超声协同L-半胱氨酸/尿素体系制备鸭毛角蛋白材料

赵心雨，林海涛

（广西科技大学 生物与化学工程学院，广西 柳州 545006）

石油资源的逐渐减少和社会工业的不断发展，以及不可生物降解的合成聚合物材料加剧了环境污染，使得纤维素、大豆蛋白和动物毛发角蛋白这类可生物降解并可再生的天然高分子聚合物受到人们的重视[1]。其中鸭毛除了用作填料的少量隔热材料外，大多数都被丢弃，导致其利用率不高，这不仅浪费了大量的动物蛋白资源，还污染了人们赖以生存的环境[2]。合理提取现有鸭毛蛋白资源，从而实现纺织材料资源再生对环境保护有重要意义。

鸭毛角蛋白包含不同种类氨基酸，其中胱氨酸、脯氨酸、甘氨酸含量较高。α-helix 和β-sheet 是蛋白质中主要的二级结构[3]。角蛋白中二硫键含量较多的原因是存在胱氨酸，其在蛋白质肽链中起交联作用，因此角蛋白化学性质特别稳定，有较高的机械强度[4]。羊毛角蛋白的提取最关键的环节是破坏其化学键，尤其是二硫键。目前，提取羊毛角蛋白的方法主要有物理法和化学法[5]。由于物理法提取物不纯，利用价值不高，故应用比较多的是化学法。化学法提取羊毛角蛋白主要有氧化法、酸碱法、还原法、离子液体法等，其中还原法是应用较多的一种化学提取方法[6]。然而，在提取过程中，常用的还原剂存在毒性大、价格高、溶解率低、提取效果差等问题。为了解决这些存在的问题，本文选用无毒、无害和多样的化合物L-半胱氨酸作为还原剂。L-半胱氨酸结构中的巯基用于破坏鸭毛蛋白大分子之间的二硫键，以获得具有完整和均匀结构的微米级角蛋白材料。本研究在超声协同的条件下，探讨了超声功率、超声频率以及搅拌速率对羽毛溶解的影响[1，7]。

1 实验部分

1.1 实验材料

鸭毛（台前县飞腾羽绒制品有限公司），尿素（四川西陇科学有限公司），L-半胱胺酸[阿拉丁试剂（上海）有限公司]，氢氧化钠（四川西陇科学有限公司），乙酸（四川西陇科学有限公司）。

1.2 实验仪器

YB71 型旦尼尔电子天平（常州市幸运电子设备有限公司)，BPG-9240A 精密鼓风干燥机（上海一恒科学仪器有限公司），SHA-C 水浴恒温振荡器（郑州生元仪器有限公司），PHS-25CW pH 计（上海般特仪器制造有限公司），Phenom prox 扫描电子显微镜[复纳科学仪器（上海）有限公司]，DM4B 自动荧光显微镜（德国徕卡公司），HJ-6 恒速电动搅拌器（上海般特仪器制造有限公司），TF-FD18 冷冻干燥机（上海田枫实业有限公司）。

1.3 实验方法

1.3.1 鸭毛清洗除杂

在溶解前，将鸭毛放在洗洁精和去离子水混合液中浸泡并清洗3～5 次，同时清理鸭毛表面的其他杂质，去除灰烬，确保清洗干净，最后放进65℃烘箱中烘干至质量恒定，室温保存备用。

1.3.2 角蛋白材料的制备

称取适当质量干净的鸭毛，放入浓度为8mol/L 尿素溶液中，浴比为1∶50，再加入0.1wt%半胱氨酸还原剂，用5wt%NaOH 溶液调节pH 值至8.5，在恒温控制的超声波磁力搅拌器中反应10h，在80℃下提取，获得角蛋白悬浮液。角蛋白悬浮液经过滤、离心、收集后倒入透析袋中，用去离子水透析3d，透析结束后用8wt%乙酸溶液将溶液的pH 值调节为约4.5，沉淀角蛋白，以8000r/min 离心并收集新鲜角蛋白。新鲜角蛋白经沉淀、冷冻干燥后研磨粉碎得到干燥角蛋白，在干燥、避光的环境下保存备用。

