植物乳杆菌发酵黄精水提液工艺优化及活性物质变化研究

◎ 钟 灿，劳 嘉，周 馨，贺 炜，刘传义，张水寒

（1.湖南省中医药研究院 中药资源研究所，湖南 长沙 410013；2.绿之韵生物工程集团有限公司，湖南 长沙 410329；3.湖南神舟中药饮片有限公司，湖南 张家界 427200）

黄精（Polygonati rhizoma）为百合科黄精属植物滇黄精（Polygonatum kingianumColl.et Hemsl.）、黄精（Polygonatum sibiricumRed.）或多花黄精（Polygonatum cyrtonemaHua）的根茎，是我国传统的药食两用资源。研究发现，黄精中含有多种化学成分，主要包括多糖、甾体皂苷、三萜、生物碱、木脂素、黄酮、植物甾醇及挥发油等，其中多糖和甾体皂苷类成分在黄精中含量较高，为其主要药效成分[1]，具有抗衰老、抗肿瘤、抗炎、降血糖血脂、提高免疫力和抗氧化等功效[2]。目前，市场上黄精的主要产品形式是蒸制之后的黄精饮片[3]或者黄精超微粉，常通过炖煮或冲泡食用，产品形式单一、携带不方便。酵素是以植物和发酵菌共同作用产生的一种新型饮料，受到消费者的青睐[4]，对药食同源药材的发酵也受到越来越多学者的关注。课题组前期基于发酵动力学初步研制了黄精酵素[5]，结果发现添加植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）发酵的黄精酵素口感较好，有浓郁的黄精气味。

益生菌具有抑制肠道病原菌、降血脂、降血糖等功效[6]，被广泛应用于发酵产品。近年来，越来越多的中草药通过发酵方式提高其主要活性物质的含量[7]。植物乳杆菌是人体的益生菌，拥有大量的碳水化合物水解酶和糖基转移酶等酶系[8]，能起到改善食品风味、改变食品成分等作用，但其生长受到温度、pH 值和营养成分等多种外在因素的影响[9]。黄精由于其功效和口感佳有学者对黄精发酵工艺进行研究[10]，金剑等[11]从鲜黄精发酵体系中分离获得了植物乳杆菌；WANG等[12]发现与厌氧条件下相比，有氧条件下发酵液中氨基酸等化合物的含量显著上升。然而在黑暗静止的条件下，用单一植物乳杆菌发酵蒸制黄精水提液的工艺鲜见报道。

本研究利用植物乳杆菌发酵蒸制黄精水提液，以乳酸菌菌落数和液体pH 值动态变化确定植物乳杆菌发酵黄精的适宜天数，并以温度、起始pH 值和蔗糖添加量为主要影响因素确定最佳发酵工艺，并研究黄精发酵液中活性物质的变化情况，为黄精酵素的开发提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

蒸制黄精，安化县嘉沃种养专业合作社；黄精水提液，实验室自制；冻干型植物乳杆菌粉，山东中科嘉亿生物工程有限公司；无菌水，实验室自制；氢氧化钠，湖南汇虹试剂有限公司；苯酚，天津市恒兴化学试剂制造有限公司；浓硫酸，湖南汇虹试剂有限公司；葡萄糖，国药集团化学试剂有限公司；无水碳酸钠，上海精析化工科技有限公司；福林酚，上海联迈生物工程有限公司。

1.2 植物乳杆菌发酵液的制备

①黄精水提液制备。蒸制黄精按照1 ∶10 倍水浸泡2 h，微沸提取2 h，用200 目过滤布过滤，高温高压灭菌后备用。②植物乳杆菌黄精发酵液制备。每100 mL 黄精水提液添加植物乳杆菌粉0.10 g，置于适宜温度下，避光发酵。

1.3 实验方法

1.3.1 发酵时间对黄精发酵液中菌落数和pH 值的影响

将植物乳杆菌黄精混合液置于31 ℃下避光发酵，分别于0 d、1 d、2 d、3 d、4 d、5 d、6 d 和7 d 采集样品检测其植物乳杆菌菌落数、pH 值的变化情况，确定黄精水提液中植物乳杆菌的生长对数期。

1.3.2 初始pH 值对黄精发酵液中菌落数和pH 值的影响

在考察发酵天数的基础上，分别用NaOH 和HCl 将植物乳杆菌黄精混合液初始pH 值调为4、5、6、7 和8，在温度为31 ℃、蔗糖浓度为30 g·L-1条件下发酵，考察黄精水提液初始pH 值对植物乳杆菌菌落生长的影响。

