马尾藻多糖拮抗LPS诱导的巨噬细胞极化及铁死亡①

袁慧情 胡佳敏 刘思溢 侯鉴基 吴科锋 罗 辉 吴斌华 （广东医科大学，湛江 524023）

马尾藻（Sargassum）是褐藻的一种，广泛分布于 我国东海、南海，因其富含多种营养成分且具有一定的有益功效，广泛用于食品和医药研究等［1］。马尾藻多糖（sargassum polysaccharide，SP）是其主要成分，具有丰富的生物活性，包括抗氧化、抗癌、抗糖尿病、抗氧化等［2-5］。

目前SP 调控巨噬细胞抗炎作用的研究多集中于分析其影响的具体信号通路中，包括核因子-κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）、丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）、Janus 激酶/信号转导与转录激活子（Janus kinase/signal transducer and activator of transcription，JAK/STAT）等 炎症通路［6］，例如，SP能通过下调p38和ERK的磷酸化以及NF-κB p50和p65的移位而抑制MAPK和NF-κB信号激活，从而发挥抗炎作用［7］。研究发现，SP能提高单核巨噬细胞的吞噬能力，促进巨噬细胞增生和淋巴小结形成［8］。因此，选用小鼠单核巨噬细胞RAW264.7进行研究。巨噬细胞是一种位于组织内的白血球，源自单核细胞，在不同药物刺激下极化为不同的功能表型［9-11］。由LPS 刺激激活为M1 表型，表现促炎活性，发挥促炎抑菌作用［12-13］。细胞由IL-4 刺激活化为M2 表型，表现抑炎活性，有利于促进组织生长和愈合［14-16］。

除了诱导巨噬细胞极化以外，脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）还能诱导细胞铁死亡［17］。铁死亡是一种铁依赖性、区别于细胞凋亡、坏死、自噬的新型细胞程序性死亡方式［18］。不同于其他形式调控细胞死亡的分子特征，其用于描述一种由活性氧积累引起的依赖铁的细胞死亡调控形式［19-20］。研究发现，LPS 除了引起巨噬细胞极化以外，还可剂量依赖性地增加细胞内总铁含量，Fer-1 可使其恢复［21］；铁死亡激活剂Erastin 可以通过激活STAT3 促进巨噬细胞M2 型极化增强上皮性卵巢癌的转移能力［22］；此外，铁死亡还能通过释放和摄取致癌KRAS 蛋白促进肿瘤相关巨噬细胞向M2 型极化，因此，巨噬细胞极化和铁死亡之间存在密切联系［23］。本研究重点探讨SP 对LPS 诱导的巨噬细胞极化和铁死亡这两个因素的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 多糖来源 从硇洲岛海岸采集的SP，用3.5%NaCl 溶液清洗，冷冻干燥，用水/乙醇（3∶7）在室温下提取24 h，搅拌，过滤。随后，提取物在减压下浓缩，残渣冷冻干燥，得到粗粉［24］。该海藻的凭证标本保存于广东医科大学海洋医药研究院。

1.1.2 试剂及仪器 10%胎牛血清、cDNA 合成试剂盒［（赛默飞世尔科技（中国）有限公司，2279604CP、01071349）］；DMEM 完全培养基［（赛默飞世尔科技（中国）有限公司，8120365）］；LPS、CCK-8 试剂、PMSF、ROS 检测试剂盒（碧云天生物技术有限 公 司，022621210706、073020200930、ST506-2、011521210621）；AG RNAex Pro RNA 提取试剂（湖南艾科瑞生物工程有限公司，A3A0031）。

