50份黄瓜核心种质的SSR标记筛选与聚类分析

金庆敏，林毓娥，吴廷全，钟玉娟，王 瑞

（1.广东省农业科学院蔬菜研究所/广东省蔬菜新技术研究重点实验室，广东 广州 510640；2.广东省农业科学院设施农业研究所，广东 广州 510640）

【研究意义】黄瓜（CucumissativusL.）是世界各国普遍栽培的重要蔬菜作物之一［1-2］。我国黄瓜种植面积约占世界种植总面积的50%以上，黄瓜产量及种植规模均为世界第一［3-5］。此外，黄瓜一年内可多茬栽培，供应时间长，经济价值高，黄瓜产业在我国蔬菜中占有重要地位［1,6］。目前市场上黄瓜品种众多、遗传背景狭窄、品种间相似性高［7-8］，广泛收集黄瓜优质种质资源，并进行系统的鉴定、评价、分类和保存，对黄瓜新品种的选育、种质资源的保护及育种工作者权益的维护均具有重要意义［9］。【前人研究进展】随着生物科学的进步，SSR（Simple sequence repeat）分子标记已成为一种较为成熟的生物技术，可快捷有效地对主要作物及主要蔬菜种质资源遗传背景进行分析及鉴定［10］，有助于研究植物亲缘关系［11］。SSR 分子标记技术在水稻［12］、小麦［13］、玉米［14］、油菜［15］、辣椒［16-17］、茄子［18］、大白菜［19-20］、芥菜［21］、菜心［22］、黄瓜［3,23-26］、苦瓜［27-28］、节瓜［29］、南瓜［30］、大蒜［31］等多种作物中均有广泛应用。近年来，SSR分子标记技术在黄瓜种子纯度鉴定［23,32-34］、种质资源多样性分析［9,35］、重要功能基因定位等方面发挥了重要作用［36-37］。Danin 等［38］利用SSR 标记研究了不同葫芦科蔬菜品系的多态性，发现7个SSR 中有4 个可用于黄瓜品系的多态性检测，并在11 个黄瓜品种上进行了验证。陈劲枫等［11］综合109 个SSR 位点和398 个RAPD 条带对22份黄瓜材料进行聚类分析，结果发现可分为两类：CS 群（C.hytivus、黄瓜、西南野黄瓜C.sativusvar.hardwickii及野黄瓜C.hystrix）和CM 群（非洲角黄瓜C.metuliferus、甜瓜、菜瓜C.melovar.conomon及野生小甜瓜C.melossp.agrestis）。沈镝等［39］利用13 对来自黄瓜和甜瓜的SSR、ESTSSR 引物，对273 份西双版纳黄瓜种质群体进行遗传分析，发现遗传不同样本、不同种质以及不同来源地群体间均存在一定程度的差异。吕婧等［40］通过来自不同国家和地区的30 份代表性黄瓜种质资源进行SSR 扩增分析，发现23 对引物可以清晰检测出亚洲、欧美和印度群体遗传多样性，较客观地反映了黄瓜群体结构和地域性差异等信息。王蕾等［3］以来源不同的32 份黄瓜栽培品种为材料，利用筛选出的17 对SSR 引物构建指纹图谱和分析遗传多样性，结果表明这17 对引物能有效区分出所有供试材料，在遗传相似系数（GS）为0.760 处可将32 份黄瓜品种聚为5 类。【本研究切入点】目前黄瓜品种众多，但对黄瓜核心种质资源遗传多样性的了解尚不充分。为进一步了解本课题组所收集黄瓜种质资源的多样性，明确黄瓜种质资源的遗传背景、分析其多态性及各黄瓜材料之间的亲缘关系，促进黄瓜种质资源的利用，本研究通过筛选有效的SSR 标记来评估和描述黄瓜核心种质资源的遗传多样性。基于筛选得到的SSR 标记，对黄瓜核心种质资源进行聚类分析，探索黄瓜核心种质资源之间的遗传关系及群体结构，深入了解不同种质资源之间的相似性和差异性，并揭示潜在的优良基因组合，为黄瓜育种和种质资源保护提供重要参考和指导。【拟解决的关键问题】本研究通过黄瓜基因组共设计了995 对SSR 引物，从中筛选出66 对引物对50份黄瓜核心种质资源的11 个重要外观果实性状进行调查，并通过SSR 分子标记分析对50 个黄瓜核心种质进行聚类分析，以了解黄瓜种质资源间的遗传相似性和差异性，分析其相关基因型、群体结构及可能的亲缘关系，为黄瓜遗传改良和种质资源管理及保存提供科学依据，为广东乃至华南地区高品质黄瓜遗传育种组合提供重要理论参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试材料为广东省农业科学院蔬菜研究所收集的来自全国各地的50 份黄瓜核心种质，其中华北型40 份、华南型9 份、华南型与华北型杂交的中间型黄瓜材料1 份。50 份种质材料均挑选25粒颗粒饱满且一致的种子，于2021 年2 月中旬浸种催芽，播种于穴盘育苗；3 月上旬（长出1～3片真叶）移栽于该所白云基地。每份材料选取生长一致的20 株进行种植，采用深沟高畦，畦宽1.8～2.0 m，畦高30 cm，株距30 cm，栽培管理按常规进行。