1.3.3 发酵温度对黄精发酵液中菌落数和pH 值的影响

在考察发酵天数的基础上，将植物乳杆菌黄精混合液分别置于19 ℃、25 ℃、31 ℃、37 ℃和43 ℃下发酵，发酵液起始pH 值为7.0，蔗糖浓度为30 g·L-1，考察温度对植物乳杆菌菌落生长的影响。

1.3.4 蔗糖浓度对黄精发酵液中菌落数和pH 值的影响

在考察发酵天数的基础上，在植物乳杆菌黄精混合液中分别添加30 g·L-1和60 g·L-1蔗糖，以不添加任何碳源的植物乳杆菌黄精混合液作为对照，发酵液起始pH 值为7.0，发酵温度为31 ℃，考察碳源对植物乳杆菌菌落生长的影响。

1.4 测定项目

1.4.1 植物乳杆菌生长的测定

采用平板稀释法测定样品中活菌落数。

1.4.2 pH 值测定

采用PHS-3E 酸度计对发酵液进行pH 值测定，pH 计校准后用蒸馏水冲洗电极，将电极放入待测的发酵原液中，待屏幕上显示的pH 值稳定后，记录pH 值。

1.4.3 多酚的测定

采用福林酚比色法测定样品中的多酚含量，标准曲线为y=126.88x+0.038，式中y为吸光度，x为没食子酸含量（mg），根据取样体积数计算溶液中多酚浓度。

1.4.4 总酸含量的测定

参照《食品安全国家标准 食品中总酸的测定》（GB 12456ü 2021），采用酸碱滴定法测定样品溶液中的总酸，以乳酸计。

1.4.5 总多糖含量的测定

采用苯酚-硫酸法测定液体中的总多糖，标准曲线为y=10.64x+0.133 3，其中y为吸光度，x为多糖的含量（mg），根据取样体积数计算溶液中的多糖浓度。

1.4.6 抗氧化活性测定

FRAP 法：取0.2 mL 样品加2.8 mL 预热至37 ℃的FRAP 试剂，反应30 min 后在595 nm 波长处测其吸光度，以无水乙醇作为空白对照，测其吸光度，计算每毫升样品的trolox 当量。

1.5 数据处理

每个样品平行测定3 次，采用Excel 进行差异显著性（P＜0.01）分析，使用OriginPro 9.1 软件作图。

2 结果与分析

2.1 植物乳杆菌发酵黄精提取液发酵时间的考察

将黄精提取液灭菌后，在无菌条件下用无菌NaOH 溶液将初始pH 值调至7 左右，加入植物乳杆菌菌液让其起始菌落数在7 lgCFU·mL-1左右，每隔24 h 采集样品对其pH 值和菌落数进行检测。由图1可知，随着发酵的进行，发酵液pH 值持续下降，其中第1 天到第2 天降幅最大，从6.82f 0.07 直接降到了5.03f 0.06，第2 天以后pH 值降幅比较缓慢，特别是第5 天到第7 天变化幅度仅为0.04。植物乳杆菌菌落则随着发酵的进行，菌落数先增加后下降，在第2 天达到最大值（9.86f 0.24）lgCFU·mL-1，第3 天和第4 天植物乳杆菌数量急剧下降，到第6 天菌落数与起始菌落数接近，第7 天菌落数降至初始菌落数以下。第7 天以后发酵液pH 值和菌落数基本无变化。因此从菌落生长情况来看，第2 天是黄精水提液中乳酸菌生长的对数期，因此选择第2 天考察其他单因素对黄精水提取液中植物乳杆菌生长的影响。

图1 植物乳杆菌发酵黄精提取液发酵天数的确定图

2.2 起始pH 值对黄精发酵液中菌落数和pH 值的影响

起始pH 值为7 时菌落数最高达（9.86f 0.11）lgCFU·mL-1，起始pH 值为4 时菌落数最低仅为（8.58f 0.07）lgCFU·mL-1。随着发酵的进行，pH 值变化则与黄精水提液的起始pH 值有一定的相关性，发现起始pH 值越高，发酵液第2 天的pH 值越高，但是起始pH 值为4～7 时，发酵液第2 天的pH 值差异不大（图2）。从黄精水提液乳酸菌的生长情况来看，起始pH 值为7 时更适合乳酸菌的生长。

