功能性老年乳粉中300种非法添加药物及其类似物的液相色谱-高分辨质谱分析

2023-11-16 13:53金绍明李志远杨崇俊

色谱 2023年11期

宁霄, 金绍明, 李志远, 杨崇俊, 貌达, 曹进*

(1.中国食品药品检定研究院,北京 100050; 2.SCIEX中国,北京 100015; 3.济宁市公安局刑事科学技术研究所,山东济宁 272000; 4.中国计量科学研究院化学计量与分析科学研究所,北京 100029)

随着我国老龄化进程不断加剧,保养保健观念逐步普及,人们对功能性食品的需求也从保健食品延伸到了普通食品[1]。为了迎合老年群体个性化的需求,宣称具有调节血糖、增强免疫力和改善睡眠等功能的老年乳粉不断涌现[2],一些生产企业通过非法添加化学药物来实现产品声称的显著功效,对老年人的健康构成潜在威胁[3]。

非法添加的化学药物种类繁多,添加剂量及种类不明确[4-6]。现有国家标准方法针对已知化学物质进行靶向分析,需要按照功能声称分类别进行检测,涉及方法种类繁多,且前处理及检测技术不尽相同,既耗费人力物力,又严重制约了监管部门对未知风险物质的侦查能力。因此,迫切需要开发一种简便、灵敏的不受类别限制的高通量分析方法,用于新兴功能性老年乳粉中非法添加化学药物的高效侦查。

高分辨质谱可以提供更高的选择性和质量精度[7,8],结合色谱分离手段,可实现对异构体或具有相似精确质量数分子的准确区分[9]。但现有研究多针对单一或几个类别的已知药物建立筛查数据库,同时实现对数据库中已知化合物定量分析和对未知结构类似物预测确证的策略报道较少。顺序窗口采集所有理论质谱模式(sequential window acquisition of all theoretical mass spectra,SWATH)结合数据非依赖型采集(data-independent acquisition,DIA)技术克服了原有依赖型采集(data-dependent acquisition,DDA)模式的随机性和局限性,具有快速的采集速度、高质量的MS/MS数据和显著提高二级碎片灵敏度等优势[10]。此外,对于未知物的鉴定,区别于传统的碰撞活化解离(collision-activated dissociation,CAD)碎裂技术,新型的电子激活解离(electron-activated dissociation,EAD)碎裂技术通过独立捕获前体离子和自由电子,实现有效的自由基断裂,从而获得更丰富的碎片信息,与CAD形成良好的互补性,有效提升定性和未知物解析的准确度。上述技术赋予UHPLC-HRMS兼具小分子定性和定量分析的潜力,已逐步应用于蛋白质组学领域,但在食品领域中的应用尚待开发。

在样品前处理方面,已有研究使用有机溶剂稀释提取后直接分析[11-13],然而,复杂食品基质中多种化合物的分析很容易受到基质干扰[14]。部分研究尝试采用萃取技术改善基质效应[15-20],但操作耗时,且缺乏基质特异性验证的信息及探讨[21-24]。

本研究针对老年人近年来关注的功能性乳粉,将QuEChERS与基于SWATH DIA的超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱(ultra-high performance liquid chromatography-quadrupole-time of flight-mass spectrometry,UHPLC-QTOF-MS)分析技术相结合,对我国相关标准涉及的检测指标补充完善,建立了300种非法添加药物筛查数据库及定量分析方法,检测目标物涉及降血压、降血糖、减肥降脂、镇定安眠及解热镇痛等药物。该方法操作简便,单次进样,无需标准品,即可预判多类功效产品中已知药物的非法添加情况,适用于大批量样品的快速测定。此外,基于EAD碎裂技术获得的丰富二级碎片质谱裂解信息,本工作构建了对样品中未知非法添加药物的识别鉴定策略。该研究成功应用于市售功能性老年乳粉中非法添加物的侦查,识别出已知及未知风险物质共3种。

1 实验部分

1.1 仪器、试剂与材料

Exion LC 2.0 超高效液相色谱-Zeno TOF 7600四极杆飞行时间质谱,配备Zeno trap离子阱和EAD碰撞室(美国AB SCIEX公司);离心机CR22GⅢ(日本HITACHI公司);电子天平XP205(瑞士Mettler Toledo公司);纯水仪Milli-Q (美国Millipore公司)。