1.2 测定项目及方法

1.2.1 黄瓜核心种质的农艺性状调查 在黄瓜盛果期对50 份黄瓜种质材料进行性状调查统计，对瓜型、瓜把性状、皮色、瓜斑纹、刺瘤、性型、叶色等11 个性状进行调查和登记。瓜型分为圆筒型、棒型、短棒型、纺锤型等；瓜把性状分为钝圆、溜肩、瓶颈型；皮色分为绿色、深绿、浅绿、乳白、墨绿；瓜斑纹分为块状、条状或无；斑纹色分为绿、黄或无；瓜斑纹分布分为顶部、底部或无；瓜刺瘤大小分为中、小或无；瓜刺瘤密度分为稀、密或无；瓜刺颜色分为白色或褐色；性型分为雌雄株、雌全株、强雌株；叶色分为绿、深绿。分类依据分参照李锡香等编著的《黄瓜种质资源描述规范和数据标准》［41］。

1.2.2 黄瓜DNA 的提取 每份材料随机选取10株，每株取嫩叶一片，混合后于研钵中加液氮研磨，DNA 的提取参考姚春鹏等［42］改良版的CTAB 提取方法。DNA 样品检测时各取DNA 样品原液2 μL 并稀释至100 μL，取稀释后的DNA 样品1 μL，用ddH2O 作为空白对照，校正零点，于核酸蛋白分析仪上测定OD260、OD280的值。取5 μL 模板DNA 原液，加入2 μL 上样缓冲液，在加入Golden-View染料的0.8%琼脂糖凝胶上电泳，电泳缓冲液为1×TBE，电压为5 V/cm，稳压电泳20 min，然后于凝胶成像系统下观察拍照。

1.2.3 SSR 分子标记的选择 在黄瓜基因组数据库网站（http://www.cucurbitgenomics.org/）下载黄瓜已经公布的SSR 分子标记序列，设计995 对SSR 引物送生工生物公司合成，从中筛选出66 对SSR 引物对50 份黄瓜种质资源进行遗传多样性分析。选取表现形式差异大的10 份黄瓜DNA 样品用于分子标记筛选，选用稳定性好、条带清晰且多态性好的引物序列。

1.2.4 PCR 反应体系和扩增程序 PCR 扩增体系为20 μL反应体系：2 μL 10×buffer，2 μL dNTPs（2.5 mmol/L），1.5 μL Mg2+（20 mmol/L），0.4 μL上下游混合引物（10 mmol/μL），0.2 μL Taq DNA聚合酶（5 U/μL），2 μL DNA 模板（50 ng/μL），11.9 μL 灭 菌H2O。扩增程序为94 ℃预变性3 min，94℃变性30 s，54℃退火30 s，72℃延伸30 s，循环40 次，72℃延伸10 min。

