不同海区养殖羊栖菜组成分析及多糖的抗氧化活性研究

梁美娜，张立宁，林 振，苏来金,,

（1.温州大学生命与环境科学学院，浙江省水环境与海洋生物资源保护重点实验室，浙江温州 325035；2.浙江省海洋水产养殖研究所，浙江温州 325005；3.温州佳海食品有限公司博士创新站，浙江温州 325700）

羊栖菜（Sargassum fusiforme），又名鹿角尖、海大麦等，隶属于褐藻门、褐藻纲、墨角藻目、马尾藻科、马尾藻属的海洋植物[1]，外观呈黄褐色，藻体由假根、茎、叶片、气囊等四部分组成[2]，广泛分布在我国辽东半岛至广东福建等地，目前羊栖菜人工养殖的主产区在浙江洞头，主要制成羊栖菜干品出口日本及韩国[3]，是我国重要的出口创汇海藻。羊栖菜在我国的利用历史悠久，在《本草纲目》、《药典本经》等药典中均有对羊栖菜药用价值的记载[4]，近年来的研究表明，羊栖菜营养丰富，且富含多种功能活性物质，是一种典型的药食两用的藻类[5-6]。张晓梅等[7]对渤海地区野生羊栖菜的营养成分进行了测定，发现渤海地区羊栖菜主要成分为碳水化合物，其含量占干物质的45.77%，其中蛋白与灰分含量略低于浙江洞头羊栖菜；李丽等[8]测定了大连海域的野生羊栖菜的营养组成，发现维生素C 含量与其他文献差异较大，推测可能与羊栖菜生长季节以及海域有关；李晓等[9]对比分析了山东沿海四种藻类资源的分布与营养组成的关系，发现不同种类海藻由于受生长周期、生长水温等影响，其营养组成会有差异；刘宇璇等[10]测定了洞头羊栖菜不同部位的其营养组成，发现羊栖菜不同部位的营养成分存在一定差异。然而，随着羊栖菜养殖面积逐渐扩大，养殖海区不断增加，不同海区养殖的羊栖菜营养成分和活性物质的对比研究尚未见报道，本研究对我国7 个主要海区养殖的羊栖菜中营养活性因子进行了对比分析，以期为羊栖菜的科学养殖和资源的高值化利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

羊栖菜 养殖主产区，选择浙江省7 个羊栖菜养殖海区作为羊栖菜样品的采样地点，采样信息见表1，每个海区采集养殖羊栖菜20 kg，4 ℃汽车快速运输至实验室，清洗沥干表面水分，-20 ℃冷冻保存，备用；DPPH 自由基清除能力试剂盒 南京建成生物工程研研究所；D-葡萄糖（≥98%）美国Sigma；苯酚（≥99%）无锡市佳妮化工有限公司；浓硫酸（≥96%）浙江中星化工试剂有限公司；过氧化氢（≥96%）、水杨酸（≥99%）、硫酸亚铁（≥99%）国药集团化学试剂有限公司；溴化钾 光谱纯，上海生工生物工程有限公司；除去溴化钾外其余均为分析纯。

表1 不同海区养殖羊栖菜的样品信息Table 1 Sample information of Sargassum fusiforme in different marine areas

FD-1-50 真空冷冻干燥机 北京博医康实验仪器有限公司；RE-200 型旋转蒸发器 上海亚荣生化仪器厂；Sorvall ST 16R 高速冷冻离心机 美国Thermo fisher scientific；Epoch 酶标仪 美国伯腾仪器有限公司；TENSOR27 红外光谱仪 Bruker 光谱仪器公司；T6 紫外-可见分光光度计 北京普析通用仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 羊栖菜营养成分测定

1.2.1.1 基本营养成分的测定 水分的测定参照GB/T 5009.3-2016《食品中水分的测定》；灰分的测定，参照GB/T 5009.4-2016《食品中灰分的测定》；蛋白质的测定参照GB/T 5009.5-2016《食品中蛋白质的测定》；粗脂肪的测定参照GB/T 5009.6-2016《食品中脂肪的测定》；盐分的测定参照SC/T 3011-2001《水产品中盐分的测定》。