Epoch 酶标仪（美国博腾仪器有限公司，Epoch）；傅里叶变换红外光谱仪（日本岛津公司，IRAffinity-1）；基因扩增仪（杭州柏恒科技有限公司，GE9612T）；荧光定量基因扩增仪（德国ANALYTIKJENA，qTOWER384G）；超分辨转盘共聚焦显微镜（Olympus，Ixplore SpinSR）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 巨噬细胞株小鼠RAW264.7 来自本实验室。细胞培养于含抗生素及10%胎牛血清的DMEM 完全培养基中，于37 ℃、5%CO2的孵箱中培养。细胞种板贴壁后，随机分为4组：①空白对照组（blank control，BC 组）：细胞用DMEM 完全培养基培养，未加任何其他材料；②不同浓度SP组：细胞以含不同浓度SP 的DMEM 完全培养基进行培养；③LPS 组：使用含终浓度为1 µg/ml LPS 的DMEM 完全培养基培养细胞；④SP+LPS 组：使用含有终浓度为1 µg/ml LPS 和不同浓度SP 的DMEM 完全培养基。细胞按各组要求加入相应培养基后，继续培养24 h，进行后续实验。

1.2.2 紫外吸光度检测 采用Epoch 酶标仪在200～400 nm 对SP 进行紫外吸光度分析，以判断其纯度及是否存在蛋白污染。

1.2.3 红外分光光度法分析SP结构 采用傅里叶变换红外光谱仪对SP进行红外吸光度扫描检测。

1.2.4 CCK-8 法检测RAW264.7 细胞增殖情况

取对数生长期细胞计数，以5 000 个/孔均匀地接种于96 孔板，细胞贴壁后，分别用不同浓度的LPS、SP予以相应处理；同时设置对照组，每个样品6个重复孔。放入孵箱继续培养24 h 后，每孔加入10 µl CCK-8 溶液，操作过程避光。放入孵箱继续孵育2 h，避光轻微振荡，待培养板内结晶完全溶解后，酶标仪于450 nm 处测定OD 值，并根据下列公式计算细胞存活率。细胞存活率（%）=（实验孔OD-空白孔OD）/（对照孔OD-空白孔OD）×100%

1.2.5 RT-qPCR RT-qPCR 试验参考SUH 等［25］的实验，取预处理、装于6 孔板中的细胞，采用AG RNAex Pro RNA 提取试剂抽提细胞总RNA。采用cDNA 合成试剂盒合成cDNA，以基因扩增仪进行逆转录操作，收集逆转录产物，使用荧光定量基因扩增仪进行PCR 反应，PCR 反应条件：95 ℃ 30 s，95 ℃5 s，60 ℃ 30 s，40 个循环。以GAPDH 作为内参，读取各样品Ct值，结果用2-ΔΔCt表示。引物序列见表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.2.6 Western blot 检测 收集药物干预后的细胞，使用加入PMSF 的细胞蛋白裂解液，冰上裂解，4 ℃、14 000 g离心20 min后，将蛋白样品与5×上样缓冲液按4∶1 体积混合，100 ℃煮沸10 min。通过SDS-PAGE电泳后，转移至PVDF膜，用5%脱脂奶粉封闭2 h 后，加入一抗（1∶1 000）4 ℃过夜孵育，TBST 洗涤3 次。二抗孵育1 h，TBST 洗膜3 次后，用免疫印迹化学发光试剂（ECL）显影。抗体来源见表2。

表2 抗体来源Tab.2 Antibody source

1.2.7 ROS 检测 实验操作参考HUANG 等［26］方法。在细胞中加入1 ml 含有稀释DCFH 的PBS。实验后37 ℃下孵育20 min，每隔3 min混合1次。然后用无血清DMEM培养基洗涤细胞3次，最后以500 µl的PBS重悬。在超分辨转盘共聚焦显微镜下观察拍照，用Image J 计算出绿色荧光强度并对每组数据进行统计分析。

1.3 统计学处理 实验结果采用GraphPad Prism软件进行数据分析，两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 红外吸光度检测结果 将分离的SP进行红外光谱分析，结果显示，在3 087.83、1 520.14、1 183.61、1 061.94 cm-1处均显示吸收峰，分别为-OH、C=O、CO 和C-O-C 的特征吸收峰。C=O 说明其中含有醛基，C-O-C 是吡喃糖的特征吸收峰，因此，可以判定SP为吡喃型多糖。见图1。

