辐照对中华鳖裙边和肌肉挥发性成分的影响

王伯华,王晨曦,雷颂,2,3,李清钦

1(湖南文理学院 生命与环境科学学院,湖南 常德,415000) 2(省部共建淡水鱼类发育生物学国家重点实验室鱼类健康养殖分中心,湖南 常德,415000) 3(环洞庭湖水产健康养殖及加工湖南省重点实验室,湖南 常德,415000)

中华鳖(Trionyxsinensis)是我国的特色水产品,具有独特的清香风味[1-3],深受消费者青睐。在中国分布广泛,湖南、浙江、江西、湖北等地均有养殖[3]。中华鳖等甲鱼不同可食用部位的营养成分[4-6]和风味[2]各不相同。裙边富含蛋白质,其中一半左右为胶原蛋白[7],锌、硒等矿物质含量丰富,脂肪含量极低,壬醛、辛醛、2,4-癸二烯醛等为主要挥发性化合物[2]。肌肉蛋白含量比裙边低,但必需氨基酸和限制性氨基酸含量均高于裙边[5],主要风味成分有乙酸乙酯、2,3-丁二酮等[2]。

目前,中华鳖仍以鲜销为主,存在宰杀困难、加工费时等问题,影响了消费人群的积极性,限制了该产业的发展。将其宰杀分割加工成预制菜能针对性解决上述痛点,具有一定的市场潜力。预制菜加工时若高温灭菌时间过长,食材风味破坏严重,时间短则杀菌不充分易发生腐败变质。为充分保留中华鳖的原有风味,宜采用高温灭菌结合冷杀菌处理来延长其保质期。辐照处理的食品不会显著升温,可降低菌落总数并有效杀灭腐败菌和病原菌,能较好地保持食材原有品质。研究表明[8],在10 kGy剂量下的辐照食品是安全的,但是辐射分解的离子和自由基会引起蛋白质、碳水化合物、脂类等食品组分的化学变化,进而导致辐照异味的产生。应根据食品原料和工艺选择合适的辐照剂量,以获得较佳的产品品质。

目前关于辐照对中华鳖风味的影响报道较少,特别是辐照分别对中华鳖裙边和肌肉风味的影响鲜有研究。因此,本试验以中华鳖为研究对象,采用顶空固相微萃取结合气质联用仪(headspace solid-phase microextraction coupled with gas chromatography-mass spectrometry, HS-SPME-GC-MS)测定裙边和肌肉的挥发性化合物,结合气味活度值(odor activity value, OAV)筛选关键化合物,通过偏最小二乘法判别分析(orthogonal partial least squares-discriminant analysis, OPLS-DA)确定不同辐照剂量分别对裙边和肌肉风味的影响,为中华鳖预制菜的品质保真提供数据支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

中华鳖,仿生态养殖,体重1.3～1.5 kg,常德仙湖农业科技有限公司;乙醇、NaCl,均为分析纯,国药集团化学试剂有限公司;2,4,6-三甲基吡啶(≥99%),Sigma公司。

1.2 仪器与设备

AUX120电子天平,日本岛津公司;FSH-II高速匀浆机,武汉格莱莫检测设备有限公司;PL203 型电子天平,梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司;7820-5977 GC-MS气相色谱质谱联用仪,安捷伦科技有限公司;50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取头,美国Supelco公司。

1.3 实验方法

1.3.1 样品制备

室内暂养3 d后宰杀,去膜、去除内脏和脂肪、剪爪分割、焯水、清洗沥水、真空包装、121 ℃,105 kPa高压蒸煮10 min。冷却后置4 ℃冰箱保存,当天进行后续辐照处理。

1.3.2 辐照处理

将处理好的样品冷链运至湖南省辐射技术应用研究中心进行辐照处理,放射源为60Co-γ射线(活度为3.14×1016Bq),辐照剂量分别为0、1、3、5、7、9 kGy,其中0 kGy为空白对照,每组设3个平行。采用重铬酸银和重铬酸钾(银)剂量计进行剂量跟踪,剂量计经中国计量科学研究院标定,剂量误差在±3%以内。

