白肉灵芝水提物对新生大鼠胆红素脑病的影响

王 昱，何九军

白肉灵芝水提物对新生大鼠胆红素脑病的影响

*王 昱1,2，何九军1,2

（1. 陇南师范高等专科学校农林技术学院，甘肃，成县 742500；2.陇南特色农业生物资源研究开发中心，甘肃，成县 742500）

为了研究白肉灵芝水提物（aqueous extracts, GLAE）对新生大鼠胆红素脑病的改善作用。腹腔注射胆红素建立高胆红素血症大鼠模型，将新生大鼠分成对照组、模型组、GLAE低剂量组、GLAE中剂量组和GLAE高剂量组，分别给予不同剂量的（0、50、100、200 mg/kg）GLAE处理。利用试剂盒检测血液样本和大脑组织中总胆红素水平，比色法检测大脑组织ATP酶、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase, SOD）、过氧化氢酶（catalase, CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase, GSH-Px）活性和丙二醛（malondialdehyde, MDA）含量，酶联免疫吸附（ELISA）法检测血清肿瘤坏死因子-α（tumornecrosisfactor-α，TNF-α）、白细胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、神经特异性烯醇化酶（neuron specific enolase, NSE）和中枢神经特异性蛋白（central nerve specific protein, S100β）的含量，实时荧光定量PCR和western blot检测大脑组织B淋巴细胞瘤-2（B-cell lymphoma-2, Bcl-2）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3 （cysteine aspartate protease 3, Caspase-3）、B淋巴细胞瘤-2 相关X（Bcl-2 assaciated X, Bax）、脑源性神经生长因子（brain derived neurotrophic factor, BDNF）、神经生长因子（nerve growth factor, NGF）mRNA水平和蛋白含量。结果显示，与模型组相比，经GLAE干预后，大鼠血清及大脑组织胆红素浓度明显降低（< 0.05，< 0.01）；大脑组织SOD、CAT、GSH-Px、Na+-K+-ATP 和Ca2+-ATP酶活性显著升高（< 0.05，< 0.01），MDA含量明显降低（< 0.05，< 0.01）；血清TNF-α、IL-1β、NSE、S100β含量显著降低（< 0.05，< 0.01）；大脑组织Caspase-3、Bax mRNA水平和蛋白含量明显降低（< 0.05，< 0.01），Bcl-2、BDNF、NGF mRNA水平和蛋白含量明显升高（< 0.05，< 0.01）。以上结果表明GLAE能减轻过量胆红素对新生大鼠的大脑损伤，其作用机制可能通过改善新生大鼠大脑能量代谢，提高大脑抗氧化能力，增加神经营养因子含量，抑制炎症反应及凋亡基因的表达来发挥作用。

