超声协助吐温-20 一步法制备水分散性虾青素工艺探究及其表征

李 佳，齐祥明,

（1.中国海洋大学食品科学与工程学院，青岛市食品生物技术重点实验室，山东青岛 266404；2.青岛海洋科学与技术试点国家实验室海洋药物与生物制品功能实验室，山东青岛 266237；3.中国轻工业水产品生物加工重点实验室，山东青岛 266404）

虾青素作为一种重要的类胡萝卜素，具有强抗氧化性，因此作为功能性成分在保健食品的开发中应用已久，商业价值很大[1-3]。然而，只在有限数量的生物材料中发现该物质，其中虾蟹壳内的虾青素含量往往过低（35～153 μg/g 湿重），且难以提取[4]。对比而言，雨生红球藻具有的极高虾青素积累能力（可高达细胞干重的4%～5%）更具备产业化前景[5]，因此该微藻近年来正逐渐成为天然虾青素提取的主要原料[6]。

天然虾青素比合成虾青素更活跃、更安全，市场认可度更高[6]。基于前文所述原因，近年从雨生红球藻中提取虾青素的各种技术正不断被开发[4,7-10]。这些技术的关键在于，通过各种物理（高压均质、超声波、微波）、化学（水热液化、酸处理、离子液体处理）或生物（酶裂解）手段，首先实现雨生红球藻的细胞破碎[7-8]，进而提取得到纯度较高的天然虾青素产品。其中，物理方法因其工业可操作性更强而受到更多的关注[7]。从细胞破碎的机理来看，三种常见的物理方法中，微波是基于细胞内极性物质对微波能的吸收，而达到破胞效果，在该过程中会产生大量的热能，并致使胞内温度迅速升高，因此不适用于提取虾青素等热敏性物质[7]。而超声和高压均质的热效应相对较小，且试验操作简单，更适合于雨生红球藻中虾青素的提取。

然而，各种形式的虾青素（天然的或合成的；单体、单酯或双酯）均表现出较差的水溶性和稳定性，这大幅降低了其生物可利用性；且这些虾青素容易被环境中的光和热降解[11-12]。为提高虾青素的水溶性、稳定性和生物可利用性等应用性能，研究者们通常会对合成的或提取自天然产物的虾青素进一步进行物理或化学的改性[13-14]。其中，物理包封技术相对简单、对活性物质的保护良好，所获得纳米颗粒水分散效果好且生物可及性较高，因而具有更高的关注度[13]。

从以上内容可以看出，目前具有较好利用性能的天然虾青素产品往往需要以雨生红球藻为原料，然后经过提取和改性两步制得[15]，过程繁琐复杂、有机试剂残留且成本较高。齐祥明等[16]和Zhang 等[17]率先报道在超声协助下，以有机酸缓冲溶液通过一步法工艺制得水分散虾青素，但其单次虾青素释放率仅为37.45%；多次释放、分散后也仅达到68.05%，未能充分提取出雨生红球藻原料中的天然虾青素。有文献表明，吐温-20 可以较好地实现对纯虾青素的分散[18]。但利用超声和吐温-20 协同作用直接一步从雨生红球藻获得水分散虾青素产品的工艺研究尚未见报道。

本研究以雨生红球藻为原料，通过超声辅助乳化剂（吐温-20）进行水分散虾青素的一步法制备工艺的探索；并基于工艺探索实验数据（乳化剂添加比例、超声功率、料液比等对虾青素分散效果的影响），探讨了该工艺可能的过程机理；同时对所得的水分散虾青素纳米乳液进行了基本化学成分和结构的表征以及性能的简单调查，为虾青素的同步绿色、简易、高效提取和性质改良提供了理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

雨生红球藻（湿藻）云南绿A 生物有限公司提供，置于-20 ℃贮藏；吐温-20 分析纯，生工生物工程（上海）股份有限公司；虾青素标准品 美国Sigma公司；甲基叔丁基醚 色谱纯，德国Meker 公司；甲醇 色谱纯，美国Tedia 公司。

