两种口蹄疫O 型、A 型抗体检测试剂盒检测猪口蹄疫抗体的应用研究

刘利芳，杨思宇，李撒

（郑州中农快检科技有限公司 郑州 451164）

口蹄疫是由口蹄疫病毒（foot-and-mouth disease virus，FMDV）引起的人畜共患传染病，是畜间发生于牛、羊、猪等偶蹄动物的一种急性、热性、高度接触性传染病。该病传播迅速，流行面广，成年动物多取良性经过，幼龄动物多因心肌受损而死亡率较高。本病广泛流行于世界各地，由于本病使动物及其产品流通和国际贸易受到限制，造成了巨大的经济损失，世界动物卫生组织将口蹄疫列为动物A 类传染病，我国《中华人民共和国动物防疫法》将其列为一类疫病[1]。目前在我国，疫苗免疫是最主要手段。酶联免疫吸附试验因在口蹄疫检测中具有敏感、特异、稳定、安全、快速、简单易于操作等特点而备受青睐。本研究利用两种口蹄疫ELISA 检测试剂盒对血清进行检测，研究不同试剂盒的应用情况，以期选择更简便准确的方法用于大规模检测，以便做好口蹄疫防治工作，也有利于试剂盒的不断改进。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 血清样品

1）四份已知中和抗体效价的猪口蹄疫O 型血清，编号N 为9 号、10 号、11 号、17 号。一份已免疫口蹄疫猪只血清，编号N为20 号。血清均由河南猪拱门生物科技有限公司提供。

2）样品处理：将上述血清分别以2 倍倍比稀释至1:512，分装至1.5ml 离心管内，并依次编号为N-1～N-9，含原血清共50 个待检样品。

1.1.2 检测试剂

1）口蹄疫病毒A 型、O 型液相阻断ELISA 抗体检测试剂盒。

2）口蹄疫病毒A 型、O 型抗体固相竞争ELISA 检测试剂盒。

1.1.3 主要仪器

酶标仪（BioTek ELX808）、移液器（Eppendorf）、电热恒温培养箱（精宏DNP-9082）、生化培养箱（精宏SUP-080）。

1.2 检测方法

1.2.1 固相竞争ELISA 检测试剂盒检测：

1）实验方法主要参考说明书，实验流程如下：①用ELISA 稀释液依次1/10 倍稀释样本血清、1/10 和1/30 倍稀释阳性血清；②加样布局如表1 所示，50 μL/孔依次加入阴性对照、1/10 倍稀释的样本血清、1/10 倍和1/30 倍稀释的阳性对照，室温孵育1 h；③加酶标记物25 μL/孔，室温孵育1 h；④1×洗液200 μL/孔，洗板4 次；⑤加底物显色液50 μL/孔，室温避光孵育20 min；⑥加终止液50 μL/孔，酶标仪读取OD450nm值。

表1 口蹄疫病毒A、O型抗体固相竞争ELISA试验酶标板样品布局

2）实验成立条件：A 型阴性对照OD 值≥0.8，O 型阴性对照OD值≥1.0；A 型、O 型阳性对照血清的阻断率在1/10 稀释时应≥85%，在1/30 时＞50%。

3）结果判定：阻断率≥50%时为阳性；阻断率＜50%时为阴性。

1.2.2 液相阻断ELISA 检测试剂盒检测：

1）实验流程：①选择10 份样品布局操作，使用5 板，加样布局如表2 所示，A1～A10：75μl 1×PBST+25μl 待检样品；A11～A12：50μl 1×PBST+50μl 阳性、阴性对照；B1～12、C1～H11：50μl 1×PBST；2×倍比稀释（阴性对照只稀释2 孔）50μl/孔；4 个病毒抗原对照孔加工作浓度病毒抗原100μl/孔，其余各孔加50μl/孔，37℃温育30min。②1×PBST 270μl/孔，洗板3 次。③加酶标抗体工作液50μl/孔，37℃温育30min。④1×PBST 270μl/孔，洗板3 次。⑤加混合底物液50μl/孔（TMB 底物A 溶液与B 溶液1:1 混合），37℃温育15min。⑥加终止液50μl/孔，酶标仪读取OD450nm值。