白肉灵芝水提物；胆红素脑病；抗氧化；神经营养；炎症；细胞凋亡；新生大鼠

高胆红素血症是新生儿中一种常发的疾病，主要临床表现为黄疸[1]。血清中高浓度的胆红素可透过血脑屏障，引发严重的并发症胆红素脑病，造成运动失调、肌张力障碍、智力低下、听力丧失、发育迟缓等后遗症，严重时可危及患者生命[2-5]。氧化应激、炎症反应、细胞凋亡、能量代谢障碍等被认为是高胆红素血症致病的主要因素[6-7]。目前针对高胆红素血症临床上主要采用光疗和换血，药物治疗主要应用安妥明、茵栀黄等[8]。但这些治疗方法存在极大的风险性，诸如会引起排斥反应、恶心、肝毒性等不良反应。而传统中药或天然产物中含有大量的活性成分，因其以多靶点、多层次、副作用少的特点用来预防神经退行及相关疾病，已成为了现代生物研究的热点[9]。研究发现在神经功能障碍中，脑源性神经生长因子（brain derived neurotrophic factor, BDNF）和神经生长因子（nerve growth factor, NGF) 是两种重要的神经营养蛋白，对神经元的生长、发育、分化、维持和损伤修复具有重要作用[10-11]。神经特异性烯醇化酶（neuron specific enolase, NSE）和中枢神经特异性蛋白（central nerve specific protein, S100β）是神经细胞中特有的标记物，可作为检测脑损伤的重要生化指标[12]。B淋巴细胞瘤-2（B-cell lymphoma-2, Bcl-2）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（cysteine aspartate protease 3, Caspase-3）、B淋巴细胞瘤-2 相关X（Bcl-2 assaciated X, Bax）是机体调控细胞凋亡的主要因子[13]。Na+-K+-ATP 和Ca2+-ATP酶存在于组织细胞和细胞器膜上，它是稳定细胞形态结构和细胞功能重要的蛋白酶[8]。超氧化物歧化酶（superoxide dismutase, SOD）、过氧化氢酶（catalase, CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase, GSH-Px）和丙二醛（malondialdehyde, MDA）是反应组织细胞抗氧化能力的主要检测指标[14]。肿瘤坏死因子-α（tumornecrosisfactor-α，TNF-α）、白细胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）是促进发炎免疫系统中的物质[15]。以上基于脑组织能量代谢、抗氧化能力、神经营养因子、凋亡蛋白及炎症因子在神经元损伤中有重要地位，已被学者们认为是诊断神经功能退行性疾病的重要指标与有效治疗的靶点。

白肉灵芝是我国灵芝属中的重要种类，含菌肉洁白，其多糖和三萜等活性成分含量较高，被视为高品质的灵芝种类[16]。现代药理研究表明，白肉灵芝中的生物活性成分稳定性高且易通过机体血脑屏障，能促进新生神经元的发生[17-18]，因此在防治神经退行性疾病中备受关注。本课题组前期研究表明，白肉灵芝水提物（aqueous extracts, GLAE）在增加皮肤弹性、减少皮肤皱纹形成、保护脑缺血后大脑神经元及大脑皮层神经元炎症损伤等方面有重要作用[15,19-20]，但在改善胆红素脑病方面的研究未见报道。为了进一步探讨GLAE的生物学作用，本研究建立了高血脂症动物模型，运用比色法、酶联免疫吸附、western blot和real-time PCR等研究了GLAE对胆红素脑病的改善作用及机制，以期为临床治疗相关疾病提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 试剂及仪器

GLAE本实验室培养制备；晶体胆红素（货号：L20141213，美国Sigma公司），总胆红素试剂盒（货号：20150916，南京建成生物工程研究所）；ELISA 试剂盒大鼠S100β（货号： HL20001，上海哈灵生物科技有限公司）、大鼠NSE（批号：20150903，上海江莱生物科技有限公司）、大鼠TNF-α（货号：H052-1，南京建成生物工程研究所）、大鼠IL-1β（货号：H002，南京建成生物工程研究所）；SOD、CAT、GSH-Px、MDA、ATP酶（货号分别为：A001、A007、A005、A003、A016，自南京建成生物工程研究所）；兔抗鼠BDNF、兔抗鼠NGF抗体（货号分别为ab222060、ab52918，Abcam公司），兔抗鼠caspase-3（批号：HS0608，美国Santa Cruz公司），兔抗鼠 Bax、兔抗鼠 Bcl-2 抗体（货号分别为：AB2915、AB10546，美国 millipore 公司）；β-actin（批号4970L，Cell signaling 公司），HRP 标记山羊抗兔IgG（批号 GB23303，Servicebio 公司）；RNA抽提试剂盒、反转录试剂、实时荧光定量PCR试剂购自TakaRa公司；引物由Invitrogen (上海) 公司设计合成。

主要仪器设备：U-1800型UV-VIS全自动分光光度计（日本Tokyo公司）；Bio-rad 550型酶标仪（美国Bio-rad公司）；DYCPZ 型电泳槽、DYY-IB 型电泳仪（北京市六一仪器厂）；GIS-500 凝胶成像仪（杭州米欧仪器有限公司）；TGL-16M高速台式冷冻离心机（美国Beckman-coulter公司）；7900 HT Sequence Detection System定量PCR仪（美国ABI公司）；核酸蛋白分析仪（美国贝克曼库尔特公司）。

