槲皮素诱导肝星状细胞凋亡：基于调控miR-146 影响PI3K/Akt信号通路

高晓阳，赵晓璐，张春艳，颜羽昕，金 蓉，马月宏

内蒙古医科大学基础医学院，内蒙古自治区 呼和浩特010000

肝纤维化（HF）导致纤维细胞外基质（ECM）成分在肝脏中过度地和/或可逆地积累，是造成肝组织反复损伤的主要决定因素［1］。其中，肝星状细胞（HSCs）的活化是分泌ECM的主要细胞来源，是HF发生发展的“核心事件”［2,3］。当肝脏受伤时，静止的HSCs被激活，转分化为肌成纤维细胞，分泌大量ECM成分，导致异常的伤口愈合反应［4］。在此过程中，还发现了一系列可能在纤维疤痕形成/调节中发挥关键作用的机制。譬如：微小RNA（miRNA）通过转录后改变基因表达来调控多种疾病的发展［5］；细胞间的相互作用常常是在细胞信号传导的过程中进行，它们或者识别与之相接触的细胞，或者识别周围环境中的相关信号，改变靶基因的转录活性，诱发细胞作出特定的应答反应［6］等。研究发现，miR-146/Smad4是抑制肝细胞上皮-间质转化（EMT）的关键信号级联，miR-146的引入可能为HF提供一种有前途的治疗选择［7］。在HSCs激活的早期阶段，磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶B（Akt）信号通路受到某些生长因子（TGF-β、CTGF、PDGF等）的刺激，参与多种生理过程，如细胞增殖、分化、自噬和凋亡，但据报道其激活与纤维发生也有关［8,9］。

槲皮素（Que）是一种广泛存在于自然界植物中的黄酮醇类化合物，具有抗菌抗炎、抗氧化、抗癌、抗纤维化及抑制血管活性生成等多种生物活性［10］。研究发现，Que可以降低胆管结扎（BDL）或四氯化碳（CCl4）造成的HF，减少ECM形成，抑制转化生长因子-β（TGF-β）/Smads和磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶B（Akt）信号通路，从而减轻肝脏损伤［11］。然而，Que是否能通过调控miR-146参与HF以及其可能的分子机制尚未见报道。因此，本研究选择了miR-146和PI3K/Akt信号通路，从细胞研究的层面探讨了Que在HF防治中的作用和机制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 实验细胞系 大鼠肝星状细胞系（HSC-T6）购自北京北纳科技有限公司。

1.1.2 药品和主要试剂 槲皮素（产品规格：分析标准品，HPLC≥98%）购自上海源叶生物科技有限公司；miRNA模拟剂（mimic）/抑制剂（inhibitor）、riboFECTTMCP Transfection Kit（广州锐博生物技术有限公司）；CCK-8细胞增殖-毒性检测试剂盒、Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒（碧云天生物技术有限公司）；FastKing cDNA第一链合成试剂盒、SuperReal荧光定量预混试剂（北京天根生化科技有限公司）；RabbitAntiα-SMA、Rabbit Anti-Collagen I、Rabbit Anti-PI3K、RabbitAnti-Akt、RabbitAnti-p-Akt、RabbitAnti-TRAF6（北京博奥森生物技术有限公司）；Triton X-100、牛血清白蛋白（BSA-Ⅴ）购自中科瑞泰生物科技有限公司；DAPI染色液（南京森贝伽生物科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 HSC-T6细胞采用含有10%胎牛血清的DMEM高糖培养液常规培养。待细胞贴壁并长至培养皿的30%～50%时，除对照组以外，各组均加入0.2 mg/mL TGF-β孵育24 h［12］，弃上清，用40、60、80 μmol/L Que预处理24 h，用于后续分子实验。

1.2.2 细胞转染 细胞转染采用riboFECTTMCP 试剂。取对数生长期的5×105～1×106/孔细胞接种至24孔板中，培养液体积0.5 mL，其中miRNA mimic终浓度每孔为50 nmol/L，miRNA inhibitor终浓度每孔为100 nmol/L，共孵育48 h后进行后续试验。为保证实验可靠性和重复性，每组转染样品设6个重复。

