赖氨酰内切酶在大肠杆菌中的重组表达、复性及纯化

朱 奕， 徐名强， 任燕娜， 蔡孟浩

（华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室 上海 200237）

赖氨酰内切酶 (Lysyl endopeptidase, Lys-C，EC 3.4.21.50) 是一种胰凝乳蛋白酶型丝氨酸蛋白酶，能特异性切割赖氨酸羧基侧的肽键，最早于无色杆菌属 (Achromobacter) 中分离获得[1]，后续研究发现溶杆菌属 (Lysobacter)和铜绿假单胞菌属 (Pseudomonas)也能生产该酶[2-3]。Lys-C 与胰蛋白酶、羧肽酶B 等常规蛋白酶相比，具有更高的特异性和酶切效率，已广泛应用于胰岛素药物生产、蛋白质组学研究和多肽序列分析等领域[4-6]。产酶溶杆菌(Lysobacter enzymogenes) 来源的Lys-C 的理化性质和酶切活性与无色杆菌几乎相同，但产量高许多，因此产酶溶杆菌成为国外企业生产Lys-C 的主要菌株[7]。

来源于产酶溶杆菌的Lys-C 包括671 个氨基酸(Amino acids，aa)，由信号肽 (20 aa)、前导肽 (184 aa)、成熟肽 (269 aa) 和延伸肽 (198 aa) 4 个结构域组成[8]。晶体结构研究显示Lys-C 的多处Lys 残基暴露在溶剂中，容易被自身识别并切割，产生自降解现象，而利用甲苯磺酰-L-赖氨酸-氯甲烷盐酸盐（TLCK）、苯甲基磺酰氟（PMSF）、磷酸盐缓冲液（PBS）等可以抑制Lys-C 的自降解[9-11]。Lys-C 具有3 对二硫键(Cys6-Cys216，Cys12-Cys80，Cys36-Cys58)，其中二硫键Cys6-Cys216被认为与碱性pH 具有稳定性相关[7,12]，其最适反应温度为45 ℃，pH 适应范围较宽，在pH 为8～10 时均具有高活性[7,13]。

Lys-C 的底物结合位点称为S1 口袋 (S1 pocket)，其底物结合特异性由S1 口袋的特殊结构和Asp225位点共同决定[14-15]。狭窄细长的S1 口袋只能容纳线性侧链，只有Lys 残基和精氨酸（Arg）残基的侧链长度能抵达S1 口袋底部。而Arg 侧链的胍基与Asp225 存在空间位阻效应，限制了Arg 与S1 口袋的结合，因此Lys-C 只对Lys 侧链进行高特异性酶切。Lys-C 具有高特异性和高酶切效率的优势，简化了多酶酶切流程，已成为生产研究中不可或缺的一类酶。

目前，Lys-C 的获取主要依靠进口，日本的Wako公司、美国的Sigma-Aldrich 公司等的商用Lys-C 产品普遍采用从天然菌株Lysobacter enzymogenes中提取的低效工艺。天然菌株表达Lys-C 的最高产量仅5.6 mg/L[16]，较低的产量和繁琐的提取工艺导致大规模工业生产面临诸多挑战。随着基因工程和基因编辑技术的快速发展，优异底盘宿主的开发为蛋白表达提供了更多调控模式和表达平台。其中，大肠杆菌Escherichia coli(E.coli) 表达系统具有易于高密度发酵、遗传操作体系成熟、商业化表达载体选择多样等诸多优势，为制备Lys-C 提供了可行的候选路径，有望解决天然菌株生产Lys-C 的诸多难点。此外，蛋白的正确折叠是限制蛋白生产的关键因素，而已有研究证实前导肽在成熟肽的复性过程中扮演分子伴侣的角色，能够降低蛋白折叠过程的活化能，并提高从中间状态到天然状态的转化速率，辅助成熟肽折叠为具有活性构象的蛋白[17-19]。

