脑心肌炎病毒（EMCV）感染昆明小鼠模型的建立①

郑剑纲 郝至立 曹志刚 孙盼盼④ 孙 娜 李宏全

（山西农业大学动物医学学院，太谷 030801）

脑 心 肌 炎 病 毒（encephalomyocarditis virus，EMCV）属于小核糖核酸病毒科，心病毒属，病毒粒子外表呈光滑球形，无囊膜，为单股正链RNA 病毒［1-3］。EMCV 于1945 年在佛罗里达州迈阿密由HELWIG 和SCHMIDT 首次从一只突然死于肺水肿和心肌炎的雄性长臂猿中分离得到，将浮肿液注射小鼠体内后，出现后肢麻痹和心肌炎等症状，随后这种病原体被命名为EMCV［4］。1949 年后，EMCV感染发生于猕猴、狒狒、狗、老虎、猕猴、蝙蝠、猪和人等不同物种，且分布于世界各地［5-11］。EMCV 感染大多数物种后症状轻微，但可引起母猪繁殖障碍、仔猪急性心肌炎，诱发仔猪猝死等［12-16］。目前针对EMCV感染还没有特效药和商品化疫苗。

小鼠模型具有成本低、繁殖饲养快速方便、遗传背景明确等有利因素，使其成为药物临床前评价研究等最为重要的模式动物。EMCV 小鼠模型的建立既往研究鲜见报道，主要集中于EMCV 感染小鼠后临床症状和组织病理损伤的观察［17-21］。本研究拟建立EMCV 感染昆明小鼠模型，为后续EMCV 致病机制和药物开发奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物和病毒 6～8 周龄SPF 级昆明小鼠192 只雌雄各半（质量合格证号：110011210115 155452），购自北京维通利华实验动物科技有限公司［SCXK（京）2021-0006］。自由采食和饮水，所有动物实验符合山西农业大学动物委员会伦理要求（伦理审查号：SXAU-EAW-2021M01027）。EMCV NJ08 株由南京农业大学姜平教授惠赠，本实验室进行了扩增和保存。根据Reed-Muench法计算其毒力为108.5TCID50/ml［22］。

1.1.2 主要试剂 TRIzol（invitrogen，美国）；2×SYBR Green qPCR Master Mix（Low ROX，Biotool，美国）；反转录试剂盒（TaKaRa，中国）；苏木素染色液、伊红染色液和中性树胶（Solarbio，中国）。

1.1.3 主要仪器 烘片机、全自动轮转切片机、荧光正置显微镜（型号：HI1220、型号：RM2255、型号：DM3000，德国Leica）；生物组织包埋机（型号：KDBM，中国科迪）；高速冷冻离心机、核酸蛋白浓度测定仪（型号：5418、型号：D30，德国Eppendorf）；PCR仪（型号：TC-96，美国Bio-Rad）；涡旋振荡仪（型号：GENIUS3，德国IKA）；荧光定量PCR 仪（型号：7500，美国Applied Biosystems）。

1.2 方法

1.2.1 实验分组及给药 小鼠适应性饲养1周后，分为正常组和EMCV 高、中、低剂量感染组。EMCV高 剂 量 组 小 鼠 腹 腔 注 射0.2 ml 100 TCID50/20 g EMCV，中剂量组小鼠腹腔注射0.2 ml 10 TCID50/20 g EMCV，低剂量组小鼠腹腔注射0.2 ml 1 TCID50/20 g EMCV，空白组腹腔注射等体积的生理盐水。每天观察小鼠临床症状。于EMCV 感染5 d、7 d、9 d、11 d、13 d、15 d，每组随机选取8只，经摘取眼球采血，脱颈处死小鼠，收集不同脏器进行后续检测。

1.2.2 检测各组小鼠心脏、脑、脾脏和肝脏指数摘取心脏、脑、脾脏和肝脏后，用滤纸吸干残留血后，并依据下列公式计算脏器指数。脏器指数=脏器质量(mg)/小鼠质量(g)×10。