1.2.3 CCK-8法检测Que对HSCs的影响 Que浓度设置为调零组（不含细胞的完全培养液）、对照组（不加Que干预）、10、20、40、60、80、100 μmol/L共8组，每组设5个复孔。取稀释为5×103/mL的HSC-T6细胞悬液，以200 μL/孔接种于96孔板，待贴壁后分别按上述浓度加入Que，37 ℃、5%CO2培养箱中培养24、48、72 h，适时加入10 μL CCK-8溶液，2 h后于酶标仪处检测各孔A450nm。细胞抑制率（%）=[（对照组A450nm-处理组A450nm）/（对照组A450nm-调零组A450nm）]×100%。

1.2.4 流式细胞术检测细胞凋亡 调整细胞密度为5×104～1×105/孔(6孔板)，收集细胞悬液至离心管内，1000 r/min离心5 min，弃上清，加入195 μLAnnexin V-FITC结合液完成细胞重悬，再加入5 μL Annexin V-FITC和10 μL碘化丙啶（PI）染色液混匀，移至流式管内，室温避光孵育20 min，上流式细胞仪检测。

1.2.5 RT-qPCR检测细胞中mRNA、miRNA表达水平总RNA用Trizol法提取，miRNA用索莱宝公司柱提法按提取试剂盒说明书提取。得到样品后选取相应的反转录试剂获得cDNA，并加入相应的引物和荧光染料进行RT-qPCR技术检测。miR-146、U6、α-SMA、CollagenI、TRAF6、PI3K、Akt、GAPDH 引物均由上海生工设计。以上所有体系分析均设3个重复，结果采用2-ΔΔCt方法进行数据处理。

1.2.6 Western blot检测细胞中相关蛋白表达水平 提取各组细胞的蛋白，以10～20 μL 上样量进行SDSPAGE凝胶电泳，待目的蛋白分离后转膜，封闭1 h，用含5%脱脂奶粉的TBS溶液稀释一抗：GAPDH（1∶20 000）、α-SMA（1∶2000）、CollagenⅠ（1∶1000）、TRAF6（1∶1000）、PI3K（1∶1000）、Akt（1∶1000）、p-Akt（1∶500），4 ℃过夜。次日1×TBST 溶液充分洗涤后放入对应的荧光二抗（1∶1000），室温摇床1 h。近红外激光成像系统扫膜并进行灰度值分析。以上实验步骤独立进行3次。

1.2.7 免疫荧光实验检测细胞中α-SMA、Collagen I蛋白表达水平 将无菌玻片放入12 孔板中，1×多聚赖氨酸孵育4 h 后常规处理细胞。随后用4%多聚甲醛固定30 min，0.5%Triton X-100透化20 min，1%BSA封闭1 h，一抗湿盒4 ℃过夜。次日滴加稀释好的荧光二抗，37 ℃避光培养1 h，倒置荧光显微镜下观察采集图片。

1.3 统计学分析

使用SPSS 22.0软件对数据进行统计分析。数据以均数±标准差表示，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD-t检验。P<0.05时认为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 Que对HSC-T6细胞活力的影响

不同浓度的Que孵育HSC-T6细胞24、48、72 h后结果显示，相同时间不同浓度内，与对照组相比，除10 μmol/L和20 μmol/L给药浓度外，余随着药物浓度的递增，细胞A450nm值均显著降低（P<0.05）。相同浓度不同时间比较，发现药物浓度在40、60、80 μmol/L 时细胞A450nm值间的差异变化最为显著，所以选取40、60、80 μmol/L 3个浓度进行后续细胞实验（图1）。

图1 不同浓度Que对HSC-T6细胞抑制率的影响Fig.1 Inhibition rates of HSC-T6 cells treated with different concentrations of quercetin(Mean±SD,n=3).*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001,****P<0.0001.

2.2 Que对HSC-T6细胞凋亡的影响

结果显示，与Control组相比，TGF-β组的总细胞凋亡率差异无统计学意义（P>0.05），与TGF-β组相比，Que各给药组总细胞凋亡率均显著升高（P<0.001），其中Que低剂量组和Que高剂量组以早期凋亡率升高为主（图2A～E）。

图2 Que对HSC-T6细胞凋亡的影响Fig.2 Effect of quercetin on apoptosis of HSC-T6 cells(Mean±SD,n=3).A:Control group;B:TGF-β group;C:TGF-β+Que-L group;D:TGF-β+Que-M group;E:TGF-β+Que-H group;F:Apoatosis rate.***P<0.001 vs TGF-β group.