本文以大肠杆菌为宿主细胞表达了来源于Lysobacter enzymogenes的Lys-C 成熟肽序列，并在其N 端和C 端分别融合一段人工前肽MGSK 和6×His 标签。其中，人工前肽能降低Lys-C 对宿主细胞的毒性，起到稳定表达的作用，而6×His 标签便于后续纯化。同时，本研究也进行了前导肽 (N-terminal pre-pro peptide，pre-N-pro) 的重组表达及其复性辅助作用分析。另外，本研究进行了3 L 反应器的发酵工艺优化，并开发了针对Lys-C 和pre-N-pro 包涵体(Inclusion bodies，IBs) 的新型复性和蛋白纯化工艺，获得了高产量、高纯度的重组Lys-C，一定程度上推动了Lys-C 的工业化生产进程，为异源重组表达Lys-C 奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和质粒 大肠杆菌JM109(DE3)感受态和Top 10 感受态购自唯地生物公司。质粒pET-28a购自Invitrogen 公司。所用引物通过软件Snapgene设计 (表1)，引物合成和DNA 测序由擎科生物公司和华大基因公司完成。

1.1.2 试剂和培养基 植物蛋白胨和酵母粉购自Oxoid 公司。NaCl、甘油、氨水（均为分析纯）等发酵试剂购自国药集团化学试剂有限公司。DNA 限制性内切酶、质粒小提试剂盒、无缝克隆试剂盒等分子学试剂购自Takara 公司和天根生化科技公司。Tris、EDTA、尿素等试剂购自生工生物工程公司。SDSPAGE、Weatern-blot、蛋白浓度检测等相关试剂分别购自碧云天生物技术公司、翊圣生物技术公司和Sigma-Aldrich公司。IPTG（异丙基硫代半乳糖苷）购自Amresco 公司。 Ni Bestarose Fast Flow 填料、Bestdex G25 填料和Bestcryl S-100 填料均购自博格隆生物技术公司。三肽底物Bz-Lys-pNA 购自南京肽业公司。门冬胰岛素前体发酵液由华润昂德生物药业公司提供。

种子培养基：2×YT 培养基 (植物蛋白胨16 g/L、酵母粉10 g/L、NaCl 5 g/L)；反应器发酵培养基：低碳源YT-M9 培养基 (植物蛋白胨16 g/L、酵母粉10 g/L、甘油5 g/L、NaCl 1 g/L、(NH4)2SO46 g/L、MgSO4·7H2O 2 g/L、KH2PO43 g/L、Na2HPO4·12H2O 8.2 g/L、0.03%Antifoam 204、φ=0.1%微量元素)；反应器补料培养基(植物蛋白胨20 g/L、酵母粉12 g/L、甘油500 g/L、MgSO4·7H2O 5 g/L)。

1.1.3 缓冲液的配制 缓冲液 1：50 mmol/L Tris-HCl、50 mmol/L NaCl、5 mmol/L EDTA、5%（体积分数，下同）甘油，pH 8；裂解缓冲液：缓冲液 1、0.5%（体积分数，下同）Triton X-100，pH 8；洗涤缓冲液1：缓冲液 1、1.5 mol/L 尿素、0.5% Triton X-100，pH 8；洗涤缓冲液2：缓冲液 1、2 mol/L 尿素、0.5% Triton X-100，pH 8；洗涤缓冲液3：PBS，pH 7.5；变性缓冲液：50 mmol/L Tris-HCl、 300 mmol/L NaCl、 5 mmol/L EDTA、8 mol/L 尿素、20 mmol/L DTT（二硫苏糖醇），pH 8；复性缓冲液：50 mmol/L Tris-HCl、5 mmol/L GSH（谷胱甘肽）、0.5 mmol/L GSSG（氧化谷胱甘肽）、1.5 mol/L 尿素、1 mmol/L EDTA、5%甘油，pH 8.5；透析缓冲液：50 mmol/L Tris-HCl、5 mmol/L GSH、0.5 mmol/L GSSG、4 mol/L（或2、1 mol/L）尿素、1 mmol/L EDTA、5%甘油，pH 8.5；G25 平衡液：50 mmol/L Tris-HCl、 300 mmol/L NaCl、 5 mmol/L EDTA、8 mol/L 尿素，pH 3.5；镍柱亲和平衡液：50 mmol/L NaH2PO4、500 mmol/L NaCl、30 mmol/L咪唑、5%甘油，pH 8；镍柱亲和洗脱液：50 mmol/L NaH2PO4、500 mmol/L NaCl、300 mmol/L 咪唑、5%甘油，pH 8；超滤脱盐缓冲液和S-100 平衡液：50 mmol/L Tris-HCl，pH 8。