JY92-II DN 超声波细胞破碎机 宁波新芝生物科技股份有限公司；JK-MSH-Pro-6B 磁力搅拌器上海精学科学仪器有限公司；LC-20A 高效液相色谱仪 日本Shimadzu 公司；FV1000 激光共聚焦电镜 日本Olympus 公司；JSM-840 扫描电子显微镜日本电子株式会社；CGJB 均质机 郑州玉祥食品机械设备有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 水分散虾青素乳液的制备 如图1 所示，称取1 g 雨生红球藻泥（水分含量为52.21%±0.92%）与20 mL 超纯水、一定量吐温-20 后充分混合，在超声环境下处理30 min。样品在4oC 以8000 r/min的转速离心30 min，然后收集上清液，即得到水分散虾青素乳液。

图1 水分散虾青素乳液制备流程图Fig.1 Flow chart for preparation of water-dispersible astaxanthin emulsion

1.2.2 虾青素含量的测定 所得水分散虾青素乳液中虾青素含量的测定参照Zhang 等[17]的方法，使用高效液相色谱法（High performance liquid chromatography，HPLC）进行。

雨生红球藻中的全部虾青素含量测定：取1 g 雨生红球藻藻泥与20 mL 超纯水充分混合后超声环境下处理30 min，用甲醇:三氯甲烷为3:1（v/v）萃取其中的虾青素至样品无色。使用高效液相色谱法测定有机试剂中的虾青素含量。基于水分散虾青素乳液中虾青素含量和雨生红球藻中全部虾青素的含量可求得分散率：

其中，m1为水分散虾青素乳液中的虾青素含量，mg；m2为雨生红球藻中的全部虾青素含量，mg。由此可知，本工艺中的分散率同时也是藻内虾青素释放到胞外的释放率，等同于虾青素提取工艺中的提取率。

参照Tofani 等[19]的方法，通过ABTS+自由基清除率测定水分散虾青素乳液的抗氧化能力。水分散虾青素对ABTS+自由基的清除率按下式进行计算：

式中，A1是样品与ABTS+自由基反应后的吸光值；A2是样品本身的吸光值；A0：空白组的吸光值。

参照袁巧月等[20]的方法测定乳液中颗粒的平均粒径和Zeta 电位。

1.2.3 水分散虾青素制备工艺探索

1.2.3.1 吐温-20 添加量的影响 参照图1 的步骤，在600 W 超声功率下，料液比（雨生红球藻与超纯水的比例）1:20 g/mL 时，考察乳化剂不同添加量（0、100、150、200、400、600、800 和1000 μL）对工艺过程的影响。

1.2.3.2 超声功率的影响 在吐温-20 添加量为200 μL，料液比1:20 g/mL 时，考察不同超声功率（200、300、400、500 和600 W）对工艺过程的影响。

1.2.3.3 料液比的影响 在吐温-20 添加量为200 μL，超声功率600 W 时，考察不同料液比（1:10、1:20、1:30 和1:40 g/mL）对工艺过程的影响。

1.2.4 水分散虾青素乳液的形成原理探究

1.2.4.1 超声处理和高压均质处理对雨生红球藻破胞效果的影响 将1 g 藻泥与20 mL 超纯水充分混合，分别作600 W 超声处理30 min 和60 MPa 高压均质处理一次，用甲醇-三氯甲烷（1:2，v/v）提取其中的虾青素。在虾青素提取前后分别取混匀的样品稀释10 倍，在400 倍放大倍数下进行对比观察，并参考Thunyaporn 等[21]的方法，用血球计数板进行破胞率的计数。其中，未处理的雨生红球藻作为对照。

使用扫描电子显微镜对未处理和接受30 min 600 W 超声处理后的雨生红球藻进行形态分析。在检测之前，样品先经真空冷冻干燥处理36 h（冷阱温度-60oC，真空压强1 Pa）。

1.2.4.2 不同处理方式对虾青素分散效果的影响为了研究提高虾青素分散率的方法，采用单纯超声、单纯高压均质、超声后加吐温-20、超声协助吐温-20 和高压均质协助吐温-20 分别处理雨生红球藻。称取1 g 雨生红球藻泥与20 mL 超纯水充分混合，分别经过上述处理后，以4oC，8000 r/min 的转速离心30 min，然后收集上清液，并测定其中虾青素含量。其中，超声处理条件为：在600 W 超声环境下处理30 min；高压均质处理：在60 MPa 环境下处理；超声后加吐温-20：在600 W 超声环境下处理30 min破胞，然后加入200 μL 吐温-20 混匀；超声协助吐温-20 处理：藻液加入200 μL 吐温-20 充分混合后在600 W 超声环境下处理30 min；高压均质协助吐温-20 处理：藻液加入200 μL 吐温-20 充分混合后在60 MPa 环境下处理。