在实验过程中，将搅拌速率设置为0rpm、200rpm、250rpm、300rpm、350rpm，超声功率设置为100W、200W、300W、400W、500W，超声溶解时间设置为6h、7h、8h、9h、10h，在此实验条件下采用单因素控制法进行实验。

1.4 测试方法

1.4.1 溶解率测定

将溶解前的鸭毛质量计作M1，经纯化干燥后制得纯角蛋白粉体质量计为M2，按公式（1）进行溶解率计算。

式中：M1为溶解前质量，g；M2为溶解后质量，g；η为溶解率。

1.4.2 显微镜观测

用滴管取适量的角蛋白溶液，放在载玻片上，准备另一个临时载玻片。用显微镜观察溶解的角蛋白溶液，观察鸭毛的溶解率并拍照记录。

1.4.3 扫描电镜观察

采用日本日立公司JSM-6510LV 电子显微镜（SEM）观察角蛋白粉形态结构。将适量角蛋白粉粘在电镜样品台上，并做喷金处理（电流10mA，处理时间60s）。工作电压为3kV、电流为10μA，保存SEM 影像后，对样品进行形貌观察分析。

1.4.4 傅里叶红外光谱（FTIR）测试

将需要的角蛋白研磨成细小的粉末状，取适量粉末与溴化钾粉末（比例为1∶100）充分混合后通过压力设备制成薄片状，用FTIR 对其进行红外测试，扫描范围500～4000 cm-1，分辨率4 cm-1，扫描次数64 次。

2 结果与分析

2.1 在超声辅助下搅拌速率对鸭毛角蛋白溶解的影响

选择单因素控制法，在超声功率为100W，超声溶解时间为10h、温度为80℃的条件下，研究搅拌速率对鸭毛角蛋白溶解程度的影响。

2.1.1 溶解率测定

图1 为角蛋白纤维溶解率在100W 超声功率辅助下随搅拌速率变化曲线图，从图中可以看出，搅拌对角蛋白纤维溶解率的影响明显，且在误差范围内变动。搅拌速度200rpm 时，溶解率上升了5%；搅拌速度200rpm～300rmp 时，溶解率逐渐增大，且上升速率较快。当搅拌速率达到400rpm 时，溶解率达到66.3%，但此时搅拌速率过快，造成杯壁出现细小裂纹。搅拌速率的增大可以增加溶液与鸭毛接触，使其充分反应，从而溶解率增大。图2 为不同搅拌速率对角蛋白纤维溶解情况光学显微镜观测实拍图，由图可知溶解过程未搅拌时，角蛋白纤维被溶解成较长的纤维，均匀性较好；而在溶解过程中进行持续搅拌，速率达到200rpm 时，角蛋白纤维被溶解成长短不一致的短纤维，均匀性相对较差，且尺寸不一。实验结果表明，搅拌速率的大小对生成的短纤维或微粒均匀性影响明显，持续进行搅拌即可得到均一性较好的产物。

图1 角蛋白纤维溶解率随搅拌速率变化曲线图

图2 不同溶解搅拌速率对角蛋白纤维溶解情况光学显微镜观测图

2.1.2 形貌观察

图3 为不同浴比所得角蛋白材料的SEM 图。当搅拌速率为0rpm 时，可以看出在一定超声协同下L-半胱氨酸/尿素溶解体系能够溶解鸭毛角蛋白材料，但是其均匀性不佳，仍存在大尺径角蛋白材料。当搅拌速率为200rpm 时，相比于0rpm 的均匀性并无提升，尺径变化较小。当搅拌速率为250rpm、300rpm 时，角蛋白材料均匀性相对变化较大，能看到大量的角蛋白原纤从表面脱落，尺径进一步减小。当搅拌速率为350rpm 时，可以看出此时的角蛋白材料均匀性相对最佳。因为搅拌速率的增大会导致材料结构分散，所以在尺寸方面的影响较大。实验结果表明，搅拌速率对于角蛋白材料的均匀性、溶解程度均有一定的影响，但是过大的搅拌速率会导致烧杯出现少量裂纹，故选择搅拌速率为250rpm 进行后续实验。