1.2 方法

1.2.1 重组菌株的构建 本研究中Lys-C (UniProt ID: Q7M135) 和pre-N-pro (GenBank ID：D23664) 来源于菌株L.enzymogenesATCC 27796，并由金唯智生物科技公司合成大肠杆菌密码子优化的基因序列，提供质粒pUC57-LysC 和pUC57-pNp。以质粒pET-28a 为模板，T7lacO-F/T7lacO-R 为上下游引物，经PCR扩增得到载体片段；分别以质粒pUC57-LysC和pUC57-pNp 为模板，T7lacOLysC-F/T7lacOLysC-R 和28aarmpNp-F/pNp28ahisarm-R 为上下游引物，经 PCR扩增得到带有同源臂的目的基因。根据试剂盒说明书将目的基因片段和线性化载体相连，并转化至大肠杆菌Top 10 感受态。以菌液为模板，V28aUPF/VT7DO-R 和V28aUP-F/V28aDO-R 为上下游引物进行PCR 验证，得到质粒pET28a-LysC 和pET28apreNpro，将质粒分别转化至大肠杆菌JM109(DE3)感受态。

1.2.2 生物反应器发酵 从冻存管中取50 μL 菌液，接种于3 mL 含卡那霉素的LB（Luria-Bertani）培养基，置于37 ℃摇床过夜培养。然后，以体积分数1%接种量接至80 mL 2×YT 培养基进行种子培养，置于37 ℃摇床培养至OD600约为1.5～2。然后，以体积分数4%接种量接入反应器中。反应器的工作体积为2 L，接种前加入50 mL MgSO4溶液 (单独灭菌)和2 mL 微量元素，发酵培养温度和pH 分别为37 ℃和7。分批阶段通过DO-搅拌联动将溶解氧 (DO) 浓度维持在30%～40%，最大搅拌速度为1 000 r/min。发酵培养约5 h 后，DO 和pH 急速上升，以25 mL/h 的补料速率流加补料培养基。当OD600约为15～20 时，将发酵温度降为30 ℃，转速降为650 r/min，补料速度降为20 mL/h，并添加终浓度为0.5 mmol/L 的IPTG 诱导蛋白表达。诱导8 h 后结束高密度发酵培养，离心 (7 000g、4 ℃、15 min) 后收集菌体，保存于-20 ℃备用。

1.2.3 菌体的裂解和包涵体处理 每1 g 菌体添加到10 mL 裂解液中重悬，并使用高压匀浆机在80 MPa的高压下连续裂解菌体3～5 次。离心 (10 000g、4 ℃、20 min)，并收集Lys-C 粗包涵体。然后分别以20 mL/g 的洗涤缓冲液1、洗涤缓冲液2 和洗涤缓冲液3 重悬包涵体3 次，室温搅拌1 h，离心 (10 000g、4 ℃、20 min)，并回收Lys-C 包涵体。然后使用30 mL/g的变性缓冲液溶解Lys-C 包涵体，室温轻柔摇动4 h。然后，通过超速离心 (25 000g、4 ℃、30 min) 去除沉淀，并使用0.22 μm 滤膜过滤上清液得到Lys-C 变性液。将pre-N-pro 经过相同处理后得到pre-Npro 变性液。

1.2.4 Lys-C 的复性和纯化 将Lys-C 变性液上样至预平衡的Sephadex G25 层析柱 (BXK 26/40，柱高30 cm)，流速设置为5 mL/min。用G25 平衡液在1 倍柱体积 (CV) 内进行洗脱，随后用不含DTT 的变性缓冲液将洗脱液的蛋白质量浓度稀释至1 mg/mL 以下，以脉冲 (加30 min，停30 min)的方式搅拌加入复性缓冲液（变性液与复性缓冲液体积比为1∶15）中，4～8℃复性36 h。

将pre-N-pro 变性液加入透析袋，并在透析缓冲液中搅拌复性，分别以4、2、1 mol/L 的梯度依次降低尿素浓度，每隔10 h 换一次透析缓冲液。复性完成后将pre-N-pro 复性液加入Lys-C 复性液中，辅助Lys-C 正确折叠。