图1 SP红外吸收扫描结果Fig.1 Infrared absorption scanning results of SP

2.2 紫外吸光度检测结果 紫外吸光度显示在280 nm 处无吸收峰，提示样品中无蛋白类物质，见图2。

图2 SP紫外吸收扫描结果Fig.2 Ultraviolet absorption scanning results of SP

2.3 SP 对LPS 处 理 的RAW264.7 细 胞 增 殖 的 影响 采用CCK-8 法考察细胞经不同浓度SP 和不同浓度LPS 处理RAW264.7 细胞后增殖活性的变化，结果见图3。图3A显示，与BC组比较，25～200 µg/ml组细胞增殖无显著影响（P＞0.05），但400 µg/ml SP 对RAW264.7 组细胞的增殖率为113.5%，与BC 组比较显著升高（P＜0.05），提示400 µg/ml SP 本身对RAW264.7细胞有促增殖作用。为避免多糖的促增殖功能，采用0、50、100、200 µg/ml 进行后续实验。采用不同浓度LPS 处理RAW264.7 细胞（图3B），观察LPS 对巨噬细胞增殖的影响，结果发现1、10、100 µg/ml LPS 对RAW264.7 细胞增殖有明显抑制作 用，抑 制 率 分 别 为（89.83±5.00）%、（86.26±1.19）%、（2.04±4.24）%，与BC 组比较有明显抑制作用（均P＜0.05），说明1、10、100 µg/ml LPS 对巨噬细胞增殖具有明显抑制作用。参考文献［27］，在后续实验中采用1 µg/ml LPS进行实验。

图3 SP及LPS对RAW264.7细胞增殖的影响Fig.3 Effects of SP and LPS on proliferation of RAW264.7 cells

进一步观察SP 对LPS 诱导的巨噬细胞损伤的保护情况（图3C），结果显示，25 µg/ml 浓度组细胞增殖抑制率为（76.05±15.41）%，与LPS 组比较差异无统计学意义（P＞0.05），而50、100、200 µg/ml 浓度组 细 胞 活 力 分 别 为（88.86±2.64）% 、（89.92±2.14）%、（94.29±1.47）%，与LPS 组比较显著升高（均P＜0.05）。这一结果说明高浓度的多糖对LPS诱导的细胞增殖抑制具有显著保护作用。

2.4 SP对巨噬细胞极化的调控

2.4.1 SP 对巨噬细胞极化相关标志物转录水平的影响 qPCR 结 果显示：25、100、200 µg/ml SP 组CD163 转录水平分别是BC 组的0.55 倍（P＞0.05）、2.88 倍（P＜0.01）、11.90 倍（P＜0.01）；IL-10 转录水平分别是BC 组的2.67 倍（P＞0.05）、6.88 倍（P＜0.01）、4.44 倍（P＜0.01）；Arg-1 转录水平分别是BC组的0.90 倍（P＞0.05）、6.16 倍（P＜0.01）、12.17 倍（P＜0.01）；由此得出一定浓度的SP能使RAW264.7细胞的IL-10、CD163和Arg-1表达量升高。见图4。

图4 SP对IL-10、CD163和Arg-1的mRNA表达的影响Fig.4 Effect of SP on mRNA expressions of IL-10，CD163 and Arg-1

2.4.2 SP 对巨噬细胞极化相关标志物的蛋白表达水平的影响 如图5 所示，与BC 组比较，iNOS、CD86 的蛋白表达量均随着SP 剂量的增加而降低，而IL-10在加入SP后蛋白表达量增加（P＜0.05）。结果与图4 的趋势一致。表明SP 单独作用小鼠巨噬细胞，可能导致细胞向M2型极化。

图5 SP对iNOS、IL-10、CD86蛋白表达的影响Fig.5 Effects of SP on protein expressions of iNOS，IL-10 and CD86