1.2.5 水分散虾青素的表征

1.2.5.1 化学成分分析 水分散虾青素溶液中的多糖含量采用以葡萄糖为标准的蒽酮-硫酸法进行测定[22]。将1 mL 水分散虾青素溶液和4 mL 蒽酮-硫酸溶液（3.3 mg/mL）剧烈混合，在95 ℃下反应7 min。然后在580 nm 处测量吸光度。水分散虾青素的蛋白质含量用凯氏定氮法测定[23]。水分散虾青素中的脂类含量是用氯仿和甲醇通过重量法来测定的[24]。核酸含量参照齐祥明等[16]的方法，使用定磷法测定。

1.2.5.2 脂肪酸组成成分分析 参照Damiani 等[25]报道的方法并做了部分修改，在脂肪提取吹干后进行脂肪的皂化和脂肪酸的甲酯化：在脂肪提取物中加入2%氢氧化钠甲醇溶液8 mL，连接回流冷凝器，80 ℃水浴上回流，直至油滴消失。从回流冷凝器上端加入7 mL 5%三氟化硼甲醇溶液，在8±1 ℃水浴中继续回流2 min。用少量水冲洗回流冷凝器。停止加热，从水浴上取下烧瓶。迅速冷却至室温。加入10 mL 正庚烷，振摇2 min，再加入饱和氯化钠水溶液，静置分层。吸取上层正庚烷提取溶液大约5 mL，至25 mL 试管中，加入大约3～5 g 无水硫酸钠，振摇后静置5 min，吸取上层溶液到进样瓶中待测。使用配备了SP-2560（100 m×0.25 mm，0.2 μm）柱的气相色谱仪在260 ℃的温度下进行分析。所得数据利用GC 软件进行积分，用内标法进行含量计算。

1.2.5.3 激光共聚焦扫描显微镜分析 使用配备10 倍目镜和60 倍油浸物镜的激光共聚焦扫描显微镜在激发波长为488 nm 的荧光模式下对乳剂的微观结构进行观察。乳液中的油相用尼罗红溶液（1 mg/mL 乙醇）染色。

1.2.5.4 差示扫描量热分析 参照Liu 等[26]报道的方法，使用热分析仪进行差示扫描量热（Differential scanning calorimetry，DSC）分析。

1.3 数据处理

使用 Origin 2018 软件绘制图形，结果以平均值±标准差（n=3）表示。采用SPSS 19.0 软件对组间差异性进行分析，P<0.05 表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 一步法制备水分散虾青素乳液工艺探索

直接从雨生红球藻中提取并一步制备水分散虾青素乳液的工艺探索结果如图2 所示。图2A、图2D 和图2G 的结果显示在吐温-20 体积为200 μL、超声功率为600 W、料液比为1:20 g/mL 时，虾青素的分散率最高，可达98.41%。

图2 不同乳化剂添加量、超声功率和料液比对虾青素分散率、自由基清除率以及虾青素乳液的平均粒径和Zeta 电位的影响Fig.2 Effects of different emulsifier addition,ultrasonic power and material-to-liquid ratio on astaxanthin dispersion rate,free radical scavenging,and average particle size and Zeta potential of astaxanthin emulsions

如前言所述，之前文献可见的由雨生红球藻经一步法制备水分散性虾青素的报道里，单次虾青素释放率仅为37.45%[16]（如1.2.2 所述，该研究和本文中的虾青素释放率即分散率，等同于单纯虾青素提取工艺中的提取率）。本研究采用超声协助吐温-20 的方法，虾青素分散率得到了实质性提高（98.41%），已达到甚至超过了大多数单纯的虾青素提取工艺的提取率（2%～99%）[4,9-10]。

