例和流速详见表1，衍生试剂的梯度升温和流速详见表2。

表1 流动相梯度洗脱表Tab.1 Gradient elution table of mobile phase

表2 衍生试剂梯度升温度表Tab.2 Gradient temperature rise table of derivative reagents

1.2.4 数据分析

采用Microsoft Excel 2007软件对数据进行处理，采用SPSS 25软件对数据进行主成分和相关性分析。

2 结果与分析

2.1 方法学考察

2.1.1 系统适应性

取氨基酸标准溶液和样品溶液，按照“1.2.3”中的方法进行测定。结果表明，标准溶液在570 nm处检出的16种氨基酸和在440 nm处检出的脯氨酸均能达到良好的分离度；样品溶液在目标峰处均无杂质峰干扰，说明该方法具有良好的专属性，见图1。

图1 标准品（A）和样品（B）中17种氨基酸色谱图Fig.1 Chromatograms of 17 amino acids in standards and samples

2.1.2 标准曲线及其相关性

取上述“1.2.1中配制的标准工作液，按“1.2.3”中的方法进行测定，以各种氨基酸溶液浓度（X）为横坐标，峰面积（Y）为纵坐标，进行线性回归，得到17种氨基酸的标准曲线方程。结果表明，17种氨基酸在各自浓度范围内线性关系良好（r：0.9985～0.9999），详见表3。

2.1.3 精密度测定

取同一浓度样品溶液，平行测定6次，记录保留时间和峰面积，结果显示各氨基酸的保留时间的相对标准偏差（Relative standard deviation，RSD）为0.01%～0.09%；峰面积的RSD为0.20%～0.88%，说明仪器的精密度良好，详见表4。

2.1.4 重复性测定

称取同一批次黄精样品6份，按照“1.2.2”进行前处理，制成6份样品溶液，按“1.2.3”中的方法进行测定，记录保留时间和峰面积，结果显示各氨基酸保留时间的RSD为0.12%～0.55%；样品中氨基酸含量的RSD为0.80%～2.00%，表明该方法重复性较好，见表4。

2.1.5 回收率测定

精密称取黄精样品6份，每份约0.2 g，置于50 mL离心管中，分别精密加入17种氨基酸混合标准中间液1.00 mL，按照“1.2.2”进行前处理，制成6份样品溶液，按“1.2.3”中的方法进行测定，17种氨基酸的平均回收率为83.28%～91.08%，见表4。

2.2 野生黄精样品中氨基酸的含量分析

野生黄精检出17种氨基酸，氨基酸总量为7.161 ± 3.488 g/100 g，与方乐霞等［16］测定结果7.83%相近。其中谷氨酸和组氨酸含量较高，分别占比27.94%、14.94%；含量较低的为胱氨酸0.050 ±0.030 g/100g和异亮氨0.071 ± 0.037 g/100 g，见表5。必需氨基酸（Essential amino acid，EAA）是人体不能合成或合成速度远不能适应机体需要，必需由食物蛋白质供给的氨基酸，有很高的利用价值。野生黄精中共检出7种EAA，总含量为2.090 ± 1.034 g/100g，其中赖氨酸占比最高，高达37.42%。样品中EAA与总氨基酸（Total amino acid，TAA）含量的比值为29.6% ± 5.1%，EAA与非必需氨基酸（Nonessential amino acid，NEAA）比值为42.8% ± 10.7%，与联合国粮食及农业组织、世界卫生组织标准中EAA/TAA比值40%、EAA/NEAA比值60%相比，均还有差距［17］。由表6可知，氨基酸种类之间大多数呈极显著正相关关系（P＜ 0.01），最高的相关系数出现在缬氨酸和亮氨酸间，高达0.980，与刘彦东等［18］测定黔产黄精中缬氨酸和亮氨酸间相关系数0.976相吻合；而半胱氨酸与谷氨酸、缬氨酸之间分别呈负相关性，最低的相关系数仅为-0.014。

表5 野生黄精根茎中氨基酸含量情况Tab.5 The amino acids content of wild P. sibiricum

表6 氨基酸种类间相关性分析Tab.6 Correlation analysis among different amino acids

对野生黄精根茎中氨基酸成分进行主成分分析，以特征值大于1为标准，选取了3个主成分，特征值分别为10.987、2.371、1.041，贡献率分别为64.631%、13.944%、6.125%，累计贡献率为84.701%，见表7。各主成分对氨基酸指标的载荷和评分系数见表8，第一主成分代表性氨基酸主要包括天冬氨酸、苏氨酸、丝氨酸、谷氨酸和脯氨酸，第二主成分代表性氨基酸主要包括赖氨酸和苯丙氨酸，第三主成分代表性氨基酸主要包括精氨酸和络氨酸。

表7 主成分的初始特征值及累积方差贡献率Tab.7 Initial eigenvalues and cumulative variance contribution of principal components

表8 氨基酸类主成分载荷和评分系数Tab.8 Factor load and score coefficieni matrin of princial components of amino acids

2.3 不同区县野生黄精根茎中氨基酸含量分析

对各个产地样品中TAA含量分析发现，巫山地区样品中的含量最高，其他依次为万州、石柱、奉节、梁平，但各个产地差异不显著。TAA含量最高（17.4 g/100 g）和最低（3.185 g/100 g）的样品，均采自奉节，见表9。其中，石柱地区样品中的EAA含量为2.632 ± 0.272 g/100 g，排第一，梁平的最低，为1.833 ± 0.169 g/100 g。对于EAA与TAA含量的比值，最高的为巫山31.4% ± 6.3%，最低的为万州25.4% ± 2.2%；但各个产地的EAA、NEAA、TAA含量差异不显著，详见表9。

表9 不同区县野生黄精根茎中总氨基酸含量结果与分析Tab.9 Results and analysis of total amino acids in rhizomes of wild P. sibiricum from different districts and counties

3 结论

本研究在黄精样品中加入6 mol/L盐酸溶液于135℃水解4 h，经氮吹后复溶，利用全自动氨基酸测定仪定量测定游离和水解氨基酸总和。结果表明野生黄精样品中检出17种氨基酸，包括7种必需氨基酸；其中谷氨酸和组氨酸含量较高，两者之和占氨基酸总量的比例高达43%；氨基酸种类之间存在正相关关系，对不同产地黄精根茎中氨基酸含量分析结果表明，巫山地区样品中氨基酸含量较高。结果表明，渝产野生黄精的氨基酸种类丰富，含量可观，后续可对其生长环境的土壤、温度、湿度做相关性分析，为优质黄精的选种和种植提供基础。