1.2.5 SSR 标记的凝胶电泳 扩增产物在双垂直非变性浓度为8%的聚丙烯酰胺凝胶上电泳，120 V稳压 1.5 h，电泳结束后进行 0.1% AgNO3银染15 min；银染后用2% NaOH、0.4%甲醛、0.04%Na2CO3显色，显色后在灯箱上拍照分析。

1.2.6 数据处理 根据电泳图谱进行数据统计与整理，从上往下对等位基因数量进行统计。对每个样品的条带，有条带记为“1”，无条带记为“0”，由此形成0 和1 原始矩阵。利用NTSYS2.10e 软件进行分析得出遗传相似系数并进行聚类分析，绘制聚类图。

2 结果与分析

2.1 50 份黄瓜核心种质的性状调查结果分析

对50 份黄瓜种质资源的11 个性状调查结果（表1）显示，40 份华北型黄瓜种质材料的瓜型主要为棒型或短棒型，瓜把为溜肩或瓶颈型，条状瓜斑纹、瓜斑纹多为绿色且主要分布在瓜底部，瓜刺瘤中等大小、密度中等或密、白色瓜刺，大多为雌雄株（仅3 份为强雌株），叶片大多为绿色。9 份华南型黄瓜种质瓜型主要为圆筒型，只有1 份为短圆筒型；瓜把较为一致，全部为钝圆型；皮色较为多样，其中墨绿1 份、乳白1 份、浅绿4 份、绿色2 份、深绿1 份；瓜斑纹块状条状6 份、无瓜斑纹2 份、条状1 份；瓜斑纹颜色黄色7 份，无色2 份；瓜斑纹分布在顶部及底部6 份、底部1 份、无瓜斑纹1 份；无瓜刺瘤7 份、具有小瓜刺瘤2 份，且瓜刺瘤稀疏；瓜刺颜色与华北型相同，大多为白色、但有1 份为褐色；大多为雌雄株，其中1 份为雌全株；华南型黄瓜叶片均为深绿色。中间型黄瓜瓜型为纺锤型，瓜把形状为溜肩型，果皮绿色，条形绿色瓜斑纹、分布于底部，瓜刺瘤中等大小但较为稀疏，雌雄株，叶片深绿。

表1 50 份黄瓜核心种质农艺性状调查结果Table 1 Results of agricultural traits investigation from 50 cucumber core germplasms

2.2 66 对SSR 引物的多态性结果分析

66 对SSR 引物在50 份黄瓜核心种质资源进行多态性检测，共获得32 对稳定性好、条带清晰、多态性高的引物（表2）。本研究中32 对SSR 引物在50 份种质中共扩增出280 条等位基因片段，其中216 条多态性片段、占片段总数的77.1%，平均每对引物产生6.75 条多态性片段（图1）。根据数据统计得到0-1 矩阵，利用NTSYS2.10e软件进行分析得出50 份黄瓜种质资源最大遗传相似性系数是1.00，最小遗传相似性系数为0.62。其中，与其他材料相似性最小的为3 号，是广东地区的一个地方品种。相似性系数为1.00 的材料有40、41、46，从来源看，41、46 来自四川，40来自辽宁，虽然地区不同，但是材料相似。从图1 所示的扩增结果来看，50 份黄瓜核心种质间多态性非常明显，表明32 对引物可有效区分种质。在所选出的32 对引物中，4B-05、6B-26、6B-27、6B-28、6B-32、6B-39、6B-48、6B-61、6B-62 等9 对引物扩增出的多态性片段较少，仅为1～3 条，但其在材料间的差异较大，可作为种质鉴定及种子纯度鉴定的指纹标记引物。

图1 部分SSR 分子标记扩增产物电泳检测图Fig.1 Electrophoresis detection diagram of amplified products labeled with partial SSR markers

