鸡肠道微生物群的重要性及其研究方法

文│辛勤（山东省邹城市畜牧兽医事业发展中心）

胃肠道的完整性和肠道微生物群在营养吸收、免疫发育和抗病方面起至关重要的作用。胃肠道微生物群的改变可能对鸡的饲料效率、生产力和健康产生不利影响。了解鸡胃肠道微生物群的作用和目前微生物群研究方法对改善家禽胃肠道微生物群具有重要意义。当前，细菌16S核糖体RNA基因测序的应用极大提高了对鸡胃肠道微生物群组成和多样性的了解。笔者就鸡肠道功能及影响鸡胃肠道微生物群多样性的因素进行综述，还比较和回顾了过去和现在用于鸡肠道微生物群研究的方法。

一、鸡胃肠道微生物群的作用

鸡胃肠道分布着复杂的微生物群落，包括细菌、真菌、古生菌、原生动物和病毒。肠道微生物群可以附着在肠上皮细胞壁上形成保护屏障，从而减少致病菌定植的机会。这些细菌产生维生素（如维生素K和维生素B）、短链脂肪酸（如乙酸、丁酸和丙酸）、有机酸（如乳酸）和抗菌化合物（如细菌素），降低甘油三酯，并诱导非致病性免疫反应，为动物提供营养和保护。另一方面，胃肠道微生物群也可能是沙门氏菌和弯曲杆菌等病原体的来源，它们可以传播给人类，可能对公共卫生构成严重威胁。

正常的肠道微生物群对宿主有好处也有坏处。共生微生物群提供的主要好处是竞争性地排除病原体或非本体微生物，免疫刺激，以及对宿主提供营养。此外，共生微生物群可以刺激免疫系统的发育，包括黏液层、上皮单层、肠道免疫细胞（如细胞毒性和辅助性T细胞、免疫球蛋白产生细胞和吞噬细胞）和固有层，在宿主和微生物之间建立屏障，对抗有害肠道微生物。在远端肠道（盲肠和结肠）中，微生物群也可产生能量和营养物质，如维生素、氨基酸和短链脂肪酸，最终为宿主所利用。这些短链脂肪酸具有抑菌特性，能消除食源性病原体，如沙门菌。短链脂肪酸也是动物的能量来源，并能进一步刺激肠道上皮细胞增殖，从而增加胃肠道吸收表面积。短链脂肪酸的产生会降低结肠pH值，从而抑制胆汁向次级胆汁产物转化。此外，肠道微生物群还参与宿主氮化合物的代谢，盲肠细菌可以将尿酸转化为氨，随后被鸟类吸收，并进一步用于生产谷氨酰胺等氨基酸。共生微生物群也会给宿主带来危害。在近端肠道（砂囊和小肠）中，微生物群与宿主争夺能量和蛋白质。在近端和远端肠道中，微生物可产生有毒代谢物（如氨基酸分解代谢物）和分解胆汁酸，分别抑制鸡只生长和降低脂肪消化率。微生物群的存在和活动增加了机体对能量和蛋白质的需求，对鸡的生长性能有一定影响。

不平衡的肠道微生物群通常被称为肠道生态失调，可能导致胃肠道的一系列不良反应，包括肠道屏障功能降低（如肠壁变薄）和营养物质消化不良，增加了微生物群更替和炎症反应的风险。非传染性和传染性应激源均可导致微生物群失调。非感染性因素包括环境应激、营养失衡、饮食改变、霉菌毒素、管理不善、酶功能障碍或宿主遗传。感染因素包括病毒或细菌侵入、球虫病或有害微生物如产气荚膜梭菌产生的有毒代谢物。

肠道微生物群可进一步分为肠腔内微生物群和黏膜微生物群。肠腔内微生物群的组成由可用营养物质、抗菌物质含量和饲料通过速率决定。黏膜附着菌群的组成受多种宿主因素的影响，如肠细胞膜上特异性黏附位点的表达、分泌免疫球蛋白的分泌和黏液的产生率。