将复性完成的Lys-C 复性液使用切向流过滤(Tangential flow filtration，TFF) 系统进行浓缩。首先，将膜包 (10 kDa 孔径，PES(聚醚砜)膜) 安装在夹具上，用大量纯水冲洗膜包组件和硅胶管，直至透过液的pH 为7.0。以20～25 mL/min 的过滤速度对Lys-C 复性液进行浓缩。将得到的Lys-C 复性浓缩液上样至预平衡的Ni NTA-Sepharose 层析柱 (BXK 16/20，柱高10 cm)，流速设置为1 mL/min。随后用镍柱亲和平衡液洗涤10 CV（柱体积），并用5 CV 镍柱亲和洗脱液进行一步洗脱，根据紫外吸收峰收集Lys-C 纯化样品。将Lys-C 纯化样品加入超滤管 (10 kDa，15 mL)中，离心 (4 000g、4℃、30 min) 浓缩至1 mL 后，继续添加超滤脱盐缓冲液至15 mL，重复操作2～3 次。将Lys-C 浓缩液直接上样至预平衡的Sephacryl S-100 层析柱 (BXK 16/40，柱高33 cm)，流速设置为2 mL/min。随后用S-100 平衡液洗脱，连续收集每个洗脱组分 (2 mL)，洗脱完成后层析柱可继续上样。最后对不同组分进行SDS-PAGE 电泳，将高纯度Lys-C 的组分进行合并，最终获得重组Lys-C 样品。

1.2.5 蛋白浓度和纯度的测定 使用Bradford 法测定蛋白浓度，检测595 nm 处的吸光度值，并根据标准曲线 (y=0.86x+1.35，R2=0.99) 计算样品的总蛋白浓度。SDS-PAGE 电泳结束后，将蛋白电泳胶进行考马斯亮蓝染色、脱色和扫描拍照，利用软件Gel-Pro analyzer 分析不同泳道的目标条带灰度值，测定目标蛋白的相对含量或纯度。蛋白回收率为纯化后目标蛋白量和纯化前目标蛋白量的比值。

1.2.6 Lys-C 的酶活检测方法

(1) 酶切三肽底物活性检测。配制酶切反应体系，包括0.2 mol/L AMP（2-氨基-2-甲基-1-丙醇）缓冲液(A)、2.5 mmol/L 底物 (Bz-Lys-pNA) 溶液 (B)、0.1 mol/L Tris-HCl (C)、Lys-C 样品溶液 (D)和φ=45%乙酸终止液 (E)，具体步骤如下：1) 向多个微量离心管中加入200 μL 试剂A 和20 μL 试剂B；2) 将微量离心管放入30 ℃水浴锅中预热5 min；3) 向对照组中加入10 μL 试剂C，向样品组中加入10 μL 试剂D，迅速吹打混匀；4) 放入30 ℃水浴锅中反应30 min；5) 分别向样品组和对照组中加入70 μL 试剂E 终止反应。将酶切反应液加到微孔板中，以空白对照作为零点，检测405 nm 处的吸光度值。根据以下公式计算酶活（E），其中a为样品的吸光度值，b为空白对照的吸光度值，c为样品稀释倍数。

(2) 酶切胰岛素前体活性检测。在胰岛素前体发酵液中加Tris 至终浓度为20 mmol/L，并调节pH至9～10。然后按Lys-C 与胰岛素前体质量比为1∶200 加Lys-C 样品，混匀后30 ℃下酶切18～22 h，并加入φ=45%乙酸终止反应，经过超纯水稀释后使用HPLC 检测产物。HPLC检测方法：使用C18色谱柱 (250 mm×4.6 mm×5 μm)，柱温为40 ℃，波长为214 nm，流速为1 mL/min，进样量为10 μL。流动相A：3%（质量分数）硫酸钠缓冲液+10%（体积分数）乙腈，流动相B：50%（体积分数）乙腈，洗脱程序液相组成及时间见表2（40 min 时停止）。酶切转化率（X）如下：

式中：SA、SB、SC分别为产物峰、未酶切前体峰、中间产物峰的峰面积。

2 实验结果

2.1 Lys-C 与pre-N-pro 表达菌株的构建

在质粒构建时，Lys-C 和pre-N-pro 的开放阅读框分别包含280 aa 和211 aa，经大肠杆菌密码子优化后，在Lys-C 序列的N 端和C 端分别插入一段人工前肽MGSK 和6×His 标签，以及在pre-N-pro 序列的C 端插入6×His 标签 (图1)。通过PCR 扩增分别得到长度为5 217 bp 的载体片段，以及长度为872 bp的Lys-C 片段和长度为651 bp 的pre-N-pro 片段，然后分别与载体片段连接后得到质粒pET28a-LysC 和pET28a-preNpro (图2(a)和2(b))。通过菌落PCR 验证，阳性转化子扩增出长度分别为1 296 bp 和1 381 bp的DNA 片段，与理论相符 (图2(c)和2(d))。将阳性转化子进行测序比对得到正确的质粒，并转化至大肠杆菌 JM109(DE3)感受态， 获得重组菌株JM109DE3_PT7-LysC 和JM109DE3_PT7-preNpro。