表2 32 对SSR 分子标记引物序列信息Table 2 Sequence information of 32 pairs of SSR molecular marker primers

2.3 50 份黄瓜核心种质的聚类结果分析

利用NTSYS2.10e 软件对多态性片段进行聚类分析，结果（图2）表明，50 份黄瓜种质的遗传相似系数（GS）最低为0.62，最高达1.00。

图2 50 份黄瓜核心种质的遗传多样性聚类分析Fig.2 Clustering analysis for genetic diversity of 50 cucumber core germplasms

相似系数为0.620 处，50 份黄瓜种质在聚类图上聚为I 类。

相似系数为0.754 处，50 份黄瓜种质可聚为7 类：（1）I 类仅包含来源于我国台湾省的S-6，果皮墨绿、无瓜斑、白刺的华南型黄瓜材料，是50 份黄瓜种质材料中唯一果皮墨绿、且既无瓜斑纹也无刺瘤的材料；（2）II 类包含40 份材料，分为两个亚组，包含所有华北型材料，40 份材料瓜型均为棒型或短棒型、瓜把为溜肩型或瓶颈型、瓜皮为绿色或深绿色、瓜斑纹绿色且位于底部、均有瓜刺瘤、刺瘤密度中等或密、瓜刺瘤大小均为中等、叶片颜色绝大部分为绿色；（3）III 类仅包含华南型1 份材料，50 份材料中唯一一个性型为雌全株的是华南型黄瓜中唯一瓜皮色为深绿色的材料；（4）IV 类包含华南型1 份、华南型与华北型黄瓜杂交后中间型材料1 份，其中中间型材料是50 份材料中唯一一份瓜型为纺锤型的材料，瓜把表现为华北型黄瓜的溜肩型，瓜刺瘤大小为中型，但瓜刺瘤密度则表现为华南型的稀疏型；（5）V 类包含华南型材料1 份，是50 份材料中唯一一份皮色为乳白色且瓜刺颜色为褐色的黄瓜材料；（6）VI 类包含华南型材料3 份，分两个亚组，瓜皮色均为浅绿色；（7）VII 类包含华南型材料2 份，VII 类与VI 类的区别在于瓜的皮色，该组材料的皮色均为绿色。

相似系数为0.851 处，50 份黄瓜材料则可聚为9 类：I 类包含华南型材料1 份；II 类包含华北型材料40 份，分为2 个亚组；III 类包含华南型材料1 份；IV 类包含华南型材料1 份；V 类包含中间型材料1 份；VI 类包含华南型材料1 份；VII 类包含华南型材料3 份，分为2 个亚组；VIII类包含华南型材料1 份；IX 类包含华南型材料1 份。

从种质来源上看，50 份黄瓜种质材料并没有严格按照东北、华北、华中、华南、西南等地域因素聚为一类，同一来源的各类群种质均有一定差异，表明SSR 分子标记可在一定程度上反映种质资源亲缘关系及遗传多样性。从类型上看，所有华北型黄瓜聚为一类，而华南型黄瓜则比较分散，表明华北型黄瓜材料间相似系数较高、亲缘关系较近、遗传背景较窄；华南型黄瓜材料间相似系数较低、亲缘关系较远、遗传背景较宽、遗传多样性丰富。

3 讨论

种质资源是遗传育种的基础，黄瓜品种间多态性远低于同属甜瓜［43］。市面上的黄瓜栽培品种更是存在遗传背景狭窄、遗传多样性差等问题，收集、鉴定、保存多态性丰富的种质资源，拓展黄瓜的遗传多样性对黄瓜的遗传育种及生产有着极为重要的意义。本研究利用筛选出的32 对SSR引物在50 份黄瓜种质资源中共检测出280 个基因位点，每个引物平均检测出6.75 个位点，多态性位点216 个，引物多态性达77.1%，均高于王蕾等［3］、李翔等［44］、苗晗等［45］研究结果，其中王蕾等［3］利用17 对引物对32 份黄瓜品种进行聚类分析，发现每条引物平均检测基因数仅为4.59个，引物多态性仅为71.8%，表明本研究所筛选的SSR 引物具有较高的多态性，可用于50 份黄瓜种质材料的遗传多样性分析和鉴定。