1.2 实验动物分组、造模和给药

选取健康7 日龄新生SD大鼠（购自兰州兽医研究所实验动物中心），SPF级，许可证号：SCXK(甘)2015-0001，体质量为12 ～ 15 g。实验参照文献[21]，10只新生大鼠腹腔注射 0.5 mL 生理盐水作为对照组，其余大鼠腹腔注射100 μg/g胆红素，每天注射２次、共注射６次，观察大鼠皮肤逐渐变黄并加重，出现反应迟钝、转圈、俯伏、肌张力发生障碍、吃奶困难等神经行为学症状，表明高胆红素血症大鼠模型建立成功。将建模成功大鼠随机分为4组，即模型组、GLAE低剂量组、GLAE中剂量组、GLAE高剂量组，每组10只。GLAE低、中、高剂量组分别灌胃（以体质量计）（50、100、200 mg/kg）的GLAE[19]，对照组与模型组给予等体积生理盐水，连续处理2周。

1.3 胆红素含量测定

末次给药12 h后处死大鼠，采血离心取血清，采用微板法试剂盒测定总胆红素含量；大脑额叶组织标本加入蛋白裂解液、制作匀浆液后采用微板法试剂盒测定总胆红素含量[22]。

1.4 抗氧化酶活性测定

取大鼠大脑额叶组织，用预冷的生理盐水洗净血液，用滤纸吸干后称重、匀浆，3500 r/min离心10 min，按试剂盒的操作要求用全自动分光光度计测定SOD、CAT、GSH-Px、ATP酶活性及MDA含量。

1.5 IL-1β、TNF-α、S100β、NSE含量测定

血液4 ℃离心（3000 r/min）10 min，取血清参照 ELISA 试剂盒说明书的指导步骤检测其中IL-1β、TNF-α、S100β、NSE的含量。

1.6 PCR检测大脑额叶组织Caspase-3、Bax、Bcl-2、BDNF和NGF mRNA 的表达

在2.0 mL 的离心管中加入大脑额叶组织和Trizol后用匀浆器反复研磨，离心（15 000 r /min）10 min，取上清液通过酚-氯仿抽提RNA，再进行逆转录反应、PCR扩增。PCR按照试剂盒说明书进行操作。反应完毕采用 ABI 7500 软件分析，用2－△△Ct方法进行相对定量。引物信息见表1。

表1 目的基因引物序列

1.7 Western blot 检测大脑额叶组织Caspase-3、Bax、Bcl-2、BDNF和NGF蛋白的表达

在RIPA 裂解液中加入大脑额叶组织制成 10%的组织匀浆，4 ℃离心（1200 r/min）15 min，提取总蛋白，BCA法测定蛋白质浓度。凝胶电泳（SDS-PAGE）、转膜和封闭。按抗体说明书加入兔抗鼠一抗Caspase-3（1:2000）、Bax（1:1000）、Bcl-2（1:1500）、BDNF（1:1000）、NGF（1:1000），4 ℃过夜，充分洗涤，加偶联辣根过氧化物酶（HRP）的二抗IgG（1:2000），ECL显色，以β-actin（1:2 000）作为内参照，运用Image J1.8.0软件对western blot 曝光结果进行灰度分析。

1.8 数据统计与分析

2 结果

2.1 GLAE对高胆红素血症大鼠血清和大脑额叶组织胆红素含量的影响

由图1我们可知，与对照组比较，模型组大鼠血清和大脑额叶组织胆红素含量极显著升高（< 0.01）；与模型组比较，GLAE低、中、高剂量组大鼠血清和大脑额叶组织胆红素含量显著降低，且呈剂量依赖性（< 0.05，< 0.01）。

图1 GLAE对高胆红素血症新生大鼠血清和大脑胆红素含量的影响

注：组间条形图上标不同小写字母表示存在差异显著（< 0.05）；标不同大写字母表示差异极显著（< 0.01）；标相同字母或无字母标注表示差异不显著（> 0.05）