所有化合物标准品均为标准溶液,质量浓度为1 mg/mL,购自天津阿尔塔科技有限公司。甲醇(MeOH)、乙腈(ACN)、甲酸铵(质谱纯,NH4HCO2)均购于美国ThermoFisher公司;甲酸(质谱纯,FA)购于美国Fluka公司;实验用水为超纯水(符合GB/T 6682-2008一级水要求);硫酸镁(MgSO4)、硫酸钠(Na2SO4)、乙酸钠(NaAc)、氯化钠(NaCl)、柠檬酸(C6H8O7·H2O)、十二水合磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O)、乙二胺四乙酸二钠(Na2EDTA)均为分析纯,购于国药集团化学试剂有限公司;EMR-Lipid净化材料购于美国Agilent公司。

市售样品(60个)购自北京、广西、山东等地超市或农贸市场,根据不同样品的市场占有率情况,本研究抽取样品的数量如下:声称增强免疫力/缓解体力疲劳类乳粉共33份,声称辅助调节血糖/血压/血脂类乳粉共15份,声称补肾壮阳类乳粉共12份。购买后置于阴凉处常温保存。

1.2 溶液配制

Mcllvaine溶液:将1 000 mL 0.1 mol/L的柠檬酸溶液与625 mL 0.2 mol/L磷酸氢二钠混合而得; 0.1 mol/L Na2EDTA-Mcllvaine溶液:称取60.5 g乙二胺四乙酸二钠于1 625 mL Mcllvaine溶液中,溶解并摇匀。

混合标准中间溶液配制:取适量标准溶液,用乙腈稀释,配制成1 mg/L的混合标准溶液,于4 ℃保存。

空白基质提取液:空白样品按照1.3节条件进行前处理,获得空白基质提取液。

基质混合标准溶液的配制:准确吸取适量混合标准中间液,用空白基质提取液逐级稀释成系列质量浓度的基质混合标准溶液。

1.3 样品前处理方法

称取2 g乳粉样品于50 mL具塞离心管中,加入10 mL 40 ℃温水,涡旋1 min,使成均匀乳液。加入10 mL 0.1 mol/L Na2EDTA-Mcllvaine溶液-乙腈(2∶8,v/v),随后加入2 g Na2SO4和0.5 g NaCl进行盐析,漩涡30 s,超声10 min,4 ℃下以10 000 r/min离心5 min。移取4 mL上清液置于含500 mg EMR-Lipid的离心管中,涡旋振荡1 min,再离心5 min (10 000 r/min,4 ℃),取1 mL上清液加入l mL水,混匀后待测。

1.4 色谱条件

Kinetex F5色谱柱(100 mm×3.0 mm,2.6 μm);柱温40 ℃;流速为0.5 mL/min;进样量为10 μL。正离子模式MS检测时,流动相为(A) 5 mmol/L甲酸铵水溶液(含0.1%(v/v)甲酸)和(B)甲醇-乙腈(1∶1,v/v),梯度洗脱。梯度洗脱程序:0～1.0 min,5%B; 1.0～8.0 min,5%B～45%B; 8.0～17.0 min,45%B～60%B; 17.0～20.0 min,60%B～95%B; 20.0～22.0 min,95%B; 22.0～22.1 min,95%B～5%B; 22.1～25.0 min,5%B。负离子模式MS检测时,流动相为(A)水和(B)甲醇-乙腈(1∶1,v/v),梯度洗脱。梯度洗脱程序:0～1.0 min,5%B; 1.0～8.0 min,5%B～45%B; 8.0～17.0 min,45%B～60%B; 17.0～20.0 min,60%B～95%B; 20.0～22.0 min,95%B; 22.0～22.1 min,95%B～5%B; 22.1～25.0 min,5%B。