遗传相似系数越小，变幅越大、物种的遗传分化越大、遗传多样性越高、遗传背景越复杂［45］。本研究中50 份黄瓜种质材料的遗传相似系数分布于0.62～1.00 之间，遗传相似系数变化范围高于杨福强等［46］研究结果，表明其具有较为丰富的多态性。本研究中，在遗传相似系数为0.754 处的40 份华北型黄瓜材料聚为一类，此结果与所调查黄瓜材料的性状特征表现较为一致。40 份华北型黄瓜材料性状调查结果显示，其瓜型多为棒型，瓜把多为溜肩型或瓶颈型，皮色多为绿色或深绿，瓜斑纹绿色条形，多分布在底部，瓜刺瘤大小中等，密度中等，绝大多数为雌雄株。9 份华南型黄瓜材料聚为6 类，具体为I 类、III 类、IV 类、V 类、VI 类、VII 类，此结果与所调查华南型黄瓜性状表现结果也较为一致。本研究所调查华南型黄瓜材料的瓜皮颜色、瓜刺瘤、瓜皮斑纹等性状具有多样化，表明华南型黄瓜种质资源具有丰富的遗传多样性，且与史建磊等［5］、苗晗等［45］等研究结果一致。史建磊等［5］研究得出，48 份华南型黄瓜材料的遗传相似系数（GS）介于0.375～1.000 之间，本研究遗传相似系数结果仅为0.620～1.000 之间，可能与本研究中华南型材料特异性不明显有关，本研究所用的大部分材料为华北型，华南型黄瓜材料仅有9 份，同时也表明我国华北型黄瓜遗传背景狭窄。

从聚类图上看，与本研究大多数黄瓜种质材料遗传距离较远的为3 号材料，这是广东省的地方品种，该材料与其他黄瓜材料基因交换较少。1 号黄瓜材料来自我国台湾省，其单独聚为一类，表明1 号材料与其他材料遗传距离较远。由华北型黄瓜材料与华南型黄瓜杂交所得的中间型黄瓜材料，为50 份材料中唯一一份果型为纺锤型的材料，该材料瓜把表现为华北型黄瓜的溜肩型，瓜刺瘤大小为中型，但瓜刺瘤密度则表现为华南型的稀疏型，另在遗传相似系数为0.705 处，49 号中间型材料及1、2、9 号华南型黄瓜材料与华北型黄瓜材料聚为一类，表明9 份华南型黄瓜材料中，1、2、9 号材料与华北型黄瓜材料的亲缘性高于3、4、5、6、7、8 号材料。聚类分析结果可为利用这些种质资源进行黄瓜育种组合提供依据和参考，为品种种子纯度鉴定提供可靠的技术支撑。

4 结论

本研究通过66 对引物对50 份黄瓜核心种质材料进行筛选，得到32 对稳定性好、条带清晰、多态性高的SSR 引物。50 份黄瓜材料的遗传相似系数在0.620～1.000 之间，在遗传相似系数为0.754处，50 份黄瓜材料聚为7 类；在遗传相似系数为0.851 处，50 份黄瓜材料聚为9 类。聚类分析结果表明，50 份黄瓜核心种质材料中，华北型黄瓜材料和华南型黄瓜材料间相似系数低、亲缘关系远；华北型黄瓜材料间相似系数高、亲缘关系近、遗传背景窄、遗传多样性差；而华南型黄瓜材料间相似系数较低、亲缘关系较远、遗传背景宽、遗传多样性丰富。本研究结果可为黄瓜种质材料遗传结构研究及广东乃至华南地区高品质黄瓜育种组合选育提供依据和参考。