苦瓜苗期对高温胁迫的生理响应及耐热性初步评价

江 定，李光光，黄剑锋，郑岩松

（广州市农业科学研究院，广东 广州 510335）

【研究意义】苦瓜（MomordicacharantiaL.）属于葫芦科苦瓜属一年生攀援草本植物，性喜温暖湿润环境，较耐热不耐寒，最适生长温度为20～30 ℃［1-4］。广东处于中国东南沿海低纬地区，据伍红雨等［5］研究发现，广东1961—2018 年平均高温日数（日最高气温≥35 ℃）为16.3 d，其中2014 年最多（31.5 d）、1973 年最少（4.6 d），近58 年来高温日数逐渐增加，上升速率为3.03 d/（10 年）。广东的盛夏季节经常伴随着极端和持续高温等自然灾害，严重影响农作物的生长和发育，造成农作物减产、减收［6］，其中苦瓜就是经常被高温危害的一种蔬菜作物。据中国农技推广信息服务平台报道［7］，2021 年广东全年苦瓜种植面积在2.7 万hm2以上，是广东瓜类蔬菜重要的经济作物，具有重要的产业地位。而高温胁迫已成为影响苦瓜夏秋季节正常生长的主要因素，不仅使植株停止生长，甚至引起植株死亡。因此，认识和了解苦瓜高温胁迫生理响应情况，有助于采取措施提高苦瓜的抗逆性，同时合理评价苦瓜耐热种质资源，对种质创新及筛选耐热新品种具有重要的意义。【前人研究进展】目前，我国已有研究从农艺性状、生理特性等方面开展了苦瓜耐热性的鉴定及评价指标的筛选等。在苦瓜农艺性状研究方面，通过调查夏季高温环境下苦瓜植株田间表现，筛选出与苦瓜耐热性相关的农艺性状指标。郑岩松等［8］研究表明，苦瓜的耐热性与初花期、开花天数、果肉横径、果肉厚和总产量等性状指标呈正相关；李家明等［9］研究筛选出苦瓜单瓜重、叶柄长、瓜瘤密度、植株分枝性、叶长、主蔓直径、叶宽、瓜色、种子颜色、种子花纹和瓜肉厚等11 个耐热性鉴定指标；曾晶等［10］研究发现，产量、商品果数和单果重的变化率可作为苦瓜成株期耐热性强弱的鉴定指标。在苦瓜生理特性研究方面，郭培国等［2］研究表明，电解质渗透率、丙二醛含量、叶绿素含量、叶绿素荧光参数等与耐热性相关的生理指标可用于苦瓜耐热性评价；陈中钐等［11］研究筛选出超氧化物歧化酶（SOD）活性、叶绿素（Chl）含量、丙二醛（MDA）含量、相对电导率（REC）、过氧化氢（H2O2）含量和最大光化学效率（Fv/Fm）等6 个显著影响苦瓜苗期耐热性评价的单项指标。在各类农作物中，众多研究人员通过研究作物苗期来进行耐热性鉴定［12-14］，并且主要检测的生理指标大多数为相对电导率（REC）、丙二醛（MDA）含量、脯氨酸（Pro）含量、过氧化氢酶（POD）活性、超氧化物歧化酶（SOD）活性和过氧化氢酶（CAT）活性等，获得了不错的鉴定结果。总的来说，对比其他农作物，苦瓜耐热性方面的研究相对较少、较薄弱。【本研究切入点】在苦瓜耐热性方面研究中，利用测定REC、MDA 和Pro含量以及POD、SOD、CAT 活性等生理指标并综合评价苦瓜耐热能力的研究并不多。因此，本研究结合前人对苦瓜和其他农作物利用较好的6 个耐热性评价生理指标进行测定，通过隶属函数法综合评价苦瓜材料的耐热能力。【拟解决的关键问题】本研究以10 份苦瓜自交系和6 份苦瓜杂交种为试验材料，通过高温胁迫循环处理，开展不同苦瓜材料间的生理响应情况和耐热能力分析，以期为后续苦瓜耐热育种、中间材料的筛选与研究提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试苦瓜材料：10 份高代自交系，6 份杂种一代品种或组合（表1），均由广州市农业科学研究院提供（选育）。所有苦瓜材料在2022 年4月6 日用32 孔穴盘种植于广州市农业科学研究院海珠区总部，后续的检测试验在广州市农业科学研究院重点实验室完成。