1.5 质谱条件

离子源:电喷雾离子源,正/负离子模式。离子源温度550 ℃,喷雾电压(IS) 5 500 V,离子源气体1 (GS1)压力379.2 kPa(55 psi),离子源气体2 (GS2)压力379.2 kPa(55 psi),气帘气压力241.3 kPa (35 psi)。扫描模式:Zeno SWATH DIA。一级质谱参数:去簇电压(DP)50 V,质量数扫描范围20～1 200,累积时间0.1 s。二级质谱参数:质量数扫描范围20～1 200,根据m/z的实际分布,共拆分成12段可变窗口。使用SCIEX OS进行数据采集和处理。部分参数见表1。

表1 300种待测物的理化参数、质谱参数及色谱保留时间

1.6 数据库的建立及使用

将质量浓度为100 μg/L的单一分析物标准溶液注入UHPLC-QTOF-MS中,并进行数据采集,以低、中、高碰撞能量(20、35、50 eV)的DIA扫描模式,利用动态背景过滤(DBS)功能自动扣除背景离子,建立了包含精确质量数和片段离子的MS/MS谱库。筛查确认原则设置:精确质量数偏差绝对值≤5×10-6(5 ppm),保留时间误差≤0.2 min,差异同位素比≤10%,检索匹配分值≥90。

1.7 未知结构类似物的确证

取待测样品,按照1.3节方法处理,采用优化后的色谱条件进行分离,确定保留时间后,按照优化后的质谱条件进行一级质谱扫描,得到准分子离子峰,经拟合确定化合物的分子式;对母离子进行子离子扫描,得到二级碎片质谱图,进而推断化合物母核及丢失碎片等基本结构。

2 结果与讨论

2.1 色谱条件的优化

2.1.1色谱柱的选择

目标分析物种类广泛,理化性质各异,涉及多组精确质量数相似或同分异构体化合物。为了最大限度地兼顾所有组分的分离度和响应值,需要对色谱和质谱条件进行逐一优化,从而实现300种化合物的同步UHPLC-Q-TOF/MS分析。一般来说,保留和分离的机制可能包括疏水相互作用、离子交换、离子对、表面局部化等。对于某些含有不饱和结构或平面结构的化合物,另一个重要的选择性因素是π-π相互作用。本研究采用Kinetex五氟苯基柱实现了较好的分离效果。

2.1.2流动相的选择

在色谱条件的优化过程中,考虑到非法添加化学药物中有多组同分异构体,如吡唑N-去甲基西地那非、N-去乙基伐地那非和N-去甲基西地那非3种化合物的质荷比在正离子模式下均为461.196 6,即使高分辨质谱也无法区分,有必要通过色谱条件的优化实现有效分离。如图1a～e所示,当甲醇作为流动相的有机相、并在水相中添加2.5、5.0、10.0 mmol/L甲酸铵时,采用1.4节下梯度洗脱程序进行分析,这3种化合物的色谱保留均较强,色谱分离度相对较好,但色谱峰形较差,特别是N-去甲基西地那非,色谱峰出现不同程度的分叉;当有机相更换为乙腈时,3种化合物均得到了比较好的色谱峰形,但分离度和色谱保留效果不及甲醇,故最终采用甲醇-乙腈(1∶1,v/v)作为流动相的有机相,实现了色谱峰形、分离度和保留行为的同时兼顾。在优化的色谱条件下,上述3种同分异构体得到了良好的分离。

图1 两组同分异构体的分离色谱图

在此基础上,继续考察流动相pH值对化合物色谱行为的影响,以同分异构体硫代豪莫西地那非、硫代艾地那非和丙氧苯基硫代西地那非为例:3种化合物的质荷比在正离子模式下均为505.205 0,尝试添加不同体积分数的甲酸(包括添加0、0.01%、0.1%甲酸)改善同分异构体的分离。结果表明,随着甲酸体积分数的上升,3种化合物在更短的分析时间内获得了更好的分离效果,最终确定甲酸添加体积分数为0.1%,从而满足多组分高分辨质谱定量的需求,相关谱图见图1f～h。