1.3.3 风味感官评定标准

样品由10名(5男5女)食品科学专业师生根据表1中的感官评定标准于室温下进行感官评分,得分取平均值。

表1 中华鳖风味标准Table 1 Evaluation criteria of Trionyx sinensis smell

1.3.4 挥发性成分分析方法

取不同辐照剂量样品,剔除骨头及背壳,分别取裙边和肌肉用搅拌机打碎。称取3 g样品加入15 mL顶空瓶中,添加样品量5%(质量分数)的NaCl和3.03 μg的2,4,6-三甲基吡啶内标液,混匀后盖紧瓶盖。将顶空瓶在80 ℃条件下平衡15 min后插入50/30 μm CAR/PDMS/DVB萃取头,在80 ℃条件下吸附萃取40 min后迅速取出,进样后于250 ℃ 解析5 min,然后通过GC-MS进行检测。

气相条件:DB-5MS色谱柱(30 m×0.25 mm,0.25 μm);初始温度35 ℃保持3 min,以10 ℃/min升至200 ℃,再以20 ℃/min升至260 ℃保持8 min;进样口温度250 ℃;载气(He)流量1.5 mL/min;不分流进样。

质谱条件:电子轰击离子源,接口温度280 ℃,电子能量70 eV,质量扫描范围30～500 m/z。

1.3.5 挥发性成分定性和定量方法

风味成分经气相色谱分离后,利用NIST14.L质谱库进行检索,结合保留指数进行定性分析。参照麦锐杰等[9]的方法,以2,4,6-三甲基吡啶为内标进行定量分析,计算如公式(1)所示:

(1)

式中:X为待测组分的绝对含量,μg/g;A待测为待测组分峰面积;A内标为内标物峰面积;m内标为内标物质量,μg;M样品为样品质量,g。

1.3.6 OAV评定方法

参照朱文政等[10]的方法,采用OVA评价各化合物对总体风味的贡献,OAV≥1时,表示该挥发性风味物质对总体风味起主要贡献;OAV<1的物质对总体风味贡献不大。计算如公式(2)所示:

(2)

式中:C为各挥发性风味物质的绝对含量,μg/g;T为各挥发性风味物质对应的阈值,μg/g。

1.4 数据统计分析

每组数据结果用3组平行试验的平均值±标准差表示,采用SPSS 24.0进行数据分析,运用SIMCA-P 14.1 软件进行OPLS-DA分析及绘图。

2 结果与分析

2.1 不同辐照剂量中华鳖的风味评定

辐照可引起食品中的水分、蛋白质、碳水化合物等各组分发生电离作用,进而引起这些物质的许多化学反应,使得食品风味发生变化[8]。不同辐照剂量中华鳖的风味评分见图1。由图1可知,与空白组相比,1、3 kGy剂量组的不良气味略有减轻,且保留了中华鳖固有气味,5 kGy处理组与空白对照组相比得分没有显著变化,辐照剂量增加至7 kGy和9 kGy时,评分显著下降,说明辐照异味对整体风味的影响较大。

图1 不同辐照剂量风味评分Fig.1 Flavor score with different irradiate doses注:图中不同字母表示显著性差异(P<0.05)。

2.2 不同辐照剂量中华鳖裙边和肌肉的挥发性成分分析

对不同辐照剂量处理的中华鳖可食用部分进行了挥发性物质检测,通过HS-SPME-GC-MS 技术从中华鳖裙边里共鉴定出38种成分,中华鳖肌肉里共鉴定出27种成分,具体物质数量和相对含量见图2和图3。

a-中华鳖裙边;b-中华鳖肌肉图2 不同辐照剂量中华鳖裙边和肌肉的挥发性物质数量Fig.2 Number of volatile compounds in Trionyx sinensis calipash and meat irradiated with different doses

a-中华鳖裙边;b-中华鳖肌肉图3 不同辐照剂量中华鳖裙边和肌肉的挥发性物质相对含量Fig.3 Relative contents of volatile compounds in Trionyx sinensis calipash and meat irradiated with different doses