羊栖菜多糖的制备：将不同海区养殖的羊栖菜用清水清洗，烘箱60 ℃干燥至恒重，粉碎，过100 目筛。称取不同海区养殖羊栖菜干粉15 g，加入95%乙醇100 mL，80 ℃回流脱脂3 次（2 h/次），得到脱脂藻粉。然后按照料液比1:50 水煮脱脂藻粉，80 ℃水煮2 次（5 h/次），过滤，合并两次滤液，浓缩，加入4倍体积多糖溶液的95%乙醇，4 ℃过夜，10000 r/min离心10 min，冷冻干燥制得7 个产地羊栖菜粗多糖，4 ℃冷藏备用[11]。

羊栖菜多糖含量测定：采用苯酚-硫酸法[12]测定羊栖菜多糖含量。称取10 mg D-葡萄糖标准品并定容至100 mL，分别吸取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1 mL的溶液于试管中，加去离子水补齐到1 mL，然后分别加入1 mL 6%苯酚溶液和5 mL 浓硫酸，振荡混匀，静止30 min，测定490 nm 处的吸光值。以吸收度为纵坐标，多糖含量（μg/mL）为横坐标，获得标准曲线。将7 种羊栖菜粗多糖样品配制成0.1 mg/mL 的浓度，按照上述步骤测定其吸光值，重复3 次，并根据标准曲线计算多糖含量。

1.2.1.2 氨基酸含量测定及营养评价 氨基酸的测定参照GB/T 5009.124-2016《食品中氨基酸的测定》。根据FAO/WHO（1937）年的氨基酸评分标准模式（Amino Acid Score，AAS），化学评分（Chemical Score，CS）和必需氨基酸指数（Essential Amino Acid Index，EAAI）方式对7 个海区养殖羊栖菜的氨基酸进行分析比较[13]，计算方式如下：

式中：a 表示羊栖菜样品中必需氨基酸含量，mg/g；A 为FAO/WHO 评分标准模式中相应必需氨基酸含量，mg/g；S 为鸡蛋相应必需氨基酸含量，mg/g；n 为所比较的必需氨基酸个数。

1.2.1.3 脂肪酸的测定 脂肪酸的测定参照GB/T 5009.168-2016《食品中脂肪酸的测定》。

1.2.1.4 重金属元素测定 铅的测定参照GB/T 5009.268-2016《食品中多元素的测定》；镉的测定参照GB/T 5009.15-2014《食品中镉的测定》；铬的测定参照GB/T 5009.123-2014《食品中铬的测定》；总汞的测定参照GB/T 5009.17-2014《食品中总汞及有机汞的测定》；总砷的测定参照GB/T 5009.11-2016《食品中总砷及无机砷的测定》。

1.2.1.5 矿物质元素及部分维生素含量的测定 钙、铁、锌、钾的测定参照GB 5009.268-2016《食品中多元素的测定》；碘的测定参照GB/T 5009.267-2020《食品中碘的测定》。

维生素A 的测定参照GB/T 5009.82-2016《食品中维生素A、D、E 的测定》；维生素B1的测定参照GB/T 5009.84-2016《食品中维生素B1的测定》；维生素B2的测定参照GB/T 5009.85-2016《食品中维生素B2的测定》；维生素C 的测定参照GB/T 5009.86-2016《食品中抗坏血酸的测定》。

1.2.2 羊栖菜多糖抗氧化活性测定 羊栖菜多糖清除DPPH·活性[14]：采用DPPH 自由基清除能力试剂盒测定。吸取100 µL 7 种系列浓度羊栖菜粗多糖溶液（0、0.2、0.4、0.6、0.8、1 mg/mL）到96 孔板中，加入100 µL DPPH 工作液，室温避光30 min，在517 nm处测定其吸光度，记为A1。用无水乙醇分别代替上述DPPH 工作液和羊栖菜多糖样品溶液，进行上述操作，在517 nm 处测定吸光度，分别记为A2和A0。每个孔重复3 次，并根据以下的公式计算DPPH·清除率：