2.4.3 SP 拮抗LPS 诱导的RAW264.7 细胞极化进一步观察SP 能否拮抗LPS 诱导的巨噬细胞M1 型极化，RT-qPCR 结果（图6A）显示，在经过LPS 单独处理后，M1 极化指标CD80、iNOS 和TNF-α 的转录水平均显著升高（P＜0.01），经过LPS 和SP 处理后，相较于LPS 组各组均显著降低（P＜0.05）。LPS 组CD80 的 转 录 水 平 升 高 为BC 组 的70.78 倍（P＜0.01），LPS 和25、100 µg/ml SP 处理以后，降低为BC组的37.46、44.40 倍（P＜0.01）；LPS 组iNOS 的转录水平升高到BC 组的33.69 倍（P＜0.01），经过LPS 和25、100 µg/ml SP 处理以后，降低为BC 组的11.96、13.29 倍（P＜0.01）；LPS 组TNF-α 的转录水平升高为BC 组的14.14 倍（P＜0.05），LPS 和25、 100 µg/ml SP 处理以后，降低为BC 组的8.70、8.53 倍（P＜0.05）。M2 极 化 标 志 物CD163 经 过LPS 和25、100 µg/ml SP 处理后其转录水平显著升高为BC 组的14.85、55.84倍（P＜0.05）。

图6 SP对LPS诱导的RAW264.7细胞极化的影响Fig.6 Effects of SP on LPS-induced polarization of RAW264.7 cells

Western blot 结果显示（图6B），在经过LPS 单独处理以后，M1 极化相关标志物iNOS 的蛋白表达水平显著升高（P＜0.05），经过LPS和SP处理以后显著降低（P＜0.05）。BC 组和LPS 组的M2 极化标志物Arg-1 表达均不明显，因此无法进行比较，但经过LPS 和SP 处理后，其蛋白表达水平均增高并存在剂量依赖性（P＜0.05）。M2 极化标志物IL-6 经过LPS单独处理以后，蛋白表达水平显著降低（P＜0.01），经过LPS 和SP 共同处理，与LPS 组相比IL-P 表达水平显著升高（P＜0.01）。SP 能拮抗LPS 诱导的巨噬细胞M1极化。

2.5 SP拮抗LPS诱导的细胞铁死亡

2.5.1 SP 对LPS 损伤RAW264.7 细胞内ROS 的影响 如图7 所示，与BC 组相比，1 µg/ml LPS 损伤细胞24 h 后细胞内的ROS 水平明显升高（P＜0.01），而SP处理后的细胞内ROS相较于LPS组明显降低（P＜0.01），并呈剂量依赖性。

图7 DCFH-DA荧光探针检测细胞内ROS水平Fig.7 Intracellular ROS level was detected by DCFH-DA fluorescent probe

2.5.2 SP 对巨噬细胞内铁死亡相关基因GPX4 表达的影响 Western blot实验分析细胞中GPX4蛋白的表达，结果如图8 显示，与BC 组比较，LPS 组中的GPX4蛋白表达水平显著降低（P＜0.01）；经25 µg/ml马尾藻多糖处理后，GPX4 蛋白表达略微升高，但差异无统计学意义（P＞0.05），剂量加大后，400 µg/ml SP 与LPS 组相比，GPX4 蛋白表达显著升高，差异有统 计 学 意 义（P＜0.01）。SP 能 拮 抗LPS 引 起 的RAW264.7细胞GPX4蛋白表达水平升高，ROS水平升高。因此，SP能拮抗LPS诱导的细胞铁死亡。

图8 LPS和SP对GPX4蛋白表达的影响Fig.8 Effects of LPS and SP on expression of GPX4 protein

3 讨论

近年来，海洋药物研究一直是国内外研究的热点，海洋生物由于生活环境的不同，与其他物质相比，通常具有特殊化学结构和独特生物活性，比如抗氧化、抗衰老、抗炎、抗肿瘤、抗菌和神经保护等作用［28-29］。其中，海洋药物中许多萜类、生物碱、多糖类和多肽类等均具有抗炎活性，海藻多糖通常通过调控NF-κB、MAPK、JAK/STAT等信号通路发挥其抗炎作用，对海藻多糖的研究可以用于新型抗炎药的研发或者作为新型抗炎药的前体［30-31］。