2.2 GLAE对高胆红素血症大鼠大脑额叶组织抗氧化能力的影响

由图2可知，与对照组结果相比较，模型组大鼠大脑额叶组织中SOD、CAT及GSH-Px活性极显著降低（< 0.01），MDA含量极显著升高（< 0.01）；与模型组相比，经GLAE干预后，大鼠大脑额叶组织中SOD、CAT及GSH-Px明显升高（< 0.05，< 0.01），MDA含量显著降低（< 0.05，< 0.01）。

图2 GLAE对高胆红素血症新生大鼠大脑抗氧化酶活性的影响

2.3 GLAE对高胆红素血症大鼠血清NSE、S100β含量的影响

由图3可知，与对照组相比，模型组大鼠血清NSE、S100β含量极显著升高（< 0.01）；与模型组相比，GLAE低、中、高剂量组大鼠血清NSE、S100β含量显著降低（< 0.05，< 0.01）。

图3 GLAE对高胆红素血症新生大鼠血清NSE和S100β含量的影响

2.4 GLAE对高胆红素血症大鼠血清TNF-α、IL-1β含量的影响

由图4可知，与对照组相比，模型组大鼠血清TNF-α、IL-1β含量极显著升高（< 0.01）；与模型组相比，GLAE低、中、高剂量组大鼠血清TNF-α、IL-1β含量显著降低（< 0.05，< 0.01）。

图4 GLAE对高胆红素血症新生大鼠血清TNF-α和IL-1β含量的影响

2.5 GLAE对高胆红素血症大鼠大脑额叶组织ATP酶活性的影响

由图5可知，与对照组相比，模型组大鼠大脑额叶组织Na+-K+-ATP和Ca2+-ATP活性极显著降低（< 0.01）；与模型组相比，GLAE低、中、高剂量组大鼠大脑额叶组织Na+-K+-ATP 和Ca2+-ATP活性显著升高（< 0.05，< 0.01）。

图5 GLAE对高胆红素血症新生大鼠血清ATP酶活性的影响

2.6 GLAE对高胆红素血症大鼠大脑额叶组织Caspase-3蛋白及mRNA 表达水平的影响

由图6可知，与对照组相比，模型组大鼠大脑额叶组织Caspase-3蛋白及mRNA的表达量均极显著增加（< 0.01）；与模型组比较，GLAE低、中、高剂量组大脑额叶组织Caspase-3蛋白及mRNA表达量均显著降低（< 0.05，< 0.01），其中GLAE高剂量组的抑制效果更明显。

图6 GLAE对高胆红素血症新生大鼠大脑额叶组织Caspase-3蛋白及mRNA表达的影响

2.7 GLAE对高胆红素血症大鼠肝组织Bax蛋白及mRNA 表达水平的影响

与对照组相比，模型组大鼠大脑额叶组织Bax蛋白和mRNA的表达量均极显著增加（< 0.01）；与模型组比较，GLAE低、中、高剂量组大脑额叶组织Bax蛋白及mRNA表达量均显著降低（< 0.05，< 0.01），并呈现剂量相关性（如图7）。

图7 GLAE对高胆红素血症新生大鼠大脑Bax蛋白及mRNA表达的作用

2.8 GLAE对高胆红素血症大鼠大脑额叶组织Bcl-2蛋白及mRNA 表达水平的影响

与对照组相比，模型组大鼠大脑额叶组织中Bcl-2蛋白和mRNA的表达量均极为显著地降低（< 0.01）；与模型组比较，GLAE低、中、高剂量组肝组织Bcl-2蛋白及mRNA表达量均显著升高（< 0.05，< 0.01），其中GLAE高剂量组促进大鼠大脑额叶组织Bcl-2表达水平的效果优于GLAE低、中剂量组（如图8）。