由图2可以看出,中华鳖裙边中检出的38种挥发性物质中含醇类物质7种,醛类物质12种,酮类物质4种,烷烃类物质4种,酸类物质1种,芳香烃物质3种,烯烃类物质3种,酯类物质4种。中华鳖肌肉中检出的27种挥发性物质中含醇类物质2种,醛类物质8种,酮类物质3种,烷烃类物质7种,芳香烃类物质2种,烯烃类物质4种,酯类物质1种。辐照后,裙边和肌肉中均新产生了烯烃类物质,辐照剂量达到7 kGy后,裙边中新产生了酸类物质。在9 kGy及以下时,其余化合物数量与辐照剂量之间无明显规律。

由图3可以看出,不同辐照剂量的中华鳖裙边和肌肉中醛类物质含量较多。辐照处理后烯烃类物质的相对含量增加,可能是因为脂肪酸C—C键经辐照处理,断裂产生正烷类化合物,再通过次级反应转化为烯烃类物质[8]。辐照剂量达到5 kGy后,中华鳖肌肉中烷烃类物质相对含量明显增多。

2.3 辐照剂量对中华鳖裙边和肌肉挥发性物质的影响

2.3.1 醛类物质

醛类化合物的阈值较低,主要源于不饱和脂肪酸和氨基酸的降解[11],构成了水产品的重要特征性风味。由表2可知,随着辐照剂量的提高,中华鳖裙边中的醛类物质总含量先降低再升高,在3 kGy辐照剂量时含量最低。其中十一醛和具有油脂味的癸醛在辐照后彻底脱除,具有清香气味的β-环柠檬醛经辐照后含量明显下降,当辐照剂量达到9 kGy 时,新产生了具有脂肪气息的(E,E)-2,4-癸二烯醛和(E)-2-壬烯醛。原因可能是辐照剂量大于3 kGy会明显促进脂质氧化[12],导致了醛类物质的含量增加,促进了辐照异味的产生。

由表3可知,中华鳖肌肉中的醛类物质总含量随辐照剂量的提高呈先降低再升高趋势,在3 kGy辐照剂量时含量最低,与中华鳖裙边中的规律一致。具有清香气味的β-环柠檬醛经辐照后全部脱除,当辐照剂量达到7 kGy 及以上时,具有鱼腥味和青草味的已醛含量显著增加,并新产生了具有甜香、蜡香的(E)-2-十二烯醛,辐照剂量达到9 kGy时,新产生了十一醛。结合表2和表3来看,7 kGy和9kGy辐照剂量处理对中华鳖裙边和肌肉醛类化合物成分和含量均产生了影响,是导致其产生辐照异味的原因之一。

表3 不同辐照剂量中华鳖肌肉的挥发性风味物质 单位:μg/g

2.3.2 醇类物质

挥发性醇类物质主要由多不饱和脂肪酸氧化产生[13],或由醛酮类等羰基化合物还原而来[14],阈值较低,对中华鳖总体风味有一定贡献。由表2可以看出,辐照剂量为1 kGy的处理组中,中华鳖裙边中醇类物质含量最低。随着辐照剂量的提高,产生了1-十四醇、2-十六醇、2,2,6-三甲基-6-乙烯基四氢-2H-呋喃-3-醇、3,7,11-三甲基-1-十二烷醇和叔十六硫醇等新的醇类物质。经辐照处理,中华鳖裙边中具丁香香韵的α-松油醇被完全脱除,具有玫瑰香气的苯乙醇的含量降低,使得裙边的清香味减弱。由表3可以看出,中华鳖肌肉中的醇类物质只有2种,辐照剂量达到9 kGy时,新产生了环戊醇。结合表2和表3可知,辐照氧化产生的醇类物质主要来源于裙边,对整体风味产生了一定的影响。