表1 苦瓜材料信息Table 1 Bitter Gourd Materials Information

主要试剂：POD、SOD（NBT 法）、CAT（紫外吸收法）、MDA 和Pro 含量测试盒均购自苏州科铭生物技术有限公司。

主要仪器：实验室电导率仪FE30，梅特勒托利多科技（中国）有限公司；万能粉碎机TAISITE，天津市泰斯特仪器有限公司；紫外可见分光光度计UV-2450，日本岛津有限公司；微量电子天平Quintix35-1CN，德国赛多利斯天平，规格为30 g/0.01mg；高速冷冻离心机Sigma3-18k，德国西格玛实验室离心机公司；电热恒温水槽DK-8D 型，上海益恒实验仪器有限公司。

1.2 高温胁迫下苦瓜苗期生理指标测定

将长势均匀、3 叶1 心期的16 份苦瓜材料幼苗各分成2 小份，一份（每份苦瓜材料16 株）移至光照培养箱，进行高温胁迫循环处理，设置白天40 ℃/12h、夜间25 ℃/12h，相对湿度75%，光照强度10 000 Lx；另一份（每份苦瓜材料16 株）置于常温条件下（25 ℃）作对照。高温胁迫循环处理3 d 后，分别取16 份苦瓜材料苦瓜叶片共32个样品，测定REC、MDA 含量、Pro 含量、POD活性、SOD 活性和CAT 活性等生理指标，探索高温胁迫下不同苦瓜材料的生理响应。

1.2.1 REC 在苦瓜幼苗经高温胁迫循环处理3 d后，分别采集常温和高温处理下苦瓜叶片，每份苦瓜材料采4 株，每株采2 片完全展开叶共8 片，合计32 个样品。将叶片在纯净水中洗净并擦干，采用1.2 cm 的打孔器提取16 个叶片圆片，放进50 mL 试管中，加入30 mL 纯净水，常温下大力摇晃，然后静置10 h，测量浸提液电导率（R1）；之后置于100 ℃水浴煮沸30 min 后取出，待温度降至常温后测量浸提液电导率（R2）。重复测定3 次，取平均值。

REC（%）=R1/R2×100

1.2.2 MDA 和Pro 含量 在苦瓜幼苗经高温胁迫循环处理3 d 后，分别采集常温和高温处理下苦瓜叶片，每份苦瓜材料采4 株每株2 片完全展开叶共8 片，合计32 个样品。将叶片在纯净水中洗净并擦干，使用MDA 和Pro 含量测试盒，按照试剂盒说明书进行测定。

1.2.3 抗氧化酶活性 在苦瓜幼苗经高温胁迫循环处理3 d 后，分别采集常温和高温处理下苦瓜叶片，每份苦瓜材料采4 株每株2 片完全展开叶共8 片，合计32 个样品。在纯净水中洗净并擦干，使用测试盒测定POD、SOD 和CAT 活性，具体操作步骤按各试剂盒说明书。

1.3 数据处理

使用Microsoft Excel 2016 软件、SPSS 20.0 软件进行数据统计和分析比较。

耐热系数（Heat-tolerance coefficient，HTC）=处理测量值/对照测量值

采用隶属函数法分析评价每个材料耐热性。隶属函数值计算公式为：

式中，A 为各材料指标的隶属函数值，且A ∈［0,1］；Hmin、Hmax分别为各参试材料的最小值、最大值；B 为材料的模糊隶属函数均值，n为指标数。隶属函数均值B越大，表明耐热性越强。