式中，A1：加入样品溶液反应后的吸光值；A2：不加DPPH 试剂样品溶液的吸光值；A0：用无水乙醇代替羊栖菜多糖样品溶液的吸光值。

羊栖菜多糖清除·OH 活性[15]：在5 mL 试管中依次加入0.5 mL 的0.5 mg/mL 羊栖菜粗多糖溶液、0.5 mL 的6 mmol/L 硫酸亚铁溶液、0.5 mL 的6 mmol/L的过氧化氢溶液，混匀，静止10 min，再加入6 mmol/L的水杨酸钠溶液0.5 mL，摇匀，静置40 min 后，于510 nm 处测定吸光值，每组重复三次。按以下公式计算各试样对羟自由基的清除率：

式中，An：加入样品溶液反应后的吸光值；Ak：不加水杨酸溶液时样品溶液的吸光值；Ax：不加样品溶液的吸光值。

1.2.3 羊栖菜多糖傅里叶红外光谱测定 取少量7 种羊栖菜粗多糖干样品，加入适量KBr 粉末，在干燥箱中充分研磨，压片机压成薄片，在4500～500 cm-1的范围内进行红外扫描[16]。

1.3 数据处理

采用GraphPad Prism 8（GraphPad Software，San Diego，CA，USA）统计软件进行分析，结果用于表示并对实验结果进行配对t检验，P<0.05 为差异显著，有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 不同海区养殖羊栖菜营养成分分析

2.1.1 基本营养成分分析 由表2 可知，新鲜羊栖菜中水含量最多，在82.50～86.50 g/100 g 之间，除去水分之外，羊栖菜中含量最多的为多糖，表2 中各海区养殖羊栖菜多糖含量由高到低依次为：7 号（2.51 g/100 g）>5 号（1.90 g/100 g）>3 号（1.74 g/100 g）>4 号（1.66 g/100 g）>1 号（1.59 g/100 g）>2 号（1.25 g/100 g）>6 号（1.24 g/100 g），其中7 号海区养殖羊栖菜多糖含量最高（P<0.05），与以往多糖提取得率研究结果一致[17]，表明7 号海区养殖羊栖菜是洞头海区提取羊栖菜多糖的最佳选择。同时各海区养殖羊栖菜脂肪含量都在0.30～0.40 g/100 g，根据GB 28050-2011《预包装食品营养标签通则》的规定，食品中脂肪含量≤0.5 g/100 g 则可标为零脂肪食品[18]，因此羊栖菜是一种相对健康的低脂产品。除此之外，与其他海区养殖羊栖菜相比，7 号海区养殖羊栖菜具有明显的蛋白质含量高的优势（P<0.05），含量为2.40 g/100 g。1 号和2号海区养殖羊栖菜盐分含量相似，在2.49～2.50 g/100 g 之间，可能是因为这两个海区养殖羊栖菜采集地位置相近，使得二者的海水盐度相近。

2.1.2 氨基酸组成及分析 本研究测定了7 种羊栖菜样品中的氨基酸，其组成及含量分析结果如表3。由表3 可知，7 种羊栖菜氨基酸总量差异较大，含量在1.318～1.579 g/100 g 之间，其中2 号海区养殖羊栖菜总氨基酸含量最高，1 号海区养殖羊栖菜总氨基酸含量最低。另外由于色氨酸实验过程中被酸水解破坏[19]，胱氨酸未检出以外，一共检测到16 种氨基酸，其中必需氨基酸（Essential Amino Acid，EAA）含量为0.500～0.618 g/100 g，非必需氨基酸（Non-essential Amino Acid，NEAA）含量为0.818～0.992 g/100 g。另外，本研究7 种羊栖菜EAA/TAA 为36.49%～39.44%，EAA/NEAA 在57.46%～65.13%，而张晓梅等[7]研究的渤海羊栖菜EAA/TAA 为45.01%，EAA/NEAA 为81.84%，可能是由于浙江洞头舟山区域羊栖菜水域受瓯江影响，盐度较大，进而影响羊栖菜生长[20]。2 号和6 号海区养殖羊栖菜的EAA/TAA 分别为39.14%、39.44%，EAA/NEAA 分别为64.31%、65.13%，接近WHO/FAO 在1937 年推荐的理想蛋白质模式（EAA/TAA 在40%左右，EAA/NEAA 在60%以上），说明这两种海区养殖的羊栖菜氨基酸组成比例较为合理[21]。同时，各海区养殖羊栖菜氨基酸组成中，谷氨酸含量最多，在0.200～0.240 g/100 g，天门冬氨酸含量次之，在0.170～0.240 g/100 g，这两种氨基酸是鲜味氨基酸，表明羊栖菜具有丰富的鲜味，可以用来制作具有独特风味的海藻食品。