2.3.3 其他挥发性物质

结合表2和表3可知,中华鳖裙边和肌肉中均检出了香叶基丙酮、4-[2,2,6-三甲基-7-氧杂二环[4.1.0]庚-1-基]-3-丁烯-2-酮和β-二氢紫罗兰酮3种酮类物质。上述物质与文献[2]指出的2,3-丁二酮、2,3-戊二酮等是对中华鳖风味贡献较大的酮类物质有所不同,徐远芳等[15]在不同辐照剂量处理的甲鱼预制菜中也未检出2,3-丁二酮等物质,可能是由养殖方式和生长环境等差异造成。辐照剂量为3 kGy时,4-[2,2,6-三甲基-7-氧杂二环[4.1.0]庚-1-基]-3-丁烯-2-酮被降解脱除。辐照后的裙边中新产生了环十六烯酮。辐照剂量达到7 kGy及以上时,裙边中新增加了17-十八炔酸。

经过辐照,肌肉中烷烃类物质含量明显增加,且新增加了十二烷、十三烷、十五烷、环十二烷、环癸烷;裙边中烷烃类物质含量变化不显著。辐照后,裙边和肌肉中均新产生了烯烃类物质,裙边中增加了苯乙烯、环辛四烯、1-十四烯,肌肉中增加了环辛四烯、1-十四烯、1,13-十四二烯、(Z,Z)-十七碳-1,8,11-三烯。辐照后产生了较多烷烃类、烯烃类物质,可能源于脂肪的氧化,因烃类物质阈值较高,对主体风味影响不大,但可能作为醇类物质等的前体进而影响整体风味[13]。

辐照后,裙边和肌肉中的芳香烃类物质含量显著增加,新产生了邻二甲苯、联三甲苯、1,3-二叔丁基苯等物质。含苯环物质一般呈不良气味,可能是辐照异味产生的原因之一,这与徐远芳等[15]对中华鳖预制菜挥发性风味成分的分析结果一致。

2.4 不同辐照剂量中华鳖裙边和肌肉的关键挥发性成分分析

已检出挥发性物质对整体风味的影响,需要综合其种类、含量和阈值来确定,常用OAV值来评估各化合物对总体风味的贡献程度,OAV值越大对总体风味贡献越大,起主要作用的物质称为关键挥发性成分。

由表4可知,辐照前,中华鳖裙边中有10种物质的OAV大于1,包括2种醇类物质,7种醛类物质和1种酮类物质。其中,壬醛、癸醛、辛醛、苯乙醛、香叶基丙酮、β-环柠檬醛、十一醛等7种物质OAV较大,为中华鳖裙边的关键挥发性成分,决定了其具有油脂气味、鱼腥味,带有清香的整体风味。这与徐远芳等[15]文献中壬醛、癸醛、辛醛、苯甲醛、苯乙醛、(E,E)-2,4-癸二烯醛等物质对中华鳖风味贡献较大,裙边主要挥发性物质[2]为乙酸乙酯、壬醛、2,4-癸二烯醛和辛醛的结果有所差异,说明壬醛、辛醛等物质为中华鳖共有的主要风味物质,其余物质可能为不同产地中华鳖的特征性风味物质。经辐照后,具油脂味的癸醛被脱除,具有油腻味、鱼腥味的壬醛和辛醛OAV不同程度降低,具有清香的香叶基丙酮、β-环柠檬醛、十一醛经过辐照处理,OAV也降低了。同时注意到,辐照剂量达到9 kGy时,新增了具有脂肪气味、鱼腥味的(E,E)-2,4-癸二烯醛、(E)-2-壬烯醛和己醛,构成了中华鳖裙边辐照异味的主体特征。

表4 不同辐照剂量中华鳖裙边挥发性风味物质的的阈值及OAVTable 4 Threshold and OAV of volatile flavor compounds identified from Trionyx sinensis calipash irradiated with different doses