2 结果与分析

2.1 高温胁迫对苦瓜苗期叶片相对电导率的影响

植物叶片REC 可以表征植物细胞膜受损伤的大小，是衡量植物逆境胁迫受害程度的重要生理指标［15］。从16 份苦瓜材料常温与高温胁迫的叶片REC 变化来看（表2），在常温环境生长的各苦瓜材料苗期叶片的REC 相对稳定，说明此时各苦瓜材料的电解质膜内外平衡，细胞膜透性正常运作；在经过高温胁迫处理3 d 后，各苦瓜材料苗期叶片REC 明显上升，但各苦瓜材料苗期叶片的REC 变化幅度不同，KG1 增幅最大、为29.34%，KG7 增幅最小、为1.68%，其中增幅显著的苦瓜材料有KG1、KG2、KG9、KG10、KG11、KG13、KG14、KG15 和KG16。

表2 高温胁迫与常温下16 份苦瓜材料的相对电导率、丙二醛含量和脯氨酸含量Table 2 Relative electrical conductivity,malondialdehyde and proline content of 16 bitter gourd materials under high temperature stress and normal temperature

2.2 高温胁迫对苦瓜苗期叶片丙二醛和脯氨酸含量的影响

MDA 是由于植物衰老或在逆境条件下受伤害，其组织或器官膜脂质发生过氧化反应的产物，MDA 含量变化与植物衰老及逆境伤害有密切关系，是评价质膜损伤程度的重要指标［16］。从表2 可以看出，经过高温胁迫处理3 d 后，KG1 和KG2 的MDA 含量显著增加，增幅分别为12.99%和106.15%；其他14 份苦瓜材料的MDA 含量下降，其中KG15 降幅最大、为57.00%，KG9 降幅最小、为4.54%，降幅显著的苦瓜材料有KG3、KG4、KG5、KG6、KG8、KG10、KG11、KG12、KG13、KG14、KG15 和KG16。

Pro积累是高温逆境下植物自我保护的手段，能有效束缚蛋白质水分以减少水分流失。一般状态下植物体内的Pro 含量较低，高温胁迫下植物通过积累Pro 以提升其抗性［17］。从表2 可以看出，经过高温胁迫处理3 d 后，有6 份苦瓜材料叶片Pro 含量增加，10 份苦瓜材料下降，KG1增幅最大、为175.83%，增幅显著的苦瓜材料有KG1、KG2、KG3、KG4 和KG10；KG8 降幅最大、为43.66%，降幅显著的苦瓜材料有KG6、KG7、KG8、KG9、KG11、KG14、KG15 和KG16。

2.3 高温胁迫对苗期苦瓜叶片抗氧化酶活性的影响

SOD、CAT、POD 是植物体内的抗氧化酶，在植物逆境代谢中起着重要的保护作用［18］。从表3 可以看出，经过高温胁迫处理3 d 后，苦瓜材料KG5 和KG14 的SOD 活性下降，且与对照相比，KG14 显著下降、为21.95 %；其他14 份苦瓜材料SOD 活性均有不同程度的增加，以KG10增幅最大、为183.85%，KG13 增幅最小、为5.75%，其中增幅显著的苦瓜材料有KG1、KG2、KG3、KG4、KG6、KG7、KG8、KG9、KG10、KG11、KG12、KG15 和KG16。同样的，各苦瓜材料的CAT 活性也表现出有增有降的情况，其中KG8、KG10、KG12 和KG16 的CAT 活性显著增加，其他12 份苦瓜材料CAT 活性均有不同程度的下降，以KG7 降幅最大、为76.48%，KG15 降幅最小、为6.03%；降幅显著的苦瓜材料有KG1、KG2、KG3、KG4、KG5、KG7、KG9、KG11、KG13 和KG14。POD 活性则表现出16 份苦瓜材料全部显著增加，以KG11 增幅最大、为419.90%，KG10增幅最小、为13.00%。总体来看，苦瓜材料的SOD 和CAT 活性没有表现出规律的一致增加或者下降，而POD 活性都表现出一致增加，可能是由于POD 对高温的响应与SOD 和CAT 不同。在SOD 和CAT 活性不足时，植物通过POD 活性增加来弥补对H2O2清除能力的降低。

表3 高温胁迫与常温条件下16 份苦瓜材料的抗氧化酶活性Table 3 Antioxidant enzyme activities of 16 bitter gourd materials under high temperature stress and normal temperature