1.2.3 qRT-PCR 检测病毒载量和炎症因子 用TRIzol 法提取小鼠血液、心脏、脑、脾脏和肝的总RNA，用核酸蛋白浓度测定仪检测RNA 的浓度和纯度，按照TaKaRa 反转录试剂盒说明书将总RNA 反转录成cDNA。qRT-PCR 检测不同剂量EMCV 感染5 d、7 d、9 d、11 d、13 d、15 d 时血液、心脏、脑、脾脏和肝的病毒载量。使用本实验室保存的1.59×108Copies/µl EMCV 3D 重组质粒为模板，10 倍比稀释，加入3D基因正反向引物进行扩增。标准曲线由各稀释度模板的起始拷贝数及其对应的Ct值构成。依据标准曲线，检测每ml 样品中EMCV 3D 拷贝数。EMCV 3D基因引物序列为F：5'-TTAGGGCGGGTTTGTAT-3'，R：5'-TTTGTTAGCGGGAGTTA-3'。相 对qRT-PCR 检测9 d 时心和脑IL-1β、IL-6 和TNF-α 的相对表达量。IL-1β F：5'-GCCACCTTTTGACAGTGATGAGA-3'，R：5'-GACAGCCCAGGTCAAAGGTT-3'；IL-6 F：5'-GTCCTTCCTACCCCAATTTCCA-3'，R：5'-TAACGCACTAGGTTTGCCGA-3'；TNF-α F：5'-GATCGGTCCCCTTTGGGATG-3'，R：5'-GGTTTGCTACGCAGTGGGC-3'；β-Actin F：5'-CTGAGCTGCGTTTTACACCC-3'，R：5'-CGCCTTCACCGTTCCAGTTT-3'。

1.2.4 组织病理切片 取小鼠心尖和左脑，于10%甲醛溶液中固定24 h。经梯度乙醇脱水、二甲苯透明、石蜡包埋、切片、烘片、脱蜡、苏木素-伊红染色和中性树胶封片后，镜检观察心脏和脑组织病理变化。

2 结果

2.1 临床症状观察 与空白组相比，昆明小鼠经腹腔接种0.2 ml 100 TCID50/20 g EMCV 后第3 d 开始出现精神沉郁、被毛粗乱等症状；感染5～11 d 不断有小鼠出现震颤、弓背及后肢瘫痪等症状，后肢瘫痪症状出现24～48 h 后小鼠出现死亡，至实验结束，高剂量组共出现死亡小鼠7 只。其他未出现症状的小鼠感染15 d 与空白组相比均未出现异常，但在组织中能检测到EMCV病毒的复制。中剂量和低剂量组小鼠直到第15天未出现异常症状。

2.2 不同剂量EMCV 在不同时间点对小鼠脏器指数的影响 由图1 可知，与空白组相比，高剂量EMCV 感染小鼠5 d 时，能显著提高心脏指数（P＜0.05），极显著提高脾脏指数（P＜0.01），对于脑和肝脏指数并无显著影响。在7 d、9 d、11 d、13 d 和15 d时，不同剂量的EMCV 感染对于小鼠的脏器指数无显著影响（P＞0.05），表明在EMCV 感染小鼠前期造成心脏和脾脏肿大。

2.3 不同剂量EMCV 感染小鼠在不同时间点的病毒载量 利用qRT-PCR 检测不同剂量EMCV 感染的昆明小鼠5 d、7 d、9 d、11 d、13 d 和15 d 时，心脏、脑、肝脏、脾脏和外周血中EMCV 载量，结果见图2。高剂量EMCV 感染昆明小鼠，随着时间增加，在心脏、脑、肝脏、脾脏和外周血中EMCV载量逐渐增加，在9 d 时达到顶峰，然后随着时间增加病毒载量逐渐下降，其中脑组织的病毒载量最高。与高剂量组相比，中剂量和低剂量EMCV 感染小鼠不同时间点后，心脏、脑、肝脏、脾脏和外周血中EMCV 载量很低，且部分低剂量EMCV感染小鼠未能检测到EMCV的复制情况。

图2 qRT-PCR 检测不同剂量EMCV 感染5 d、7 d、9 d、11 d、13 d 和15 d 时心脏、脑、肝脏、脾脏和外周血中EMCV载量Fig.2 qRT-PCR was used to detect EMCV loads in different organs and peripheral blood infected with different doses of EMCV on 5 d， 7 d， 9 d， 11 d， 13 d and 15 d