由表5可知,未经辐照的中华鳖肌肉中有7种物质的OAV大于1,包括1种醇类物质,5种醛类物质和1种酮类物质。其中壬醛、辛醛、己醛、β-环柠檬醛、香叶基丙酮等5种物质OAV较大,为中华鳖肌肉的关键挥发性成分,使其主要呈鱼腥味、脂肪味,略带清香。文献[2]中指出乙酸乙酯、2,3-丁二酮和2,3-戊二酮等物质对中华鳖肌肉风味贡献较大,与本文结果不同,可能由饲养条件、水体环境差异等因素造成。经辐照处理,具鱼腥味、油腻味的壬醛和辛醛OAV随辐照强度的不同发生改变,均在3 kGy时降至最低值。具清香气息的β-环柠檬醛在3 kGy及以上时被脱除。辐照剂量达7 kGy及以上时新出现了具蜡香、清香的(E)-2-十二烯醛和十一醛。

表5 不同辐照剂量中华鳖肌肉挥发性风味物质的的阈值及OAVTable 5 Threshold and OAV of volatile flavor compounds identified from Trionyx sinensis meat irradiated with different doses

综合表4和表5可知,辐照剂量在3 kGy左右时,典型水产品腥味物质壬醛、辛醛、癸醛等OAV降至较低,辐照剂量提高到7 kGy及以上时,新增了具脂肪气味、蜡香味等辐照异味,且辐照异味主要由中华鳖裙边产生。可见辐照剂量控制在一定范围内可改善中华鳖风味,剂量过大反而不利于产品风味。杨文鸽等[13]研究发现低于5 kGy 剂量辐照的美国红鱼肉能较好保持其原有风味,更高辐照剂量会导致异味产生。卢佳芳等[21]研究了不同辐照剂量对花鲈鱼肉风味的影响,发现辐照异味随辐照剂量升高而增强,采用3 kGy 剂量有利于保持花鲈鱼肉的良好嗅感,与本试验结果规律类似。

2.5 基于关键挥发性成分的OPLS-DA分析

对不同辐照剂量中华鳖裙边中的关键挥发性物质进行OPLS-DA分析,结果如图4所示。由图4-a可看出,经OPLS-DA分析大致可分成未辐照处理组、辐照剂量1～7 kGy组、9 kGy处理组三大类,说明辐照可改变裙边挥发性物质特征,剂量在1～7 kGy时挥发性成分较接近,剂量达9 kGy时风味变化明显。这与陈东清等[22]研究发现蒸煮小龙虾经8 kGy以上剂量处理后异味明显增加的结果类似。

a-OPLS-DA得分图;b-OPLS-DA载荷图图4 不同辐照剂量中华鳖裙边的OPLS-DA得分图和载荷图Fig.4 OPLS-DA score scatter plot and loading scatter plot of Trionyx sinensis calipash irradiated with different doses

图4-b显示,未经辐照裙边与癸醛、壬醛、十一醛、α-松油醇、β-环柠檬醛等物质相关性较高,9 kGy处理组裙边与已醛、(E,E)-2,4-癸二烯醛、(E)-2-壬烯醛、(E)-2-十二烯醛等物质相关性较高。模型中变量重要性(variable influence on projection,VIP值)大于1的风味特征标志物共有5种,分别是壬醛、苯甲醛、苯乙烯、苯乙醇和β-环柠檬醛。

对不同辐照剂量中华鳖肌肉中的关键挥发性物质进行OPLS-DA分析,结果如图5所示。由图5-a可看出,经OPLS-DA分析大致可分成0～3 kGy处理组、5～7 kGy处理组和9 kGy处理组三大类,说明1～3 kGy剂量处理组与未辐照处理的肌肉风味特征区别不大,5～7 kGy处理组风味发生了改变,而剂量达9 kGy时风味差异显著。梅卡琳等[23]发现蟹肉经5 kGy及以下辐照剂量处理能较好地保持其嗅感,而7 kGy 以上会产生异味,瞿桂香等[24]研究也发现7 kGy处理小龙虾时产生了辐照味,与本试验结果类似。从图5-b可知,0～3 kGy剂量处理组与苯乙醇和β-环柠檬醛的相关性较高,5～7 kGy处理组与苯甲醛相关性较高,9 kGy处理组与十一醛、已醛、辛醛、壬醛和(E)-2-十二烯醛等物质相关性较高。模型中VIP>1的风味特征标志物共有5种,分别是苯甲醛、(E)-2-十二烯醛、β-环柠檬醛、苯乙醇和壬醛。