2.4 苦瓜材料的耐热性初步评价

由各单项指标的耐热性系数（表4）可知，不同苦瓜材料经高温胁迫后，其REC、POD 与对照相比均不同程度上升（HTC＞1），而MDA、Pro、SOD 和CAT 在各材料间的耐热系数表现不一致，有的上升，有的下降。从变异系数可以看出，CAT 变异系数排在第1 位，为0.785；REC的变异系数为0.088，在所有6 项指标中变异系数最小，表明高温胁迫对苦瓜叶片的CAT 影响较大，对REC 的影响较小。由于同一材料不同单项指标以及同一指标不同材料的耐热系数变化都不同，难以根据单一指标的耐热系数判断材料耐热性的强弱，因此运用隶属函数法对16 份苦瓜材料耐高温评价指标进行初步评价，平均隶属函数均值越大，表明耐热性越强，由表5 可知,16 份苦瓜材料的耐热能力顺序依次为KG1＞KG2＞KG16＞KG11＞KG10＞KG3＞KG9＞KG12＞KG15＞KG4＞KG13＞KG8＞KG6＞KG5＞KG7＞KG14，其中KG1 为最耐热苦瓜材料，KG14 为最不耐热苦瓜材料。

表4 16 份苦瓜材料的各项指标耐热系数Table 4 Heat resistance coefficients of various indicators from 16 bitter gourd materials

表5 16 份苦瓜材料的隶属函数值Table 5 Membership function values of 16 bitter gourd materials

3 讨论

高温胁迫会对苦瓜产业带来不利影响，尤其是在广东夏秋季栽培的时候影响更突出。本研究表明各苦瓜材料经高温处理后各生理指标均发生了显著变化，对高温的抵抗性差异明显。高温胁迫引起植物细胞受害症状反映在多个方面，其中会使细胞质膜发生膜脂过氧化作用，使细胞膜渗透性增加，电解质外渗。MDA 是植物细胞膜脂过氧化产物［19］，REC 和MDA 含量能反映植物体内膜脂过氧化水平，间接反映热害程度。本研究中高温处理后各苦瓜材料苗期叶片的REC 上升，但有些材料上升差异不显著，与郭培国等［2］和陈中钐等［11］的研究结果一致。各苦瓜材料苗期叶片中，有2 份苦瓜材料MDA 含量增加，其他14 份苦瓜材料都减少，与郭培国等［2］研究高温胁迫对苦瓜叶片MDA 含量影响发现4 份苦瓜材料全部增加的结果不一致，与陈中钐等［11］研究中高温胁迫对苦瓜苗期叶片MDA 含量有2 份苦瓜材料减少、其他18 份苦瓜材料都增加的结果也不一致，可能是高温胁迫对不同苦瓜材料产生的MDA 含量应激反应也会不同导致的。

Pro 是植物体内有机渗透调节物质之一，可以调节细胞质的渗透势保护蛋白质分子，增加蛋白质分子的水合度维持光合活性作为活性氧的清除剂等［20］。本研究中各苦瓜材料Pro 含量在高温胁迫处理后有升有降，与郭培国等［2］和陈中钐等［11］对苦瓜材料进行高温胁迫处理后发现其体内Pro 含量全部增加的结果不一致，这可能与苦瓜材料、高温程度和胁迫时间的差异性有关。而有研究表明，耐热性较好的植物在高温胁迫下Pro 含量上升更快，植物体内Pro 积累越多其耐热性就越强［21-22］，但也有Pro 累积量与品种的耐热性强弱无关的研究结果［23］，还有研究认为耐热性弱的植物材料Pro 累积量高于耐热性强的材料［24］。因此，仅凭Pro 含量的增加或者减少无法判断耐热性强弱，只能表明Pro 在高温逆境下参与苦瓜耐热性的应激反应进行自我保护，其含量多少与苦瓜苗期耐热性存在一定相关性。