图3 不同搅拌速率所得角蛋白材料的SEM 图

2.1.3 化学结构分析

使用红外光谱测试研究再生角蛋白粉末的化学结构，结果见图4。5 种样品的曲线都具有相似的特征峰，表明在不同搅拌速率下获得的角蛋白是一致的。

图4 不同搅拌速率所得角蛋白材料的傅里叶红外光谱图

经对比发现5 种样品特征峰相似，都显示出相似的特征透射带，也证明了搅拌速率对蛋白质的结构几乎没有造成影响，原因主要是其中含有肽键（-CONH-），这些肽键分为酰胺Ⅰ、酰胺Ⅱ和酰胺Ⅲ。酰胺Ⅲ条带提供了关于蛋白质构造以及骨架结构的重要信息。结合文献数据和图形分析，所有的样品都含有αhelix 和β-sheet 这2 种微观结构。而随着搅拌速率的增加，α-helix 和β-sheet 这2 种微观结构的含量也随之增大。

2.2 超声功率对鸭毛角蛋白溶解的影响

选择单因素控制法，在搅拌速率为250rpm，溶解时间为10h、温度为80℃的条件下，研究超声功率对鸭毛角蛋白溶解程度的影响。

2.2.1 溶解率测定

角蛋白纤维溶解率随超声功率变化曲线图见图5。从图中可以看出角蛋白纤维的溶解率受超声功率影响较大。当超声功率从100W 增大至500W 时，溶解率从63.1%增大至70.1%，提高了7%。实验结果表明，溶解率随着超声功率的增大而增加，这说明超声功率越大越有利于促进L-半胱氨酸/尿素溶解体系对角蛋白纤维的溶解。在放大200 倍条件下不同超声功率对角蛋白纤维溶解情况光学显微镜观测实拍图见图6。从图中可以看到，当超声功率为100W 时，角蛋白纤维被溶解成长短不一致的短纤维，均匀性相对较差，且尺寸不一。实验结果表明，角蛋白纤维的平均长度随超声功率的增加而减小，且均匀性也随超声功率的增加而变得更好。这说明增加超声功率，可以促使L-半胱氨酸/尿素溶解体溶液更快溶解角蛋白纤维，可生成尺寸更小、均匀性更好的丝素蛋白材料。

图5 角蛋白纤维溶解率随超声功率变化曲线图

图6 不同超声功率对角蛋白纤维溶解情况光学显微镜观测图

2.2.2 形貌观察

不同超声功率所得角蛋白材料的SEM 图见图7。当超声功率为100W 时，角蛋白纤维的溶解性较差，所得产物基本为尺径较长的短纤维。当超声功率为200W 时，材料仍具有较为完整的纤维状态，但纤维表面已经呈现溃散性。当超声功率为300W 时，所得材料结构相对变化明显，纤维结构受到破坏程度加剧，溶解成为分散性纤维结构。当超声功率为400W 时，角蛋白材料呈现出较为均匀的分散结构，破坏加剧，尺径明显减小且均匀性达到较好状态。当超声功率为500W 时，角蛋白材料尺径继续减小，形貌为不规则分散结构，已处于要被进一步分散的状态。实验结果表明，随着超声功率的增大，所得的角蛋白材料结构破坏加剧，尺径更小，均匀性更佳。

图7 不同超声功率所得角蛋白材料的SEM 图

2.2.3 分子结构分析

不同超声功率所得角蛋白材料的傅里叶红外光谱图见图8。5 种样品都显示出相似的特征透射带。

图8 不同超声功率所得角蛋白材料的傅里叶红外光谱图

结合文献数据和图形分析，随着超声功率改变，L-半胱氨酸/尿素溶解体系角蛋白材料的特征峰增强，说明超声L-半胱氨酸/尿素溶解体系溶解能够促进角蛋白结构的无规则结构向α-helix 结构和β-sheet 结构转换。当超声功率为400W 时α-helix 和β-sheet 结构的特征峰最为明显，而当超声功率为500W 时其特征峰明显减弱，说明该功率下角蛋白的α-helix 结构遭到破坏，其与形貌观察结果一致。实验结果表明，超声辅助对于L-半胱氨酸/尿素溶解体系溶解角蛋白纤维的结构有促进作用，但是功率过高时会对纤维结构产生破坏。当超声功率为400W 时，L-半胱氨酸/尿素溶解体系对于溶解角蛋白纤维结构的促进最大，故本实验采用超声功率为400W。