表3 不同海区养殖羊栖菜氨基酸组成及含量（g/100 g）Table 3 Amino acid composition and content of Sargassum fusiforme in different marine areas (g/100 g)

2.1.3 必需氨基酸评价 表4～表5 所示是7 个不同海区养殖羊栖菜的必须氨基酸评分（AAS）、化学评分（CS）、必需氨基酸指数（EAAI），并评价7 个不同海区养殖羊栖菜的蛋白质营养价值。根据AAS 和CS 可知，7 个海区养殖羊栖菜蛋氨酸的氨基酸评分最低，为第一限制氨基酸，其次较低的为赖氨酸，为第二限制氨基酸。在蛋白源评价中，当n=6～12 时，评价标准为：当0.80.9 即为优质蛋白源，营养价值越高[22]，由于7 个海区养殖羊栖菜的EAAI值均高于0.9，因此7 个海区养殖的羊栖菜均为优质蛋白质来源。

表4 不同海区养殖羊栖菜必需氨基酸与鸡蛋蛋白及FAO/WHO 标准模式对比（g/100 g）Table 4 Comparison of essential amino acids of Sargassum fusiforme in different marine areas with egg proteins and FAO/WHO standard models (g/100 g)

表5 不同海区养殖羊栖菜必须氨基酸营养评价Table 5 Nutritional evaluation of essential amino acids of Sargassum fusiforme in different marine areas

2.1.4 脂肪酸组成及含量 由表6 可知，7 个不同海区养殖羊栖菜中共检测出8 种脂肪酸，其中，饱和脂肪酸（Saturated Fatty Acid，SAFA）2 种，含量占脂肪酸总量的36.28%～51.94%，单不饱和脂肪酸（Monounsaturated Fatty Acid，MUFA）2 种，占脂肪酸总量的9.72%～17.19%，多不饱和脂肪酸（Polyunsaturated Fatty Acid，PUFA）4 种，占脂肪酸总量的35.78%～50.10%，均少于渤海羊栖菜脂肪酸含量[7]。由上述数据可知，除了2 号海区养殖羊栖菜，其他海区养殖羊栖菜中的脂肪酸均以多不饱和脂肪酸为主。在SAFA 中，含量较多的为棕榈酸（C16:0），其中7 号海区养殖羊栖菜最多（P<0.05），含量为0.50±0.01 g/kg；在MUFA 中，油酸（C18:1n9c）含量最高，其中7 号海区养殖羊栖菜的油酸含量占总脂肪酸含量的14.58%（P<0.05）；在PUFA 中，5 号海区养殖羊栖菜花生四烯（C20:4n6）和α-亚麻酸（C20:5n3）含量最多（P<0.05），分别占总脂肪酸含量的21.42%与12.17%，已知花生四烯酸和α-亚麻酸是人体必需脂肪酸，且花生四烯酸是合成前列腺素等物质的重要前提物质[23]，而α-亚麻酸具有降血糖功效[24]，因此食用5 号海区养殖羊栖菜对于降低心血管疾病以及糖尿病等疾病的发生具有重要意义[25]。虽然不同海区养殖的羊栖菜脂肪酸种类相同，但其同一脂肪酸的含量却存在差异性，这说明温度、海水盐度等可能通过影响羊栖菜生长来影响其脂肪酸的合成。

表6 不同海区养殖栖菜脂肪酸组成及含量（g/kg）Table 6 Fatty acid composition and content of Sargassum fusiforme in different marine areas (g/kg)