研究表明,在上述流动相条件下,正、负离子扫描模式下各组分均获得有效分离,峰形良好,故确定为最终流动相。

2.2 前处理条件的选择

2.2.1提取溶剂的选择

首先从分配系数(oil-water partition coefficient,lgP)角度了解目标药物的溶解性,所有药物的lgP值为-8.564 5～6.881 9,其中98%的待测组分lgP<5,另外6种的lgP值为-5.128 1～6.881 9,均不属于强疏水性药物。同时,考虑到该值体现了液液萃取时的油水分配系数,而本研究需要从固体乳粉中直接将待测组分提取至混溶剂中,提取原理不尽相同,因此,本文选择对所有药物均具有良好溶解性的甲醇、乙腈以及乙腈高占比的水-乙腈 (2∶8,v/v)混合溶液作为提取溶剂进行实际考察,提取结果取决于是否能够有效脱脂、脱蛋白质,从而获得洁净即低离子干扰的提取物。分别以添加水平为10 μg/kg的牛源性和羊源性老年乳粉为基质(取试样2 g,置于50 mL具塞离心管中,分别加入20 μL 1 mg/L混合标准中间液和10 mL 40 ℃温水,涡旋1 min),比较了以下5种提取溶剂:乙腈、1%甲酸水溶液-乙腈(2∶8,v/v)、水-乙腈(2∶8,v/v)、0.1 mol/L Na2EDTA-Mcllvaine缓冲液-乙腈(2∶8,v/v)和甲醇。不同提取溶剂的效果见图2Ⅰ和2Ⅱ。

图2 样品预处理条件优化(n=3)

当使用甲醇提取时,大部分目标化合物的回收率低于60%,可能由于乳粉中氨基酸、糖等大分子极性杂质易溶于甲醇,蛋白质沉淀效果较弱。当使用乙腈提取时,整体提取效率明显提高,可见乙腈的宽极性包容性为极性各异的多类化合物提供了较好的溶解度,而对蛋白质、脂肪、糖等干扰物的提取率低,因此选择乙腈作为提取溶剂的有机相。继续考察水相与有机相混合提取的效果及不同改性剂对提取效率的影响。将水、0.1%甲酸水溶液和0.1 mol/L Na2EDTA-Mcllvaine缓冲溶液分别与乙腈以2∶8的体积比混合作为提取溶液[25]。结果表明,与纯水配比的混合溶剂提取效率优于纯乙腈,但在水相中加入0.1%甲酸后部分化合物回收率明显降低,可能由于多数化合物在酸性条件下以离子形式存在,降低了其在有机溶剂中的溶解度。反之,与纯水相比,0.1 mol/L Na2EDTA-Mcllvaine缓冲液的加入,有效改善了沙星类等药物的回收率,说明此类药物可能与样品中的金属离子存在螯合作用,而Na2EDTA的加入有助于将药物释放。基于以上结果,确定0.1 mol/L Na2EDTA-Mcllvaine缓冲液-乙腈(2∶8,v/v)为提取溶剂。此时,共146种分析物在两种样品基质中的回收率在80%～120%范围内。可见,采用溶剂直接稀释法提取时,部分分析物的回收率仍不理想,有必要从基质净化角度进一步提高回收率。

2.2.2盐剂的优化

为了使目标化合物更完全地提取在乙腈层,本文按照1.3节下的处理流程操作,考察了4组盐剂的盐析效果,分别为0.5 g NaCl+2 g Na2SO4、0.5 g NaAc+2 g Na2SO4、0.5 g NaCl+2 g MgSO4和0.5 g NaAc+2 g MgSO4。结果表明,0.5 g NaCl+2 g Na2SO4的盐析效果最佳,188种分析物在两种样品基质中的回收率为80%～120%,全部300种分析物相应的回收率为40.3%～160.8%。在萃取过程中加入MgSO4会释放大量的热量,影响化合物的提取效率,且MgSO4容易吸水结块,影响样品均质效果。NaAc和MgSO4的加入降低了麻黄碱、沙丁胺醇等β-激动剂的回收率。因此,选用0.5 g NaCl+2 g Na2SO4作为两种样品基质的盐剂。