表2 口蹄疫病毒A、O型抗体液相阻断ELISA试验酶标板样品布局（板1～板5）

2）实验成立条件：4 孔病毒抗原对照OD450nm值应在1.0 以上。阳性对照抗体效价应在1:1024±1 滴度以内，阴性对照血清抗体效价应＜1:8。

3）结果判定：抗体效价大于或等于1:128 判为口蹄疫抗体阳性；1:64～1:128 时，判为可疑；小于1:64，判定为阴性。可疑血清样品，可以重测，重测抗体效价大于或等于1:128，判为阳性，小于1:128 判为阴性。

2 结果与分析

2.1 50 份样本抗体阳性检测结果（表3）

表3 50份样本抗体阳性检测结果

1）从表3 可以看出血清10 号、11 号和17 号三组，O 型固相竞争ELISA 检测试剂盒检测结果阳性数高于O 型液相阻断，9 号和20 号两组，O 型液相阻断ELISA 检测试剂盒检测结果阳性数高于O 型固相竞争ELISA 检测试剂盒，总体来说，两种O 型试剂盒检测结果阳性率差别不大。

2）血清9 号、10 号、11 号和17 号四组都是O 型抗体血清（无A 型抗体），A 型固相竞争ELISA 检测试剂盒检测结果全为阴性，无假阳性，符合预期，但A 型液相阻断ELISA 检测试剂盒检测的每组均出现了假阳性。相对来说，A 型固相竞争ELISA检测试剂盒的特异性较好。

2.2 O 型试剂盒检测结果与中和抗体的线性关系

1）固相竞争ELISA 检测试剂盒检测阻断值与中和抗体的线性关系（图1）

图1 固相竞争-FMD-O-ELISA-BR（%）与中和抗体的线性关系

O 型固相竞争ELISA 检测试剂盒检测值与中和抗体呈现强线性关系（线性系数R＞0.9）（图1），证明此O 型固相竞争ELISA 检测试剂盒是合适的免疫评估试剂盒[2]。

2）液相阻断ELISA 抗体检测试剂盒检测抗体效价与中和抗体的线性关系

图2 显示此口蹄疫O 型抗体液相阻断ELISA 检测试剂盒在待检血清稀释到512 倍处于高抗原、低抗体水平进行检测时出现钩状效应中的后带现象，这是试剂盒不稳定的一种现象。液相阻断试剂盒检测连续被成倍稀释的血清易得相同的抗体效价值（如1 024、720、360、180 等），检测结果区别度不高，这也是试剂盒不稳定的外在表现之一。同时，检测范围受限，高抗体即超过效价1 024，就无法检测出来了。

图2 液相阻断-FMD-O-ELISA-Titer 与中和抗体的线性关系

3 结论与讨论

1）从本次试验结果发现O 型抗体固相竞争ELISA 检测试剂盒和O 型抗体液相阻断ELISA 检测试剂盒的阳性率相差不大；A 型抗体固相竞争ELISA 检测试剂盒较A 型抗体液相阻断ELISA 检测试剂盒特异性强，且A 型抗体固相竞争ELISA 检测试剂盒检测值与中和抗体呈现更强线性关系，稳定性较好。

2）实验结果显示A 型抗体液相阻断ELISA 检测试剂盒在检测O 型抗体血清时每组均出现假阳性结果，推测O 型液相阻断试剂盒是否也会存在假阳性，值得进一步验证。

3）综合来看，液相阻断ELISA 检测试剂盒能测定血清中的具体抗体效价值，但其特异性、稳定性仍需提高，且操作过程涉及血清梯度稀释步骤烦琐，对人员实验技术要求高，同时一板反应板检测样品数量少（10 份）成本较高，需测定血清中的具体抗体效价可选择液相阻断ELISA 检测试剂盒。固相竞争ELISA 检测试剂盒在操作方面同时具有简便、耗时短的优点，且一板反应板检测样品数量90 份，检测成本低。在实际应用中多数基层检测是进行口蹄疫抗体定性分析，用于确定口蹄疫抗体水平是否在保护范围内[3]，因此更推荐基层兽医实验室选择使用固相竞争ELISA 检测试剂盒。■