图2 起始pH 值对发酵液中植物乳杆菌菌落数和pH 值的影响图

2.3 发酵温度对黄精发酵液中菌落数和pH 值的影响

温度是影响植物乳杆菌生长的关键因素之一，将加入植物乳杆菌的黄精提取液置于不同温度条件下，考察温度对其发酵过程菌落数和pH 值的影响。结果发现，31 ℃条件下植物乳杆菌菌落数最高为（9.99f 0.15）lgCFU·mL-1，其次是37 ℃菌落数 为（9.82f 0.12）lgCFU·mL-1，25 ℃是 菌落数 为（9.70f 0.10）lgCFU·mL-1，43 ℃高温不适合乳酸菌的生长。发酵液pH 值在31 ℃时下降最多，25 ℃、31 ℃和37 ℃下发酵液中pH 值基本一致，19 ℃和43 ℃时下降较少，说明19 ℃和43 ℃条件下乳酸菌生长不旺盛，产酸能力明显不如其他温度条件下（图3）。因此，31 ℃适合黄精水提液中乳酸菌的生长。

图3 发酵温度对发酵液中植物乳杆菌菌落数和pH 值的影响图

2.4 蔗糖浓度对黄精发酵液中菌落数和pH 值的影响

蔗糖是为植物乳杆菌提供生长所需的碳源。结果发现，蔗糖能明显提高发酵液中植物乳杆菌的菌落 数，添 加30 g·L-1和60 g·L-1蔗糖的情况下菌落数在发酵第2 d 分别为（9.94f 0.12）lgCFU·mL-1和（9.81f 0.16）lgCFU·mL-1，没有添加蔗糖的对照组中发酵液中菌落数为（8.93f 0.06）lgCFU·mL-1。蔗糖浓度越高，黄精发酵液pH 值下降越快，但添加30 g·L-1和60 g·L-1蔗糖菌落数并无明显差异（图4）。因此黄精水提液中蔗糖浓度为30 g·L-1时比较适合乳酸菌的生长。

图4 蔗糖浓度对发酵液中植物乳杆菌菌落数和pH 值的影响图

2.5 最佳发酵条件下黄精酵素活性物质检测

在上述实验基础上，以植物乳杆菌生长量最高的水平为发酵黄精提取液的最佳工艺条件，即起始pH值为7，发酵温度为31 ℃，蔗糖浓度为30 g·L-1。在此发酵条件下进行3 次平行试验，以黄精水提取液作为对照样品。由图5 可知，黄精提取液和发酵液中的多酚含量差异不大，分别为（0.60f 0.082 0）mg·mL-1和（0.68f 0.036 5）mg·mL-1。发酵液中多糖含量为（57.33f 1.199 0）mg·mL-1，是水提液（47.07f 1.681 6）mg·mL-1的1.22倍。发酵液中总酸含量为（2.31f 0.187 4）mg·mL-1，是水提液（1.13f 0.371 7）mg·mL-1的2.04 倍。

图5 黄精提取液和发酵液中多酚（A）、多糖（B）和总酸（C）含量测定以及抗氧化活性研究（D）图

通过差异显著分析发现，与水提取液相比，发酵液中多酚含量变化不显著，而多糖和总酸含量显著提高。且经过植物乳杆菌发酵后黄精酵素中的FRAP 抗氧化活性为（7.04f 0.265 1）mg·Trolox·mL-1，而黄精水提液FRAP 抗氧化活性为（4.61f 0.304 4）mg·Trolox·mL-1，发酵后黄精酵素抗氧活性显著提高，是黄精水提液的1.53 倍。

3 结论与讨论

本研究以蒸制黄精水提液为原料，以单一的植物乳杆菌作为发酵菌在静止黑暗条件下发酵，分别基于温度、起始pH 值和蔗糖添加量等探索植物乳杆菌发酵黄精水提液的最佳工艺，并研究其活性成分的变化。结果发现，黄精水提液添加30 g·L-1的蔗糖，发酵温度31 ℃，起始pH 值为7.0 较适合植物乳杆菌生长。在此发酵条件下，黄精提取液和发酵液中的多酚含量差异不大，但发酵液中多糖含量为水提液的1.22 倍，总酸含量为水提液的2.04 倍。由此可知，发酵过程能显著提高黄精酵素中多糖和总酸的含量，这可能是黄精酵素酸甜口感的来源。不仅如此，对比黄精水提液和发酵液的抗氧化活性发现，发酵液的抗氧化活性是黄精水提液的1.53 倍，发酵后抗氧化活性明显提高，诸多研究表明植物乳杆菌发酵其他药材其抗氧化能力随着发酵过程而逐渐增加[13-14]。这为黄精新型的开发和产业链的延伸提供了基础。