肠道微生物群的组成和功能已被证明根据鸡只日龄、在肠道中的位置和饮食成分而变化。日龄是影响胃肠道细菌组成、细胞密度和代谢功能的重要因素之一。随着鸡日龄的增长，梭状芽孢杆菌的相对丰度较高，而乳酸杆菌在整个生长周期中含量较低。3日龄鸡的肠道中含有乳酸杆菌、产气荚膜梭菌和弯曲杆菌，而7～21日龄鸡的肠道中更常见的是嗜酸乳酸杆菌、肠球菌和链球菌，28～49日龄时，肠道中开始含有大量卷曲乳杆菌。肠道不同位置的微生物群大不相同，小肠中主要的细菌包括肠球菌、梭菌、乳酸杆菌、葡萄球菌、甲基杆菌、拟杆菌、双歧杆菌、埃希氏菌、弯曲杆菌、志贺菌和棒状杆菌等；盲肠中主要的细菌包括甲烷球菌、乳酸螺旋杆菌、芽孢杆菌、链球菌、梭菌、葡萄球菌、链球菌、双歧杆菌、大肠杆菌和弯曲杆菌等；大肠中主要的细菌包括乳酸杆菌和埃希氏杆菌。饲料成分直接影响到肠道微生物群，如饲料中的益生元对结肠中的一些细菌具有积极影响，低聚果糖和低聚半乳糖可增加双歧杆菌和乳酸杆菌的数量，除Bifidobacterium bifidum（双歧杆菌的一种）外，大多数双歧杆菌菌株（如Bifidobacterium fiagilk、Bifidobacterium thetaiotaomicron、Bifidobacterium vulgatus、Bifidobacterium dktasonk和Bifidobacterium ovatus）都可以利用低聚果糖作为生长和发酵促进剂。而大肠杆菌和产气荚膜梭菌等微生物无法利用低聚果糖作为发酵碳水化合物来源。另一种益生元，甘露寡糖与具有1型菌毛（甘露糖敏感凝集素）的潜在致病性革兰氏阴性菌（如大肠杆菌和沙门氏菌）结合，防止病原体附着在肠壁上。因此，饮食中的益生元对下肠道的影响包括作为盲肠和结肠微生物群的食物和发酵源，发酵终产物（如不饱和脂肪酸）的产生，刺激糖解发酵；大肠内容物的酸化，盲肠和结肠上皮的增生，刺激结肠激素肽的分泌和肠道内容物在盲肠-肛门运输的加速。肠道微生物群的组成和功能还受到饲养管理、品种、性别和环境应激等多种因素的影响。

二、鸡胃肠道微生物群的研究方法

研究鸡肠道微生物群的传统方法是基于微生物培养，这些方法对特定条件下的可培养细菌具有高度选择性。但大多数微生物难以被培养，一般认为给定样本中存在的极少数（仅为0.1%～1%）微生物群可以被培养。因此，肠道微生物群的丰富度（物种数量）和多样性（相对丰度）难以通过培养的方法被了解和研究。

分子生物技术的发展为研究肠道不同部位微生物群的组成、多样性、功能研究和预测，以及相互作用提供了新的研究方法，每种技术都有相应的优点和缺点。16S rRNA基因扩增产物的高通量测序方法能广泛鉴定肠道微生物群的属、种、株，数据库丰富，但成本高昂，耗时费力。Realtime PCR方法能对靶向群体中的特异性基因表达，灵敏度高，同样受限于成本。变性梯度凝胶电泳、温度梯度凝胶电泳、时间温度梯度凝胶电泳、末端限制性片段长度多态性和单链构象多态性等方法能扩增常见的16S rDNA序列，快速且方便比较，但只能提供相对粗略的分类和分辨，数据通常是定性或半定量的。其中，16S rRNA基因扩增子的高通量测序已迅速成为鸡胃肠道微生物群研究的首选方法。16S rRNA分子是核糖体的一个小亚基，具有所有细菌中高度保守的序列相似区域。从粪便或消化物样本中提取微生物DNA，并使用靶向16S rRNA基因保守区的宽范围引物进行PCR扩增。这些扩增产物的测序通常可以在属或种水平上区分细菌，每个序列的相对丰度反映了原始样本中该细菌的相对丰度。

高通量或下一代测序方法成为研究肠道微生物群的生物学和生态学作用的有力工具。下一代测序方法已成为一种方便、快速、准确的基因组研究方法，尽管有许多优点，但也存在局限性，包括读取时间短和成本高。宏基因组学已被用于研究盲肠功能、肠道对病原体攻击的反应、微生物反应与生产性能参数的相关性、肥瘦肉鸡品系的比较、病毒组描述和抗生素耐药基因。然而，由于使用的数据平台、品种、样本类型、采样方法等方面的差异，很难进行比较。为了规避基于序列分析的一些限制，蛋白质组学方法最近也被用于确定微生物群的代谢和功能特性。转录组学测量基因原位转录，即使在采样过程中需要非常小心，也能准确反映生理功能。多组学方法的开发和应用对未来的研究非常重要，将有助于我们更好地了解如何根据环境、饮食和生理变化来优化鸡肠道微生物群，从而为提升鸡的健康提供新的可能。