2.3 Que通过PI3K/Akt信号通路抑制HSCs增殖的作用机制

2.3.1 RT-qPCR结果 与Control组相比，TGF-β组中α-SMA、CollagenⅠ、TRAF6、PI3K、Akt的mRNA表达水平显著升高（P<0.001）；与TGF-β组相比，Que各治疗组的α-SMA、CollagenⅠ、TRAF6、PI3K、Akt的mRNA表达水平显著下调（P<0.01，图3A～E）。

图3 不同剂量Que对细胞中α-SMA、CollagenⅠ、TRAF6、PI3K和Akt mRNA表达的影响Fig.3 Effects of different doses of quercetin on the expression of α-SMA(A),CollagenⅠ(B),TRAF6 (C),PI3K (D) and Akt (E)mRNAin the cells(Mean±SD,n=3).###P<0.001 vs Control group;**P<0.01,***P<0.001 vs TGF-β group.

2.3.2 Western blot结果 与Control组相比，TGF-β组中α-SMA、TRAF6、PI3K、Akt、p-Akt蛋白表达水平显著升高（P<0.01），而CollagenⅠ蛋白表达水平无明显升高（P>0.05）；与TGF-β组相比，除CollagenⅠ和PI3K低剂量组以外，余Que各治疗组的α-SMA、CollagenⅠ、TRAF6、PI3K、Akt、p-Akt 蛋白表达水平显著下调（P<0.05，图4A～G）。

2.3.3 免疫荧光实验结果 与Control 组相比，加入TGF-β的模型组中α-SMA、CollagenⅠ蛋白的荧光强度显著增强，表明TGF-β能促进HSC-T6 细胞活化；与TGF-β组相比，加入Que的实验组中α-SMA、CollagenⅠ蛋白的荧光强度显著减弱，表明Que可以抑制TGF-β对HSC-T6 细胞的活化作用，这与RT-qPCR 和Western blot结果一致（图5A、B）。

2.4 Que对HSCs中miR-146表达水平的影响

测定HSC-T6细胞中miR-146的变化情况，结果显示，与Control组相比，TGF-β组中有miR-146 mRNA表达下降（P<0.05），与TGF-β组相比，给予不同剂量Que后各组中miR-146 mRNA表达显著上调（P<0.05，图6）。

图6 各组细胞中miR-146表达水平Fig.6 Expression levels of miR-146 in quercetintreated cells(Mean±SD,n=6).#P<0.05 vs Control group;*P<0.05,***P<0.001 vs TGF-β group.

2.5 miR-146通过靶向TRAF6对HSCs的调控作用

2.5.1 HSC-T6细胞转染后α-SMA、CollagenⅠ、TRAF6、PI3K、Akt的mRNA表达水平 与各自的NC组相比，细胞转染mimic后α-SMA、CollagenⅠ、TRAF6、PI3K、Akt的mRNA表达水平显著降低（P<0.01），而转染inhibitor后α-SMA、CollagenⅠ、TRAF6、PI3K、Akt的mRNA表达水平显著升高（P<0.01，图7A～E）。

图7 HSCs转染后对α-SMA、CollagenⅠ、TRAF6、PI3K和Akt mRNA表达的影响Fig.7 Expressions of α-SMA(A),collagenⅠ(B),TRAF6(C),PI3K(D)and Akt(E)mRNAs in HSCs transfected with miR146 mimic and inhibitor(Mean±SD,n=6).**P<0.01,***P<0.001 vs Individual NC groups.

2.5.2 HSC-T6细胞转染后α-SMA、CollagenⅠ、TRAF6、PI3K、Akt和p-Akt蛋白表达水平 与miR-146 mimics NC 组相比，转染mimics 后α-SMA、Collagen Ⅰ、TRAF6、PI3K、Akt、p-Akt蛋白表达水平显著降低（P<0.05），与miR-146 inhibitor NC组相比，转染inhibitor后α-SMA、CollagenⅠ、TRAF6、PI3K、Akt、p-Akt 蛋白表达水平显著升高（P<0.05，图8A～G）。