2.9 GLAE对高胆红素血症大鼠大脑额叶组织BDNF蛋白及mRNA 表达水平的影响

由图9可知，与对照组相比，模型组大鼠大脑额叶组织BDNF蛋白及mRNA的表达量均极显著降低（< 0.01）；与模型组比较，GLAE低、中、高剂量组大脑额叶组织BDNF蛋白及mRNA表达量均显著增加（< 0.05，< 0.01），提示GLAE可显著促使高胆红素血症大鼠脑组织BDNF蛋白及 mRNA 表达水平上调。

图9 GLAE对高胆红素血症新生大鼠大脑BDNF蛋白及mRNA表达的影响

2.10 GLAE对高胆红素血症大鼠大脑额叶组织NGF蛋白及mRNA表达水平的影响

由图10可知，与对照组相比，模型组大鼠大脑额叶组织NGF蛋白及mRNA表达水平明极显著降低（< 0.01）；与模型组比较，GLAE低、中、高剂量组大脑额叶组织NGF蛋白及mRNA表达水平均显著升高（< 0.05，< 0.01），且呈剂量相关性。提示GLAE可明显促进高胆红素血症大鼠大脑NGF蛋白及 mRNA 表达水平上调，使其表达水平显著升高。

图10 GLAE对高胆红素血症新生大鼠大脑NGF蛋白及mRNA表达的影响

3 讨论

新生儿的神经系统发育不完善，许多有害物质都能通过血脑屏障进入中枢神经系统而引发神经元损伤。黄疸是新生儿期常见的临床症状之一，其发病机制错综复杂。血中游离胆红素增高又是引发新生儿高胆红素血症脑病的重要致病因素[1]。过量的游离胆红素对中枢神经系统毒性是由可逆到不可逆逐渐发展的过程，可分为聚集、结合、沉淀三个步骤：首先单价胆红素阴离子聚集在神经元突触部位；其次与突触膜上的阳离子基团形成静电复合物，并掺和在细胞膜疏水脂质层中，这个过程可被外加白蛋白分子阻止并逆转；最后，当细胞膜脂质层中胆红素达到饱和状态时，诱导胆红素酸大量沉积于生物膜，影响神经细胞膜与线粒体的生物功能[5]。所以，前两个步骤对神经细胞损害是可逆的，而沉淀的损害是不可逆的。由于高胆红素血症脑损伤早期无特异性临床表现，导致治疗的滞后性，而早诊断并及时治疗常可恢复正常，这也是临床诊疗的重要依据。因此，本实验用高胆红素血症模型大鼠，从大脑能量代谢、抗氧化能力、神经营养因子、炎症反应及凋亡基因等方面，研究GLAE对大鼠高胆红素血症脑病的改善作用和作用机制。

胆红素是一种免疫抑制毒性物质，当血中浓度增高时，胆红素可透过神经元、星形胶质细胞等，激活NF-kB信号通路，从而释放促炎细胞因子（TNF-α、IL-1β等）导致过度炎症反应，造成脑损伤[23]。NSE、S100β是神经细胞内重要的功能因子，在中枢神经系统中高度特异表达，参与能量代谢、钙离子稳定等调控[22]。张小路等[8]研究表明新生儿高胆红素血症发生时可引起能量代谢障碍，降低脑组织中 Na+- K+- ATP 酶的活性，导致兴奋性氨基酸增多和细胞内 Ca2+超载，细胞凋亡增加，对胶质细胞和神经元都有毒性作用。同时，当高胆红素血致中枢神经系统损伤时，大量的NSE、S100β从损伤的神经细胞中释放进入血液和脑脊液[5,8]。因此，NSE、S100β可作为高胆红素血症脑损伤程度及预后估计的判断标准。而脑损伤时，氧自由基会引发继发性损害作用，SOD、CAT、GSH-Px和MDA都是反应组织氧化损伤生物标志物[24]。本实验采用腹腔注射胆红素溶液的方法构建高胆红素血症新生大鼠模型，结果显示，建模新生大鼠皮肤变黄，并逐渐加重，出现翻滚、俯伏、对外界刺激反应迟钝等症状，大鼠血清及大脑胆红素含量、血清 TNF-α、IL-1β、NSE、S100β水平显著升高，大脑组织SOD、CAT、GSH-Px、Na+-K+-ATP 和Ca2+-ATP酶活性显著降低，大脑MDA含量显著升高，表明胆红素引发了大脑神经细胞损坏、炎症反应、脂质氧化等病理变化，造成了神经功能障碍。不同剂量的GLAE处理高胆红素血症模型新生大鼠后，其血清及大脑胆红素含量、血清TNF-α、IL-1β、NSE、S100β水平显著降低，同时大脑组织SOD、CAT、GSH-Px、Na+-K+-ATP 和Ca2+-ATP酶活性显著升高，大脑MDA含量显著降低，表明GLAE可抑制大鼠的炎性因子和自由基释放，阻止炎症和氧化应激发生及进展，减轻脑损伤，改善神经功能障碍。