系列探索性实验进一步显示，乳化剂添加量（图2A、图2B）对这一工艺过程中虾青素的分散率有显著的影响（P<0.05）。当在20 mL 溶液体系中加入200 μL 吐温-20 时，分散到乳液体系中的虾青素量最高（98.41%）。在更高或更低的吐温-20 添加量下，虾青素的分散度均不够理想。图2B 中ABTS+自由基清除率结果的变化趋势和图2A 大致相似，也在吐温-20 添加量为200 μL 时达到了最高。这一方面进一步证明了200 μL 吐温-20 添加量对虾青素的充分分散最适宜；另一方面显示，吐温-20 添加量的不同对所制备水分散虾青素的抗氧化活性影响较小。

不同功率的超声处理具有不同的细胞破坏作用[10]，图2D、图2E 也显示了这一规律：随超声功率的增加，虾青素分散率显著增加（P<0.05）。在600 W超声功率的处理下，分散到乳液体系中的虾青素量已接近理论最高值100%。因此，基于降低能耗和热效应的目的，未再考察更高的超声功率。与虾青素分散趋势不尽相同的是，图2E 显示的自由基清除率增加幅度较小。这可能是由于包封处理使得虾青素的抗氧化活性具有一定的缓释效应[27]，导致在较短时的测试中，虾青素的抗氧化性未完全释放。

和梁康琳[9]的研究相似，在本实验中，料液比同样是影响一步法制备水分散性虾青素的显著因素。图2G 和图2H 显示，当料液比为1:20 g/mL 时，虾青素的分散率最高。当料液比低于或高于该比例时，虾青素分散效果都会显著降低（P<0.05）。

此外，在最佳乳化剂添加量和超声功率下，本实验得到的水分散虾青素颗粒平均粒径为115.55 nm，而其他条件下颗粒往往更大；Zeta 电位在此条件下为-23.35 mV，而其他条件下则基本在-16.85～-28.05 mV 内波动。与Shen 等[28]研究（通过超声协助吐温-20 在水中包封溶于中链三酰基甘油的虾青素，其粒径为193.87±3.84 nm，Zeta 电位-7.10 mV）相比，本研究用一步法获得的水分散虾青素的粒径更小，Zeta 电位绝对值更高，这表明该乳液具有高稳定性[28]。

2.2 水分散虾青素一步法制备工艺过程机理探究

基于上述探索性实验，研究组认为，超声协助和吐温-20 的添加是一步法制备水分散性虾青素不可缺少的两个条件。在这类研究中，通常认为超声的主要作用是破碎[10,28]，而吐温则用来具体实现虾青素的包封[18,28]。因此，下文将对比研究破胞效果更好的高压均质手段能否替代超声，并进一步揭示超声辅助吐温-20 一步法制备水分散虾青素的工艺过程机理。

2.2.1 超声与高压均质破胞作用差异分析 图3 显示了超声和高压均质处理对雨生红球藻细胞破坏作用的差异。

图3 光镜观察雨生红球藻的状态图（400×）Fig.3 Light microscopic observation of the state graphs of Haematococcus pluvialis (400×)

对比图3b 和图3e 可以发现，超声的破胞效率明显不如高压均质。然而进一步对两样品中虾青素采用有机溶剂提取，结果显示，破胞率仅为51.35%（血球计数板统计结果）的超声处理样品也和破胞率97.3%的高压均质样品一样，其中虾青素都会被完全提取（图3c、图3f）。进一步以高压均质的虾青素提取率为参照，测定得超声处理的虾青素提取率为101.05%。

据此推测，在超声处理下，很多保持相对完整形态的细胞可能已经出现了漏洞，因为超声具有引起湍流和剪切应力进而推动细胞内含物外流的作用[29]。图4 给出的扫描电镜观察结果进一步支撑了这一推测：经超声处理后的雨生红球藻细胞表面开始出现孔洞，细胞内含物释放痕迹明显，且超声功率越大，释放物越多。

图4 扫描电镜观察到的雨生红球藻的细胞状态图Fig.4 Scanning electron microscopy images of the cellular state of Haematococcus pluvialis

对于破胞率更高的高压均质是否可以替代超声完成一步法制备水分散虾青素，研究组首先对未加乳化剂的高压均质样品也进行了离心分离的尝试，结果显示，经同样的离心条件后，上清液呈浑浊状态，很难实现分离。估计这和细胞碎片过小有关（图3e、图3f）。文献显示，该均质条件下获得的颗粒往往在百纳米到微米级别[30]，与图3e、图3f 所示结果吻合。而吐温-20 形成的包封物粒径往往也是在百纳米范围内[31]。因此，从这一方面来说，预计高压均质替代超声实现一步法制备水分散性虾青素将不可避免含有很多难分离的细胞碎片等。