3 讨论

肝脏纤维化和慢性炎症反应主要与慢性肝病的进展有关［13］。慢性肝损伤会导致肝纤维生成的持续性激活，这是一个关键的生物动态过程，涉及许多分子机制、传导通路以及不同细胞群的相互反应，最终使HF发生发展［14］。在健康肝脏中，ECM多由IV型和VI型胶原蛋白形成，当肝脏受损时，ECM主要分泌I型和III型纤维胶原蛋白，同时增加层粘连蛋白、透明质酸、弹性蛋白和蛋白聚糖等非胶原蛋白的沉积［4,15］。因此，抑制HSCs的活化、减少胶原蛋白沉积是改善HF的主要措施。目前研究面临的主要挑战是如何为慢性肝病患者的抗HF治疗提供新方向。Que能显著减慢肝癌异种移植的生长，抑制依赖有氧糖酵解的肝细胞癌的进展，特别是对于那些己糖激酶2表达率高的患者［16］。Wan 等［17］研究了脂质体Que对刀豆球蛋白A诱导的HF的影响，表明Que可以有效抑制刀豆球蛋白A引起的HF，且抑制作用与其调节NF-κB的能力有关。尽管以上描述了Que在肝脏疾病中的一些应用成果，但其对HF治疗的相关机制仍有待进一步完善。

TGF-β是一组新近发现的调节细胞生长和分化的TGF-β超家族，存在于正常肝组织中，但其高表达时却发生在进行性肝病的所有阶段，包括纤维化［18］。TGF-β和ECM成分之间存在很强的串扰关系。一般情况下，一部分TGF-β以TGF-β结合蛋白（LTBP）或复合物的形式存储在ECM中，当TGF-β被激活，它会调节ECM重塑，促进成纤维细胞向肌成纤维细胞过渡，并作用于纤维化中的其他细胞（上皮细胞、内皮细胞或巨噬细胞等），这在纤维化过程中至关重要［19］。鉴于此，本实验选择TGF-β为细胞激活诱导剂，并进一步证实TGF-β有助于HSCs的激活和ECM的过度积累，后通过RT-qPCR、Western blot和免疫荧光定量检测α-SMA、CollagenⅠ的mRNA和蛋白水平显示，与对照组相比，模型组呈高表达，与模型组相比，Que药物干预后α-SMA、CollagenⅠ表达降低，从而证明Que对TGF-β激活的HSCs途径有效，能抑制细胞增殖并促进其凋亡，降低纤维化标志物α-SMA、Collagen I表达水平，起到抗HF的作用。

PI3K/Akt通路是一条较常见的信号通路，它在HF过程中发挥着重要作用，不仅调控HSCs的活化、增殖及凋亡等，而且与ECM的合成与降解有关［20,21］。研究发现TGF-β可促进PI3K/Akt通路活化，增强瘢痕成纤维细胞中α-SMA的表达；当阻断PI3K/Akt通路的传导时，能促进HSCs的凋亡，减少I型胶原的生成［22］。PDGF呈时间依赖性的激活HSCs 中的PI3K，且磷酸化Akt，通过PI3K/Akt通路促进HSCs增殖和I型胶原合成，用PI3K抑制剂LY294002作用于HSCs，可阻断PDGF对PI3K的诱导活化，减少HSCs增殖，达到抗纤维化的效果［23］。以上研究机制均说明抑制PI3K/Akt通路活化能延缓或逆转纤维化的进展。本研究中进一步证明PI3K/Akt信号通路的激活与HF有关，下调PI3K、Akt和p-Akt等基因可抑制胶原表达，阻断HSCs/HmFs的增殖、分化，延缓纤维化的进展。

miRNA的失调能启动PI3K/Akt信号通路的激活，miRNA介导的基因调控与PI3K/Akt通路相互连接，形成Akt-miRNA调控网络［24］。一般来说，miRNA在少数情况下可以通过直接靶向Akt来调控PI3K/Akt信号传导，但大多数miRNA靶向此途径中的负调控因子，例如肿瘤因子受体相关因子6（TRAF6）就是miR-146的下游靶标之一，它能通过Lys63介导的泛素化促进PI3K/Akt信号通路活化［25,26］。与此同时，荧光素酶报告证明miR-146 直接靶向TRAF6，下调TRAF6 后可以减少miR-146对肝细胞癌细胞系增殖和入侵的影响［27］。本研究中模型组的miR-146表达明显，给予不同剂量药物，各组中miR-146表达显著降低，TRAF6与miR-146间呈显著负向调控关系。故又设计了miR-146细胞转染实验，得出转染miR-146 inhibitor 会上调PI3K/Akt信号通路；而转染miR-146 mimic时PI3K/Akt信号通路受到抑制或失活。

综上所述，活化的HSCs减少有助于大多数患者的纤维化的消退和肝脏的修复，本实验通过细胞模型实验进一步证实了Que的抗HF 作用，其作用机制是通过上调miR-146，进而调控PI3K/Akt信号通路来实现的，这为Que在HF中的应用提供了新参考资料。