Bcl-2和Bax分别是抑制和促进细胞凋亡的关键调控基因，两者含量相对平稳地维系着细胞的新陈代谢。Caspase-3 被称为细胞凋亡的“分子开关”，是执行细胞凋亡过程中最主要的终末剪切酶[13]。一旦Bcl-2基因表达降低或Bax过量表达，均会活化Caspase-3基因刺激细胞加快凋亡和神经功能损伤加重[8]。因此，平衡Bcl-2/Bax、抑制 Caspase-3可能是治疗胆红素脑病的重要靶点[25]。BDNF和NGF 是最重要的神经营养因子，能促进细胞中枢和外周神经元的生长、发育、分化、成熟，维持细胞神经系统的正常功能，加快神经系统细胞损伤后的修复[10-11]。王娟等[26]研究高胆红素血症脑损伤时，发现bFGF对周围神经有营养、支持作用，同时海马区bFGF可通过调节 Bcl-2 和 Bax 的表达水平，参与高胆红素血症脑损伤后神经元的保护作用。因此，Bcl-2、Bax、Caspase-3、BDNF和NGF因子与改善高胆红素导致的脑损伤有密切关系。本实验研究以实时荧光定量PCR和western blot检测GLAE对高胆红素血症模型新生大鼠大脑组织Bcl-2、Bax、Caspase-3、BDNF和NGF mRNA水平和蛋白含量的影响，结果显示，模型大鼠经不同剂量的GLAE处理后，其大脑组织 Bcl-2、BDNF和NGF表达升高，Bax、Caspase-3表达降低，且GLAE各组呈剂量依赖性，表明GLAE可上调Bcl-2、BDNF和NGF表达，下调Bax、Caspase-3表达，减轻神经元的损伤，从而改善了大鼠的神经功能。

4 小结

综上所述，GLAE可通过改善新生大鼠大脑能量代谢，提高其大脑抗氧化能力，增加神经营养因子含量，抑制炎症反应及凋亡基因来减轻过量胆红素对新生大鼠的大脑损伤。此研究为高胆红素血症脑病中药新药或保健食品研发提供参考和理论依据，也为探究中药多靶点协同调控脂质代谢作用提供了有益的研究思路。

[1] 张素冰,周秀英,宫昌磊. 纳洛酮对高胆红素血症新生大鼠 Bcl-2/Bax通路及神经功能障碍的影响[J]. 中国优生与遗传杂志,2021,29(10):1378-1382.

[2] Agrawal A, Pandya S, Shrivastava J. Neurodevelopmental outcome at 6 months of age in full-term healthy newborns with neonatal hyperbilirubinemia[J]. J. Clin. Neonatol., 2020,9(2): 138-142.

[3] Lin YJ, Tsao PN. 211 G to A variation of UGT1A1 and severe neonatal hyperbilirubinemia[J]. Pediatr. Neonatol., 2018, 59(1):106-107.

[4] 欧小琴,龚春竹,郑忠梅,等.茵陈素调控 HIF-1α/BNIP3 通路对高胆红素血症新生大鼠模型神经损伤的保护作用[J].中国妇幼健康研究,2022,33(3):73-80.