2.2.2 超声、高压均质对虾青素分散的作用 图5的结果显示单纯的高压均质处理后，虾青素的分散率为4.76%，单纯的超声处理后虾青素的分散率为9.21%。这说明，单纯高压均质和超声等物理作用很难实现虾青素的分散。进一步在超声之后加入吐温-20，结果显示，水分散虾青素的获得量有一定提高（21.49%），但仍处于较低水平。这说明超声在协助吐温形成水分散虾青素方面，同样有着重要作用。数据显示，高压均质协助吐温-20 同样可以获得较高的分散率（89.82%），但仍显著低于超声协助吐温-20 获得的虾青素分散率（P<0.05）。且因高压均质协助吐温-20 分散的样品中存在大量难分离细胞碎片，很难获得超声处理后相似的半透明溶液（均匀纳米乳液的特征）。因此，超声协助吐温-20 分散虾青素工艺更具有工业化前景。

图5 高压均质、超声、超声+吐温-20、高压均质协助吐温-20 和超声协助吐温-20 处理与虾青素分散率的关系Fig.5 Relationship between high pressure homogenization,ultrasonication,ultrasonication+Tween-20,high pressure homogenization-assisted Tween-20 and ultrasound-assisted Tween-20 treatments and astaxanthin dispersion rate

2.2.3 一步法制备水分散虾青素中超声协同吐温-20 的作用分析 基于以上内容，本研究组推测，在协助吐温-20 从雨生红球藻原料中一步法获得虾青素的工艺中，超声首先通过对细胞内容物的作用实现了对藻细胞的有限破坏（参见文献[10]和图3b、图3c；图4b、图4c）；然后吐温-20 在超声的作用下分别对仍在胞内和释放到胞外的虾青素进行包封。此时超声在微观尺度层面所具有的促进传质能力[7]对协助吐温-20 实现虾青素的包封具有重要意义，超声处理后再加吐温-20 的虾青素分散结果进一步验证了该推测。相比于高压均质处理，超声处理对藻细胞的有限破坏给后续的水分散虾青素乳液与藻渣、甚至残余藻油的分离带来方便。

2.3 水分散虾青素的表征

2.3.1 主要成分分析 如表1 所示，本研究所得水分散虾青素中虾青素含量高达43.82%，远高于齐祥明等[16]获得的一步法制备产品；而且，这一数值也远高于使用纯虾青素封装的虾青素含量（约3.0%）[32-33]。这充分展示了这一工艺和产品的优越性。

表1 水分散虾青素乳液的主要成分Table 1 Main compositions of water-dispersion astaxanthin emulsions

进一步分析表1 结果，可以发现，在本文和梁康琳等[9,15]的一步法工艺中，实现包埋虾青素的同时均包埋了一定量的脂类物质。两种样品中虾青素占脂类物质总量的比例接近，分别为57.91%和65.24%。结合文献中雨生红球藻虾青素和脂质含量的数据[34]，不难发现，两个工艺过程中，溶于脂滴的虾青素均被选择性地富集包封了。而本研究所开发工艺中，残余藻渣已不再能提取出虾青素，这保留了其余藻油的再提取可能性。

此外，本研究所得样品中虽然也含有一定量的蛋白质和多糖，但明显远低于齐祥明等[16]的样品。这说明，在本工艺中，吐温-20 替代了齐祥明等工艺中蛋白质、多糖乃至核酸的包封作用。这可能也是本工艺中虾青素释放率大大增加的原因所在。另外，图2C、图2F 和图2I 的数据显示，本研究所获水分散虾青素颗粒的Zeta 电位绝对值明显高于文献中单纯的吐温-20 包封[28]，可能也和其中含有一定量蛋白质、多糖等荷电物质有关。