2.4 不同剂量EMCV 感染小鼠9 d 时炎症因子mRNA表达 利用qRT-PCR检测不同剂量EMCV感染昆明小鼠9 d 时，心脏和脑中炎症因子IL-1β、IL-6和TNF-α mRNA 表达情况，结果见图3。与空白组相比，高剂量EMCV 感染9 d 时，能极显著提高心脏中IL-1β（P＜0.01）、IL-6（P＜0.001）和TNF-α（P＜0.01） mRNA 表达，中剂量EMCV 感染9 d 时则显著提升心脏中IL-1β mRNA 表达（P＜0.05）。与空白对照组相比，高剂量EMCV感染9 d时能极显著提高脑组织中IL-1β 和TNF-α mRNA 表达（P＜0.001），显著增加IL-6 mRNA 表达（P＜0.05）。中剂量EMCV 感染9 d 时能极显著提高脑组织中TNF-α mRNA 的表达 （P＜0.01）。与空白组相比，低剂量EMCV 感染对心脏和脑组织中IL-1β、IL-6 和TNF-α mRNA 表达无显著影响（P＞0.05）。

图3 qRT-PCR 检测不同剂量EMCV 感染9 d 时心脏和脑IL-1β、IL-6和TNF-α mRNA的相对表达量Fig.3 qRT-PCR detected relative expressions of IL-1β，IL-6 and TNF-α mRNA in heart and brain infected with different doses of EMCV for 9 d

2.5 小鼠心脏组织病理损伤情况 不同剂量EMCV 感染昆明小鼠5 d、7 d、9 d、11 d、13 d 和15 d时，对心脏组织进行HE 染色。由图4 可知，空白组心肌细胞纤维清晰可见，心肌纤维平行排列，且整齐均匀。胞浆染色均匀，细胞核呈椭圆形，位于细胞中部。与空白组相比，高剂量EMCV感染5 d时心脏组织炎症细胞增多；7 d时心脏组织有大面积炎症细胞浸润；9 d 时心肌细胞出现空泡状病变；11 d 时炎症细胞浸润减少，空泡状病变消失，心肌间隙增宽，后期回归正常。中剂量EMCV 仅在感染前期导致少量炎症细胞浸润和心肌间隙增宽。低剂量EMCV感染与空白组形态基本一致。

图4 不同剂量EMCV感染5 d、7 d、9 d、11 d、13 d和15 d时心脏组织病理学切片（HE染色，×200）Fig.4 Histopathological sections of heart tissue infected with different doses of EMCV on 5 d，7 d，9 d，11 d，13 d and 15 d （HE staining， ×200）

2.6 小鼠脑组织病理损伤情况 空白组大脑脑膜正常，皮质结构清晰，白质无炎症细胞浸润。与空白组相比，高剂量EMCV 感染5 d 时，脑膜下血管扩张，7 d 和9 d 时脑膜增厚，膜下出血，后期脑膜恢复正常，膜下出血逐渐吸收；中剂量EMCV感染7 d时，脑膜增厚和脑水肿，9 d 时白质有出血点，中剂量感染其他时间点和低剂量感染与空白组形态基本一致（图5）。与空白组相比，高剂量EMCV 感染5 d时，脑白质出现炎症细胞浸润，7 d 和9 d 时，白质内血管高度扩张，炎症细胞浸润，形成血管套，后期逐渐恢复正常；中剂量EMCV感染前期，出现轻微的炎症细胞浸润和血管扩张，后期逐渐恢复正常。低剂量感染与空白组形态基本一致（图6）。

图5 不同剂量EMCV感染5 d、7 d、9 d、11 d、13 d和15 d时脑皮质和脑膜组织病理学切片（HE染色，×200）Fig.5 Histopathological sections of cerebral cortex and meninges infected with different doses of EMCV on 5 d， 7 d， 9 d， 11 d， 13 d and 15 d （HE staining， ×200）

图6 不同剂量EMCV感染5 d、7 d、9 d、11 d、13 d和15 d时脑白质组织病理学切片（HE染色，×200）Fig.6 Histopathological sections of cerebral white matter infected with different doses of EMCV on 5 d， 7 d，9 d， 11 d， 13 d and 15 d （HE staining， ×200）