2.1.5 重金属含量的结果 研究表明海洋藻类可能富集了重金属离子，其中常见的重金属污染物有铅、镉、铬、汞以及砷等[26]，因此本文对7 个海区养殖羊栖菜进行了重金属含量的测定。根据GB 19643-2016《藻类及其制品》[27]和GB 2762-2017《食品中的污染物限量》[28]中对重金属污染物的限量要求，藻类及其制品铅含量的限量为1 mg/kg，由表7 可知，7 个海区养殖的羊栖菜均符合标准限量要求。其他指标（镉、铬、总汞以及总砷）虽然没有限量要求，通过与GB 2762-2017《食品中的污染物限量》中其他水产动物的安全指标作为参照，发现7 个海区养殖羊栖菜中的镉、铬、总汞含量均符合限量要求，其中，2 号海区养殖羊栖菜的Cd 的金属含量略高，分析可能是由于该海区更靠近海岸，海水更容易被污染，从而使得羊栖菜中重金属含量增加[29-31]。

表7 不同海区养殖羊栖菜重金属元素含量（mg/kg）Table 7 Contents of heavy metal elements of Sargassum fusiforme in different marine areas (mg/kg)

2.1.6 矿物质元素及部分维生素含量的结果 由表8可知，羊栖菜含有丰富的钙、钾，二者是人体必需的常量元素，其中4 号海区养殖羊栖菜含钙、钾的量最多，含量分别为（131.44±6.36）mg/100 g 与（1687.63±28.14）mg/100 g；6 号海区养殖羊栖菜含钙量最少，为（120.01±3.67）mg/100 g，含钾量最少的为7 号海区养殖羊栖菜，含量为（1470.12±14.20）mg/100 g，其均大于菠菜、荠菜、白菜等蔬菜的钙、钾含量[32]。根据中国居民的具体情况，成年人每日需要摄入800 mg钙和3.5 g 钾，因此羊栖菜是一种良好的钙、钾来源的藻类。除此之外，5 号海区养殖羊栖菜含铁量最多，为（1.73±0.10）mg/100 g，7 号海区养殖羊栖菜含碘量最多，为（6.63±1.76）mg/100 g，羊栖菜中丰富的铁、碘微量元素，对于防止贫血以及甲状腺肿大具有重要作用[33]。

表8 不同海区养殖羊栖菜样品中Ca、Fe、Zn、K 和I 含量（mg/100 g）Table 8 Contents of Ca,Fe,Zn,K and I of Sargassum fusiforme in different marine areas (mg/100 g)

维生素在人体生长发育起着重要作用，其中维生素B2参与机体三大生热营养素的代谢过程[34]；维生素C 具有较强的抗氧化活性，可以清除体内的自由基，且人体内缺乏维生素C 生物合成最后一步反应的关键酶，因而必须从食物中摄取维生素C[35]，通过表9 可知，各海区养殖羊栖菜含有少量的维生素B2与维生素C，维生素B2含量在（6.50±0.12）～（6.94±0.08）µg/100 g，维生素C 含量在（4.12±0.07）～（4.27±0.15）µg/100 g。

表9 不同海区养殖羊栖菜维生素含量（µg/100 g）Table 9 Vitamin content of Sargassum fusiforme in different marine areas (µg/100 g)

2.2 不同海区养殖羊栖菜多糖体外抗氧化活性评价

有研究表明羊栖菜具有良好的抗氧化活性，主要活性物质为羊栖菜多糖[36-37]，本文对7 个海区养殖羊栖菜多糖抗氧化活性进行了测定。各海区养殖羊栖菜多糖对·OH 的清除能力见图1，7 个海域养殖羊栖菜多糖在浓度为0.2～1.0 mg/mL 内对·OH 清除率逐渐增加，并且当多糖浓度为1 mg/mL 时，5 号海区养殖羊栖菜多糖的清除率最高，为59.7%，清除·OH 的IC50为0.534 mg/mL。各海区养殖羊栖菜糖对DPPH·的清除能力见图2：在浓度为0.2～0.6 mg/mL时，各海区养殖羊栖菜多糖对DPPH·自由基清除率增长较快，随后减缓；另外，从图中可知，5 号海区养殖羊栖菜多糖对DPPH·清除率最好，当浓度为1 mg/mL 时，清除率为70%，IC50为0.236 mg/mL，其清除DPPH·能力高于唐炜等[38]的测定数据，这可能是由于多糖更易溶解于水中，当提取试剂为乙醇而不是水时，使得多糖提取率降低且多糖中杂质含量较多，从而降低了多糖抗氧化活性。2 号海区养殖羊栖菜多糖DPPH·清除活性最差，当浓度为1 mg/mL时，清除率为40%，IC50为1.166 mg/mL。7 个海区养殖羊栖菜多糖清除·OH 与DPPH·活性大小存在差异，这主要与各个海区养殖羊栖菜多糖的纯度、硫酸根含量、分子量大小等有关[39]。