[5] 申雅洁,阴怀清,曹芳芳,等.依达拉奉注射液对高胆红素血症脑损伤新生大鼠血清S100B蛋白水平的影响[J]. 中西医结合心脑血管病杂志,2017,15(17):2117-2120.

[6] Cai L, Liu X, Guo Q, et al. MiR-15a attenuates peripheral nerve injury-induced neuropathic pain by targeting AKT3 to regulate autophagy[J]. Genes Genomics,2020,42(1):77-85.

[7] Zhang L, Wang H, Fan Y, et al. Fucoxanthin provides neuro⁃protection in models of traumatic brain injury via the Nrf2-ARE and Nrf2-autophagy pathways[J].Sci. Rep., 2017, 7(1):46763-46777.

[8] 张小路,杜梅红,张全,等. 茵陈蒿汤对新生大鼠高胆红素血症的治疗作用及机制研究[J].新中医,2017,49(7): 1-5.

[9] Hasani-Ranjbar S, Nayebi N, Moradi L, et al. The efficacy and safety of herbal medicines used in the treatment of hyperlipidemia; A systematic review[J]. Current Pharmaceutical Design, 2010, 16(26):2935-2947.

[10] Stepanichev M, Onufriev M, Aniol V, et al. Effects of cerebrolysin on nerve growth factor system in the aging rat brain[J]. Restor. Neurol. Neuros., 2017, 35(6): 571-581.

[11] Molinari C, Morsanuto V, Rugas S, et al. The role of BDNF on aging-modulation markers[J]. Brain. Sci., 2020, 10(5): 285-294.

[12] Kanavaki A, Spengos K, Moraki M, et al. Serum levels of S100β and NSE proteins in patients with non-transfusion dependent thalassemia as biomarkers of brain ischemia and cerebral vasculopathy[J]. Int.J.Mol. Sci., 2017,18 (12): 2724-2731.

[13] 苏敏,王惠颖,任漪,等. 高胆红素血症对新生大鼠心肌的影响[J]. 中华新生儿科杂志,2022,37(1): 70-75.

[14] 叶文斌,何玉鹏,宫峥嵘,等. 红芪加工废弃物活性多糖对果蝇生育力和寿命及抗氧化能力的影响[J].井冈山大学学报:自然科学版. 2021,42(1):49-53.

[15] 王昱,秦序,何九军,等.白肉灵芝水提物对神经元损伤的保护作用及其机制[J]. 甘肃农业大学学报.2021,56(5): 28-34.

[16] Li T H, Hu H P, Deng W Q, et al. Ganoderma leucocontex-tum, a new member of the G. lucidum complex from southwestern China[J]. Mycoscience, 2015, 56: 81-85.

[17] 熊川,陈诚,陈祖琴,等.白肉灵芝水提物促进PC-12细胞分化作用研究[J].天然产物研究与开发, 2016, 28(7): 1135-1138.

[18] 熊川,陈诚,黄文丽,等. 白肉灵芝水提物对 H2O2诱导PC-12 细胞凋亡的保护作用[J]. 食品安全质量检测学报, 2016,7(2): 662-668.

[19] 王昱,何九军,张宗舟.白肉灵芝水提物对衰老大鼠皮肤的作用研究[J]. 天然产物研究与开发, 2019, 31(12): 2131-2136.

[20] 王昱,秦序,何九军,等.白肉灵芝水提物对脑缺血后大脑神经元损伤的保护作用[J]. 西北民族大学学报:自然科学版. 2021,42(3): 31-36.

[21] 王晓丽,郭明星,梁俊晖,等.新生大鼠高胆红素血症及脑病模型的建立与评价[J].中国病理生理杂志,2014,30(8): 1523- 1531

[22] 李良辰,卞相丽,吴志敏,等. 新生大鼠高胆红素血症模型脑组织中NLRP３小体活化与神经损害的相关性研究[J]. 中国儿童保健杂志2019,27(8):842-846.

[23] 郭爽,李晓捷,陶德双,等.布拉氏酵母菌联合早期干预对高胆红素血症仔鼠脑组织NF-kB表达和学习记忆功能的影响[J]. 中国儿童保健杂志,2018,26(8):849-853.