2.3 在超声辅助下时间对鸭毛角蛋白溶解的影响

选择单因素控制法，在搅拌速率为250rpm，超声功率为400W、温度为80℃的条件下，研究超声溶解时间对于鸭毛角蛋白溶解程度的影响。

2.3.1 溶解率测定

在400W 超声功率辅助下，角蛋白纤维溶解率随超声溶解时间变化曲线图见图9。从图9 可以看出，溶解率随超声溶解时间的增加而增加，但溶解率的增加速率随着时间的增加而减小。当超声溶解时间从6h延长至10h 后，溶解率由69.2%提高到73.8%，提高了4.6%。图10 为超声协同下不同超声溶解时间对角蛋白纤维溶解情况光学显微镜观测实拍图。从图中可以看到，在超声溶解时长为10h 以内时，制得的角蛋白短纤长度和粒径随超声溶解时间的增加而减小，且均匀性良好。实验结果表明，在超声辅助下，虽然溶解率随时间的增加而增大，但溶解率变化较小，可为制得均匀角蛋白膜溶液提供良好基础。

图9 角蛋白纤维溶解率随超声溶解时间变化曲线图

图10 不同超声溶解时间角蛋白纤维溶解情况光学显微镜观测图

2.3.2 形貌观察

不同超声溶解时间所得角蛋白材料的SEM 图见图11。当超声溶解时间为6h 时，角蛋白材料纤维未能达到较好的溶解状态，纤维尺径较长，均匀性较差。当超声溶解时间为7h 时，角蛋白材料具有一定的原纤结构，溶解程度加剧，尺径减小。当超声溶解时间为8h时，角蛋白材料纤维已经溶解松散且均匀。当超声溶解时间为9h 时，角蛋白材料纤维表面呈现溃散现象并具有良好的纤维形态。当超声溶解时间为10h 时，角蛋白材料纤维表面呈现严重脱落和溃散现象。实验结果表明，超声溶解时间为8～10h 时，随着超声溶解时间的增加，所得的角蛋白材料尺寸不断变小，会对纤维的表面造成一定的破坏。

图11 不同超声溶解时间所得角蛋白材料的SEM 图

2.3.3 分子结构分析

不同超声溶解时间所得角蛋白材料的傅里叶红外光谱图见图12。5 种样品都显示出相似的特征透射带。

图12 不同超声溶解时间所得角蛋白材料的傅里叶红外光谱图

根据文献数据分析，3293cm-1（酰胺A）的峰表示α-helix 结构，1539cm-1～1515cm-1（酰胺Ⅱ）范围与βsheet 结构相关，1666cm-1和1655cm-1（酰胺Ⅰ）的分裂峰是α-helix 结构和β-sheet 结构的结合。由图12 可以看出，随着超声溶解时间的延长，3293cm-1（酰胺A）和1539cm-1～1515cm-1（酰胺Ⅱ）的特征峰增强，说明在一定反应时间范围内，角蛋白结构中无卷曲结构向αhelix、β-sheet 结构的转化。当超声溶解时间超过8h时，其特征吸收峰相似，α-helix 结构、β-sheet 结构含量最高。

3 结语

本研究基于L-半胱氨酸/尿素溶解体系制备角蛋白材料，用超声协同的方法，探究了不同搅拌速率、不同超声功率、不同超声溶解时间对于角蛋白纤维溶解的影响，确定超声优化后最佳的溶解工艺参数，具体结论如下：超声协同L-半胱氨酸/尿素法制备角蛋白材料的最佳工艺参数是转速为250rmp、超声功率为400W、超声溶解时间为8h。此时，相较于未加超声实验，溶解率达到72.6%，相对提高了26.7%，溶解时间缩短2h，且所得材料的尺寸以及表面形貌相对最佳，角蛋白纤维具有较为完整的形态结构，同时化学结构完整性表现良好，可为后续制备膜材料提供原材料。此外，本研究将利用大量废弃羽毛制得角蛋白材料，对实现纺织材料资源再生，促进环境保护具有重要意义。