图1 不同海区养殖羊栖菜多糖对·OH 的清除能力Fig.1 Scavenging ability of Sargassum fusiforme polysaccharides in different marine areas on ·OH

图2 不同海区养殖羊栖菜多糖对DPPH·的清除能力Fig.2 Scavenging ability of Sargassum fusiforme polysaccharides in different marine areas on DPPH·

2.3 不同海区养殖羊栖菜多糖红外光谱分析

图3 是不同海区养殖羊栖菜多糖红外光谱扫描图。由图可知，各海区养殖羊栖菜多糖主要吸收峰基本相同，说明构成各海区养殖羊栖菜多糖的主要有机官能团相似[40]。3424 cm-1处的宽峰是由于糖环上的O-H 伸缩振动引起的[41]；在1612 cm-1附近有羰基非对称伸缩振动、酰胺基N-H 变角振动，表明羊栖菜多糖中含有糖醛酸[42]；1250 cm-1处为S=O 的伸缩振动峰，表明多糖上含有硫酸基团，说明羊栖菜多糖是硫酸化多糖[43]；1035 cm-1处是C-O-C 的特征吸收峰，说明羊栖菜多糖构型为吡喃环型[44]。研究表明南澳海域7 种海藻多糖均为硫酸酯多糖，由于南澳海域7 种海藻多糖的特征吸收峰与7 个海区羊栖菜多糖吸收峰相似，因此7 个海区养殖羊栖菜多糖也都是硫酸酯多糖[45]。

图3 不同海区养殖羊栖菜多糖红外光谱扫描图Fig.3 Infrared spectrum of polysaccharides extracted from Sargassum fusiforme in different marine areas

3 结论

羊栖菜是我国重要的经济特色藻类之一，具有丰富的营养功效与经济价值，本研究首次以7 个不同海区养殖羊栖菜原料为研究对象，对其营养成分以及多糖活性进行了对比分析，发现不同海区养殖的羊栖菜营养组分及多糖具有一定的差异。鲜羊栖菜除水分外，其主要的营养成分为多糖，其中，7 号海区养殖羊栖菜多糖含量最高（P<0.05）；7 个海区养殖羊栖菜脂肪含量较低，而其氨基酸EAAI 值均高于0.9，表明了羊栖菜是一种低脂产品且为优质蛋白的良好来源，其中2 号和6 号海区养殖羊栖菜的EAA/TAA与EAA/NEAA 最接近WHO/FAO 在1937 年推荐的理想蛋白质模式（EAA/TAA 在40%左右，EAA/NEAA 在60%以上），表明这两个海区养殖的羊栖菜氨基酸组成比例较为合理，可以作为人们日常低脂饮食的良好食物来源。除此之外，除了2 号海区养殖的羊栖菜之外，其他海区养殖羊栖菜均以不饱和脂肪酸为主；7 个海区养殖羊栖菜的重金属均符合食品安全国家标准且是一种良好的钙、钾来源藻类。抗氧化活性实验结果表明，7 个海区养殖的羊栖菜多糖都具有清除·OH 以及DPPH·活性，其中5 号海区养殖的羊栖菜多糖抗氧化能力最佳，其清除·OH 与DPPH·的IC50分别为0.534 与0.236 mg/mL，这可能与5 号海区养殖的羊栖菜多糖中含有较多的硫酸根基团有关。本研究为羊栖菜的养殖及产品开发等提供了良好的理论基础。