SOD、CAT 和POD 是植物体内清除活性氧自由基的重要抗氧化保护酶，本研究各苦瓜材料经过高温胁迫处理后苗期叶片的SOD 和CAT 活性有增加也有下降，POD 活性全部增加，与陈中钐等［11］的研究结果有所不同，可能是由于供试材料与处理方法不同，苦瓜植株对逆境的响应不同造成的，但说明这些抗氧化酶活性与苦瓜的耐高温胁迫性有一定的相关性，温度过高苦瓜会改变自身的抗氧化酶活性来清除体内过多的超氧自由基，从而减轻自身受高温胁迫造成伤害的影响。还有研究表明高温胁迫后黄瓜叶片SOD 和POD活性增加，CAT 活性下降［25］，或POD 和CAT活性增加，SOD 活性下降［26］，或SOD、POD 和CAT 活性均下降［27］等情况。本研究中3 种抗氧化酶活性的变化与上述研究均不一致。这可能与试验材料、高温程度、胁迫时间和提取条件［28］等因素的不同有关，这些生理指标与高温生理响应的相关性有待进一步深入研究。

总体来看，苦瓜受高温胁迫后，这6 个生理指标产生了不同变化，说明这6 个生理指标与苦瓜耐热性存在不同程度的相关性。郭培国等［2］发现REC、MDA 含量、叶绿素含量的变化值和叶绿素荧光参数比值（Fv/Fm）可以考虑作为评价苦瓜耐热性强弱的生理指标。陈中钐等［11］对苦瓜材料进行高温胁迫研究，筛选出SOD、Chl、MDA、REC、H2O2和Fv/Fm 等6 个显著影响苦瓜苗期耐热性评价的单项指标。而从本研究结果来看，苦瓜的耐热生理响应机制受多种因素影响，单一指标不足以判定苦瓜对逆境的适应能力。通过对耐热性评价常用的6 个生理指标REC、MDA、Pro、SOD、CAT 和POD 进行测定，使用隶属函数法综合这6 个抗性相关指标进行苦瓜耐热性初步评价，为苦瓜苗期耐热性鉴定和评价提供了理论依据，但在苦瓜耐热评价过程中仍需要综合考虑材料的差异性、植株结果时期田间农艺性状、产量性状等其他指标的影响，以提高综合评价的准确性。

耐热性评价在农作物新品种选育方面的研究利用有着广阔的应用前景，但需要深入研究与完善。陈中钐等［11］对苦瓜苗期耐热性生理指标进行测定，综合评价筛选出5 个强耐热类型苦瓜自交系，可作为耐热苦瓜新品种选配的亲本材料。姚金晓等［29］对12 份冬瓜材料测定相关的热害指数、形态学指标、生理生化指标，综合评价筛选到强耐热品种夏冠1 号和玲珑节瓜。田守波等［30］对23 份瓠瓜材料生理生化指标进行测定，综合评价筛选到9 份耐热性强的瓠瓜材料。万正林等［31］对4 份南方厚皮甜瓜品种耐热性进行比较，通过测定甜瓜苗期叶片中抗氧化酶（SOD、CAT、POD）活性、MDA 含量与叶绿素含量等，综合评价筛选出最耐热的甜瓜品种桂蜜12 号。因此，充分利用耐热性评价方法，有助于作物种质资源的鉴评与新品种选育。

4 结论

本研究结果表明，16 份苗期苦瓜材料的REC在高温胁迫与常温条件下相比全部增加，其中增幅显著的苦瓜材料有9 份；MDA 含量有2 份苦瓜材料显著增加，12 份苦瓜材料显著下降；Pro 含量有5 份苦瓜材料显著增加，而有8 份苦瓜材料显著下降。对于抗氧化酶活性结果来说，在高温胁迫与常温条件下相比较，SOD 活性有1 份苦瓜材料显著下降，而有13 份苦瓜材料显著增加；CAT 活性有4 份苦瓜材料显著增加，而有10 份苦瓜材料显著下降；而POD 活性则是16 份苦瓜材料全部显著增加。本研究筛选出耐热能力排在前5 名的苦瓜材料（KG1、KG2、KG16、KG11 和KG10）具有潜在的应用价值，可在后续苦瓜耐热育种中加以利用，其中KG1、KG2 和KG10 等3个耐热性较强的苦瓜自交系，可作为耐热苦瓜新品种试配的亲本材料；KG11 和KG16 为耐热性较强的杂种一代，可进一步田间验证结果时期耐热性强弱的真实性，以便后续进行该杂种一代新品种的推广应用。