2.2.3吸附剂的优化

样品在提取过程中经过蛋白质沉淀后,仍可能存在一些脂肪杂质,由于脂质会引发质谱分析中的基质效应而使方法性能下降且仪器寿命缩短。因此,有必要进一步对提取液进行净化处理。考虑到目标组分的性质多样性,本研究选择QuEChERS吸附法,按照1.3节下的处理流程操作,分别考察了300 mg十八烷基键合硅胶(C18,北京迪马科技有限公司)、N-丙基乙二胺(PSA,北京迪马科技有限公司)和EMR-Lipid dSPE吸附剂对药物提取回收率的影响(如图2Ⅲ和2Ⅳ所示)。吸附效果为EMR-Lipid>C18>PSA。C18虽然具有去除脂肪和脂类等非极性干扰物的潜力,但同时也因为非选择性吸附造成了阿司匹林、氟比洛芬和巴比妥类目标物的损失。PSA通过阴离子交换吸附糖类和极性较高的酸性物质,对脂类物质吸附能力较差,且会影响喹诺酮类、阿托品、布洛芬等酸性药物的提取率。而增强型脂质去除材料EMR-Lipid能够选择性去除基质中的脂质而将待测组分保留在提取液中。以300 mg EMR-Lipid为吸附剂时,300种物质中68.7%的药物加标回收率保持在80%～120%,平均加标回收率为47.0%～159.1%,因此,最终选择EMR-Lipid作为吸附剂。继续对用量进行了研究,分别考察了EMR-Lipid使用量为300、400、500和600 mg时的净化效果。如图2Ⅴ所示,牛源性样品吸附剂用量与萃取效率差异的方差分析表明,使用400和500 mg EMR-Lipid时,萃取效率较其他两种用量显著提升(P<0.05);如图2Ⅵ所示,羊源性样品中吸附剂EMR-Lipid的使用量增加至500 mg时,提取效率显著提升(P<0.05)。推测原因为牛乳粉的脂肪含量略高于羊乳粉,因此,需要使用更多吸附剂去除脂类杂质。而继续增加吸附剂用量至600 mg,在两种样品基质中的回收率整体水平均呈现下降,最终选择EMR-Lipid吸附剂的使用量为500 mg。图3为空白样品经优化的QuEChERS方法处理前后的色谱图。

图3 经优化的QuEChERS方法净化前后空白乳粉的色谱图

2.3 质谱条件的优化

2.3.1扫描方式的选择

基于Zeno SWATH®DIA的UHPLC-Q-TOF/MS技术,对常见老年乳粉中300种非法添加化学药物进行鉴定及定量分析。首先,在两种电离模式下,比较了所有药物前体/产物离子的灵敏度,确定了更加敏感的加合方式及相应的正/负离子电离模式。大多数化合物的前体离子为质子化[M+H]+或去质子化[M-H]-分子离子,但达格列净、卡格列净选择[M+NH4]+峰进行分析能够获得更好的重复性结果,另外阿司匹林选择源内裂解峰作为母离子进行高灵敏度定量分析。

2.3.2质谱参数的优化

本研究利用Zeno TOF 7600系统的Zeno trap阱富集功能与TOF加速器离子脉冲相匹配,解决了传统Q-TOF系统低质量端离子利用率低的问题,从而提高了定量分析时的灵敏度和重复性。以苯乙双胍为例(见图4),优化后的定量峰面积增加了10倍以上,Zeno trap能够显著提升定量灵敏度。

图4 Zeno功能开启对苯乙双胍响应增加效果的色谱图

2.3.3基于谱库的定性筛查和确认

为了考察所建立的筛查方法的可靠性,本实验采用已建立的一级精确质量数据库和二级谱图库对添加了300种化学药物的乳粉样品进行自动检索。目标化合物的综合得分为91.9～99.8,所得结果均大于定性筛查的最低限(90分),筛查参数及结果分别见表1和附表1(www.chrom-China.com)。结果表明,本实验建立的筛查方法准确可靠,能够在无标准品的情况下完成所有目标药物的筛查与确证。

2.4 方法学评价

2.4.1选择性

在适当的保留时间窗口(RTW)内检索目标物,每个目标物的RTW为3倍空白加标样品(加标水平为10 μg/kg)保留时间标准差[26,27]。结果表明,空白样品在所有组分相应的RTW内均无干扰峰,检索到的目标分析物质量数的精确偏差范围≤5 ppm。