a-OPLS-DA得分图;b-OPLS-DA载荷图图5 不同辐照剂量中华鳖肌肉的OPLS-DA得分图和载荷图Fig.5 OPLS-DA score scatter plot and loading scatter plot of Trionyx sinensis meat irradiated with different doses

综合图4和图5可知,辐照对中华鳖裙边和肌肉风味均有影响,其中裙边对辐照处理更敏感,1 kGy处理即可改变裙边特征风味,辐照剂量在3 kGy以下时对肌肉整体风味影响较小。但辐照剂量达9 kGy则对裙边和肌肉风味改变均较明显,产生了以脂肪气味、油腻味、鱼腥味为主要特征的辐照异味。

2.6 不同辐照剂量中华鳖裙边和肌肉挥发性成分聚类分析

根据不同辐照剂量裙边和肌肉的特征挥发物质分别绘制了聚类热图。由图6可知,不同辐照剂量处理的裙边和肌肉风味特征差异明显,裙边中各挥发性物质种类更为丰富。裙边和肌肉未经辐照处理和辐照剂量9 kGy处理组中,辛醛、壬醛、已醛、(E)-2-十

a-中华鳖裙边;b-中华鳖肌肉图6 不同辐照剂量中华鳖裙边和肌肉特征挥发性物质聚类热图Fig.6 Clustering heatmap of characteristic volatile organic compounds of Trionyx sinensis calipash and meat irradiated with different doses

二烯醛等不良风味物质较多,辐照剂量在1～7 kGy时,可有效减少部分油腻味、腥味物质。选用3 kGy剂量对中华鳖进行辐照处理,能较大程度减少不愉快风味物质,同时较好地保留其良好风味。

3 结论

采用HS-SPME-GC-MS技术分别分析了不同辐照剂量对中华鳖裙边和肌肉风味的影响,在裙边中检出了38种挥发性物质,包括醇类7种,醛类12种,酮类4种,烷烃类4种,酸类1种,芳香烃类3种,烯烃类3种,酯类4种。其中壬醛、癸醛、辛醛、苯乙醛、香叶基丙酮、β-环柠檬醛、十一醛等7种物质OAV值较大,为裙边的关键挥发性成分,构成了其油脂气味、鱼腥味,带有清香的风味特征。肌肉中检出了27种挥发性物质,醇类2种,醛类8种,酮类3种,烷烃类7种,芳香烃类2种,烯烃类4种,酯类1种。壬醛、辛醛、己醛、β-环柠檬醛、香叶基丙酮等5种物质OAV值较大,为肌肉的关键挥发性成分,使其主要呈鱼腥味、脂肪味,略带清香。

适当辐照剂量(3 kGy左右)处理后,裙边和肌肉中的腥味物质壬醛、辛醛、癸醛等OAV值降至较低,对整体风味有改善作用,当辐照剂量提高至7 kGy及以上时,会产生具有脂肪气味、蜡味的(E,E)-2,4-癸二烯醛、(E)-2-壬烯醛、(E)-2-十二烯醛等异味物质。经OPLS-DA在裙边中筛选到壬醛、苯甲醛、苯乙烯、苯乙醇和β-环柠檬醛5种风味特征标志物(VIP>1),在肌肉中筛选到的5种风味标志物分别是苯甲醛、(E)-2-十二烯醛、β-环柠檬醛、苯乙醇和壬醛。结合聚类分析看出,辐照能改变中华鳖裙边和肌肉的整体风味,辐照剂量为3 kGy时,裙边和肌肉风味接近未辐照样品,且油脂味、鱼腥味等不愉快风味较少,辐照剂量达7 kGy及以上时,辐照异味较明显。