3 讨论

目前，大量研究集中于EMCV 感染小鼠临床症状的观察，而系统建立EMCV 感染昆明小鼠模型鲜见报道，这在一定程度上限制了抗EMCV 临床药物的开发。本实验室前期研究发现莪术醇体外能够显著抑制EMCV 的复制，为了验证其体内抗病毒活性，首先需建立EMCV感染昆明小鼠模型［23］。EMCV感染昆明小鼠模型的建立为抗EMCV药物的开发奠定了基础。

首先采用100 TCID50/20 g的EMCV感染小鼠5 d时，能够显著提高心脏和脾脏指数。施开创等［19］使用103.67TCID50的EMCV GXLC 株腹腔注射小鼠，结果发现心脏重量与体质量的比值在3～14 d 都会保持明显升高。本实验仅在感染5 d 时显著升高，这可能取决于选取相对较低的剂量和不同的毒株。EMCV 感染首先在位于扁桃体的巨噬细胞复制，然后随着游走的巨噬细胞遍布全身［24］。脾脏红髓中存在大量平滑肌细胞和纤维，外周围绕脾索巨噬细胞，EMCV 在巨噬细胞中复制后，造成该类细胞脱离消失，而平滑肌细胞直接与血液中的凝血因子接触，使血小板激活聚集，激发凝血系统，使红细胞在脾脏中聚集，充血肿大。

本实验中，采用100 TCID50/20 g EMCV 感染昆明小鼠，随着时间增加，心脏、脑和脾脏中的EMCV载量逐渐增加，在9 d 时达到顶峰，然后随着时间增加病毒载量逐渐下降。殷雪婷［21］研究发现EMCV HLJ感染小鼠后，在组织器官中广泛分布，各器官都能检测到病毒的存在，其中心和脑病毒载量最高。本实验结果表明，100 TCID50/20 g的EMCV感染可以导致病毒在小鼠体内大量复制。

心脏和脑是EMCV 感染的靶器官，可以导致心肌炎和脑炎，最终导致心力衰竭和瘫痪。炎症因子被认为在心脏衰竭的发病过程中具有非常重要的作用，IL-1β 降低心脏收缩力，IL-6 导致负性肌力，TNF-α引起心肌收缩障碍、心肌炎、心室扩张和心脏发育不全［25-27］。研究表明，致心肌炎型EMCV-M 感染小鼠后，心肌中IL-1β、TNF-α 表达与心肌病变程度 呈 正 相 关［19］。施 开 创 等［19］研 究 还 表 明EMCV GXLC 感染小鼠后，脑组织中IL-1β、IL-6 和TNF-α mRNA 表达显著上升。本研究结果显示，与空白对照组相比，100 TCID50/20 g EMCV感染9 d时，能极显著提升心脏和脑组织中IL-1β、IL-6 和TNF-α mRNA表达，表明100 TCID50/20 g EMCV 感染小鼠造成了靶器官心和脑的炎症反应。

EMCV 感染小鼠诱发的心肌炎特点为心肌坏死和炎症细胞浸润，并且导致心力衰竭和扩张型心肌病［28］。研究发现EMCV复制主要位于大脑海马体和小脑颗粒层的小区域坏死性病灶内［29］。从胸椎到腰椎脊髓，控制骨骼肌活动和张力的运动神经元也会受到影响，从而导致瘫痪［30］。病理学组织切片结果显示，100 TCID50/20 g EMCV感染能够引起小鼠心脏组织大面积炎症细胞浸润和空泡化病变。也引起脑组织脑膜下血管扩张、脑膜增厚、膜下出血、脑白质炎症细胞浸润和形成血管套的病理变化。结果表明100 TCID50/20 g EMCV 感染小鼠造成了靶器官心和脑的病理损伤。

综 上 所 述，腹 腔 注 射0.2 ml 100 TCID50/20 g EMCV 可引起小鼠发病，成功建立了EMCV 感染昆明小鼠模型。本实验通过测定不同时间点EMCV感染小鼠的不同脏器中病毒RNA，并观察了心和脑组织病理学改变，了解EMCV进入小鼠引起的变化。