2.4.2基质效应(ME)

基质效应是基于电喷雾电离的质谱方法中最具挑战性的问题之一,通常通过比较标准物质在空白基质提取液和纯溶剂中的响应来评估。根据公式(ME=ka/kb,ka和kb分别为目标分析物在样品基质和溶剂中标准曲线的斜率)计算。300种目标物中N-苯丙烯基他达拉非、N-辛基去甲他达拉非、伐地那非乙酰基类似物等那非类物质以及培氟沙星、氟罗沙星、达氟沙星、恩诺沙星等沙星类药物的基质效应均大于1.5,可见基质干扰对质量精度和目标分析物响应的影响不能完全忽略。消除基质效应常用的方法有两种:基质匹配标准溶液法和同位素内标法。由于分析物种类繁多,性质各异,同位素内标不能完全对应。因此,本研究采用了基质匹配校准的方法来提高量化精度。

2.4.3线性范围、检出限和定量限

通过目标分析物的标准曲线(6点)考察方法的线性范围。在2种基质的相应线性范围内,所有组分均呈良好的线性关系,相关系数均大于0.99。以添加回收样品峰响应值为3倍噪声的添加水平为方法检出限(LOD),以10倍噪声的添加水平为方法定量限(LOQ)。羊乳粉和牛乳粉中所有分析组分的LOD分别为0.1～2.7 μg/kg和0.1～2.6 μg/kg。以两种样品基质中相对较高的LOQ确定方法的LOQ,LOQ为0.2～8.0 μg/kg,均优于我国现有标准中的灵敏度,可满足快速筛查及确证的需要。乳粉中300种化学药物的检出限、定量限、线性范围、基质匹配标准曲线和相关系数见附表2。

2.4.4回收率与精密度

通过加标回收率评价该方法的准确性。在低、中、高3个水平(1倍、5倍、20倍LOQ)下测定了加标样品中分析物的回收率,平行操作6次。77%分析物的平均回收率为80%～120%,如附表3所示,所有目标组分在乳粉中的回收率为73.1%～125.2%,相对标准偏差(RSD)≤14.8%。结果表明,该方法具有良好的准确性和精密度。

2.5 方法应用

应用本方法对60批样品中非法添加化学药物进行了快速筛查。经与数据库匹配分析,共检出2种非法添加物质:在1份声称调节血糖的老年乳粉中检出苯乙双胍,含量为1.4 mg/g。苯乙双胍曾被广泛用于临床Ⅱ型糖尿病的治疗(每日推荐剂量为25 mg)。但因该药会导致致死性乳酸酸中毒,且病死率极高,于2016年被我国禁止使用。而按照该乳粉推荐的每天食用量37.6 g计算,每日摄入量为41.4 mg,超过临床使用剂量的1.5倍;在1份添加人参等中药提取物的声称增强免疫力的样品中检出磷酸二酯酶选择性抑制剂西地那非,含量为3.9 mg/g。

3 结论

本研究建立了一种基于QuEChERS提取结合SWATH模式的UHPLC-QTOF-MS分析方法,用于老年乳粉中300种非法添加化学药物的快速测定。该方法通过优化的QuEChERS提取净化方法,实现了从复杂样品基质中同时提取具有不同理化性质及疗效的多类别药物。优化后的方法在两种验证基质中的选择性、线性关系、灵敏度、基质效应、准确度和精密度结果令人满意,所有组分的分离检测在25 min内完成。在此基础上,采用EAD技术建立了一种未知物的非靶向筛查及鉴定策略。方法应用于不同地区市售真实样品的分析,在60份样品中检出苯乙双胍和西地那非2种非法添加药物,并鉴定出一种已撤出市场的减肥药品乙非他明,阳性样品检出率为5%。研究结果表明,新兴功能性乳粉可能对老年人存在潜在的健康风险,有必要进一步加大专项整治力度,扩大样品采集规模,全面开展涉老产品隐患排查。本研究建立的方法适用于多类别功能声称乳粉中300种化合物的高通量分析,同时为相关结构类似物的识别确证提供了一种有效的技术手段。