巨噬细胞M2 极化有促进细胞生长和组织修复的功能［32］。前期已有研究证明石斛多糖、枸杞多糖能通过促进RAW264.7 细胞增殖作用来发挥其抗炎活性［33-34］，基于此，本实验采用CCK-8法观察SP各浓度对RAW264.7 细胞增殖的影响，选取对细胞增殖无明显抑制作用的SP（25、50、100、200 µg/ml） 开展研究，发现各浓度SP促进细胞增殖。研究结果表明，1 µg/ml LPS 对细胞增殖有显著影响，因此在后续实验中，均选取1 µg/ml LPS 进行操作。此外，检测SP 对LPS 诱导巨噬细胞的影响。以1 µg/ml LPS刺激RAW264.7 细胞24 h，再用不同浓度的SP 处理细胞，50、100、200 µg/ml SP 能显著拮抗LPS 引起的细胞活力下降。

结合其他“多糖通过调控小鼠单核巨噬细胞极化来发挥抗炎作用”的研究，比如黑灵芝多糖可显著降低巨噬细胞吞噬能力并抑制IL-1β、NO 和ROS的生成，由此得出结论黑灵芝多糖能抑制RAW264.7 细胞的M1 极化而发挥抗炎作用［35］。本研究基于M1、M2 巨噬细胞活化相关的表面膜蛋白iNOS、CD80、TNF-α、IL-10、Arg-1、CD206 等作为活化指标，qPCR、Wstern blot 结果均显示：当单独给予SP 刺激RAW264.7 细胞，特异性M2 亚型巨噬细胞的膜蛋白高表达CD206，IL-10、Arg-1 等，而iNOS、CD80、TNF-α 等特异性M1 亚型巨噬细胞各指标呈低表达，SP 通过活化巨噬细胞，分泌具有生物活性的细胞因子参与细胞的免疫功能，从而起到调节机体免疫的效应［36］。

研究发现，LPS 能诱导氧化应激、非血红素铁和血红素水平升高［37］。Ferrostatin-1 能通过抑制铁死亡减轻LPS引起的急性肺损伤［38］。铁死亡产生的主要原因是细胞内脂质活性氧生成与降解失衡，脂质活性氧堆积，导致细胞氧化性死亡［39］。GPX4、Nrf2等可以通过限制细胞对铁的摄入和减少ROS 的产生作为负性调节因子发挥抑制铁死亡作用［40］。本实验用LPS 诱导巨噬细胞，发现GPX4 蛋白表达降低，ROS产生增加，因此得出LPS能诱导巨噬细胞铁死亡［41］。再用不同浓度的马尾藻多糖处理LPS诱导过的RAW264.7 细胞，发现马尾藻多糖GPX4 的表达相比较于LPS 组显著降低，ROS 的产生也明显下降，充分说明马尾藻多糖能通过抑制ROS 的产生来拮抗LPS诱导的RAW264.7细胞铁死亡。

总之，SP 能促进巨噬细胞增殖，并保护LPS 引起的RAW264.7 细胞损伤。此外，它还通过抑制iNOS、TNF-α、CD80 和促进IL-10、Arg-1、CD206 蛋白及转录水平的表达，从而逆转LPS 诱导的RAW264.7 细胞向M1 型极化，其作用机制与抑制iNOS、TNF-α、CD80 和促进IL-10、Arg-1、CD206 蛋白及转录水平的表达有关。LPS 能通过抑制GPX4 蛋白表达、促进ROS 产生来诱导RAW264.7 细胞铁死亡，SP能逆转这一现象。由此说明SP能拮抗LPS诱导的RAW264.7细胞铁死亡，提示SP在抗炎方面具有巨大的开发潜力。为此，将进一步探讨SP炎症保护作用的具体分子机制，寻找其他更有效的下游分子靶点及信号调控通路，为相关药理研究和药物开发提供理论依据。