[24] Silvia M, Laura C, Roberta P, et al. Free radicals and neonatal brain injury: from underlying pathophysiology to antioxidant treatment perspectives[J]. Antioxidants, 2021, 10(12): 2012-2019.

[25] 陆红梅,何玉华,罗芯怡,等. 肾衰康灌肠液含药血清对HK-2细胞缺氧/复氧损伤的保护作用及对 Caspase-3、Bax、Bcl-2 mRNA 表达的影响[J].中华中医药学刊, 2021,39(3):218-227.

[26] 王娟,阴怀清,程皓,等.在高胆红素血症新生大鼠海马区碱性成纤维细胞生长因子的表达[J].山西医科大学学报, 2019, 50(10): 1408-1412.

EFFECT OFAQUEOUS EXTRACTS ON NEONATAL RATS WITH BILLIRUBIN ENCEPHALOPATHY

*WANG Yu1,2, HE Jiu-jun1,2

（1. Technique College of Agriculture and Forestry, Longnan Teachers College, Chengxian, Gansu 742500, China;2. Center for Research & Development of Longnan Characteristic Agro-bioresources, Longnan Teachers College, Chengxian, Gansu 742500, China）

To explore the improvement effect ofaqueous extracts (GLAE) on neonatal rats with bilirubin encephalopathy. A hyperbilirubinemia model of nenonatal rats was established by intraperitoneal injection of bilirubin. After successful model establishment, the rats were divided into five groups: control group, model group, GLAE low-dose group, GLAE middle-dose group and GLAE high-dose group, and given GLAE at doses of 0, 50, 100, 200 mg/kg by intragastric administration. The contents of bilirubin in serum and cerebral tissue of rats were detected by kit. Colorimetry was used to detect the activities of ATPase, superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT), glutathione peroxidase (GSH-Px) and malondialdehyde (MDA) contents in cerebral tissue. And the contents of tumornecrosisfactor-α (TNF-α), interleukin-1β (IL-1β), neuron specific enolase (NSE) and central nerve specific protein (S100β) in serum were detected by ELISA. Quantitative PCR and western blot were used to detect mRNA and protein content changes of B-cell lymphoma-2 (Bcl-2), cysteine aspartate protease 3(Caspase-3), Bcl-2 assaciated X (Bax), brain derived neurotrophic factor (BDNF) and nerve growth factor (NGF) in cerebral tissue. Results showed that compared with the model group, GLAE administration could obviously decrease the bilirubin contents in serum and cerebral tissue to varying degrees, significantly activate the activities of SOD, CAT, GPx, Na+-K+-ATP and Ca2+-ATPase (< 0.05,< 0.01), while reduce the contents of MDA in cerebral tissue (< 0.05,< 0.01). Moreover, the contents of TNF-α, IL-1β, NSE and S100β in serum increased (< 0.05,< 0.01). The mRNA levels and protein contents of Caspase-3 and Bax decreased (< 0.05,< 0.01), meanwhile increased for Bcl-2, BDNF and NGF in cerebral tissue (< 0.05,< 0.01). The results of the present study indicated that GLAE could reduce the cerebral damage of excess bilirubin on new born rats. Its mechanism may be related to improving the cerebral energy metabolism, increasing the cerebral antioxidant capacity and neurotrophic factor content, inhibit expression of inflammatory response and apoptosis genes.

aqueous extracts; bilirubin encephalopathy; antioxidant; neurotrophy; inflammation; apoptosis; neonatal rat

1674-8085（2023）05-0064-09

Q593+.1

A

10.3969/j.issn.1674-8085.2023.05.010

2022-09-24；

2023-06-17

国家自然科学基金项目(32160055)；甘肃省科技重大专项(21ZD4NK045)；甘肃省陇南市科技计划项目(2019-ZD-10)

*王 昱(1973-)，男，甘肃天水人，教授，硕士，主要从事天然产物药理、细胞与发育生物学研究(E-mail:gswangyu@126.com).