2.3.2 脂肪酸分析 从表1 数据可以发现，雨生红球藻中的脂质并未被完全包封到水分散虾青素的纳米颗粒中，表2 进一步显示了被包封的脂质与雨生红球藻中原脂质在脂肪酸组成上的不同。表2 中数据显示，水分散虾青素中脂肪酸组成的不同在于饱和脂肪酸C12:0 异常的大幅度增高。结合吐温-20 具有12 碳的脂肪链结构，研究组认为，这些被选择性包封的饱和脂肪酸C12:0 将可能因为结构的相似性而与吐温-20 有序地排列于脂滴表面，降低被包封脂滴的表面张力[35-36]。图2C、图2F 和图2I 的数据显示，本研究所获水分散虾青素颗粒粒径明显低于文献中纯吐温-20 包封纯虾青素的颗粒粒径[28]，可能也与此有关，这比文献中单纯借助吐温-20 来降低脂滴表面张力明显效果更好[35-36]。

表2 水分散虾青素乳液中的脂肪酸组成Table 2 Fatty acid composition of water-dispersed astaxanthin emulsions

此外，表2 结果显示，被包封的不饱和脂肪酸量明显偏低，这可能与它们的结构有序性较低有关（与吐温-20 结构相似性低，将不利于降低表面张力[36]）。另一方面，这意味着残存的未被包封的藻油中将含有更高比例的不饱和脂肪酸，利于残余藻油的再提取。

2.3.3 激光共聚焦电镜分析 图6 显示了添加与不添加吐温-20 所获得水分散虾青素的微观状态。从图中可以看出，添加吐温-20 后获得的含油颗粒大而且多。吐温-20 会使分散颗粒有能力包封更多的脂质[36]，这可能是形成颗粒粒径更大的原因所在。相较而言，梁康琳等[9]、齐祥明等[16]未加吐温-20 所获得的颗粒粒径更小（40～100 nm）。

图6 激光共聚焦电镜观察无乳化剂的虾青素分散液（a）和水分散虾青素乳液（b）（600×）Fig.6 CLSM observation of astaxanthin dispersion without emulsifier (a) and water-dispersible astaxanthin emulsion (b) (600×)

2.3.4 DSC 分析 图7 给出的游离虾青素和本研究制备水分散虾青素DSC 曲线对比显示，游离虾青素在229 ℃附近有晶体的降解特征热吸收峰[37]（图6a）；而本研究中所得样品不具备此热吸收峰（图6b）。这表明，该样品中的虾青素完全为非晶态[26]。文献表明[38]，无定形非晶态虾青素将更利于溶解，从而显著改善难溶性药物的口服生物利用度。

图7 游离虾青素（a）和水分散虾青素（b）的DSC 曲线Fig.7 DSC curves of free astaxanthin (a) and water-dispersed astaxanthin (b)

综合以上水分散虾青素样品的表征数据可以发现，本研究所得样品较纯虾青素包封样品具有更合理和高效的包封机制，因而将具有更高的稳定性（粒径更小、Zeta 电位绝对值更高）和生物利用度（所包封的全为非晶型虾青素）。

3 结论

本文研究了超声辅助吐温-20 从雨生红球藻中分散、释放虾青素从而一步制备水分散虾青素乳液的方法，所得结论如下：乳化剂添加量、超声功率、料液比均对该过程有极显著影响。在料液比1:20 g/mL、乳化剂添加量200 μL、超声功率600 W 的条件下，雨生红球藻中虾青素分散、释放的比率可达98.41%。其中，在该一步法制备过程中超声处理具有破胞和协助吐温-20 分散的双重作用。超声对细胞的有限破碎作用保证了虾青素的释放，同时为后续水分散虾青素的获取提供了方便，明显比高压均质更具工业化潜力。

水分散虾青素成分分析结果显示：其中富集有43.82%的虾青素；被选择性包封的脂质里饱和脂肪酸（尤其是C12:0）偏高。其他表征数据显示：乳液颗粒平均粒径为115.55 nm；Zeta 电位为-23.35 mV；被包封虾青素为无定形非晶态，表明所得样品具有较高的水溶稳定性和生物利用度。

综上，本文开发的超声辅助吐温-20 一步法制备水分散虾青素乳液工艺为直接从雨生红球藻中获得虾青素产品提供了一种绿色可行方案。该方案简便、高效；所得产品部分性能优于纯虾青素包封的产品，同时该工艺保留了进一步提取残余藻油的可行性，具有较高的工业化利用前景。