图2 质粒pET28a-LysC 和pET28a-preNpro 的构建与验证Fig.2 Construction and verification of the plasmids pET28a-LysC and pET28a-preNpro

2.2 生产Lys-C 与pre-N-pro 的大肠杆菌高密度发酵

重组菌株JM109DE3_PT7-LysC 和JM109DE3_PT7-preNpro 经过15 h 的高密度发酵，在菌体的OD600值分别为53 和65 时结束培养，可收集获得湿重为65 g/L 和73 g/L的菌体 (图3(a))。Lys-C 和pre-N-pro均以包涵体形式表达，经高压匀浆裂解后，收集得到约12 g/L 粗包涵体。用含低浓度尿素和Triton X-100 的洗涤缓冲液多次洗涤后，去除杂蛋白和细胞碎片，回收得到约4～6 g/L 包涵体。由结果可知，随着诱导时间增加，蛋白表达量逐渐增加。而诱导培养8 h后，蛋白表达量最高，重组菌株JM109DE3_PT7-LysC和JM109DE3_PT7-preNpro 的目标蛋白表达量分别可达菌体总蛋白量的60%和19% (图3(b))。最终，Lys-C 和pre-N-pro表达量分别为2.4 g/L 和0.9 g/L。

图3 Lys-C 和pre-N-pro 的诱导表达Fig.3 Inducible expression of the Lys-C and pre-N-pro

2.3 Lys-C 包涵体的复性和纯化分析

在包涵体裂解过程中，DTT 常用做二硫键的还原剂，在变性缓冲液中添加DTT 可提高包涵体蛋白的溶解效果。但是DTT 的存在直接影响Lys-C 的复性率：一方面会抑制Cys 残基重新形成二硫键，使得部分Lys-C 仍以变性状态存在；另一方面，会造成Lys-C 中二硫键的错配。本研究通过在复性缓冲液中添加GSH 和GSSG，能一定程度上降低二硫键的错配率，比色法测得Lys-C 复性后的酶活从0.4 U/L提升至0.6 U/L，但复性率仍较低。因此，有必要去除Lys-C 变性液中的DTT，再进行复性操作。本研究采用凝胶过滤层析 (Gel filtration chromatography,GFC) 的方法脱除变性液中的DTT，Lys-C 变性液流经Sephadex G25 层析柱后，蛋白样品先从虚线标记的峰1 流出，DTT 等小分子杂质从峰2 后流出，得到了较好的分离效果 (图4(a))。经凝胶过滤层析后，Lys-C 变性液稀释了近1 倍，DTT 吸收峰处 (Lane 3)无Lys-C 流出 (图4(b))，蛋白回收率可达85.9%。经Sephadex G25 层析柱脱除DTT 后，Lys-C 复性后的酶活提升至3.0 U/L。为进一步提高Lys-C 的酶活，复性缓冲液中除了含有低浓度尿素和甘油这种常规化学添加剂外，还加入了发挥分子伴侣和蛋白聚集抑制剂功能的前导肽pre-N-pro。当复性缓冲液中添加10 mg/L pre-N-pro 时，Lys-C 酶活提升至4.8 U/L。当进一步添加80 mg/L pre-N-pro 时，Lys-C 酶活达到13.8 U/L (图4(c))，是未添加Pre-N-Pro 时酶活的4.8 倍。结果表明，在Lys-C 复性时添加前导肽能显著提升其酶活，但是继续增加pre-N-pro 的添加量，Lys-C 复性液中出现了蛋白沉淀，高浓度的pre-Npro 降低了Lys-C 的复性率，从而导致Lys-C 酶活呈下降趋势。因此，复性缓冲液中pre-N-pro 的最佳添加量为40～80 mg/L。

图4 Lys-C 的复性Fig.4 Refolding of Lys-C

经过上述复性操作后，得到的复性液体系被稀释15 倍。而大体积、低浓度的蛋白溶液纯化时间过长，容易导致目标蛋白降解和流穿，影响纯化效果。因此，本研究采用TFF 系统对Lys-C 复性液进行了浓缩，流穿样 (Lane 3) 中几乎检测不到Lys-C，蛋白回收率可达78.2% (图4(d))。

本文通过Ni NTA-Sepharose 亲和层析 (Nickel column affinity chromatography, NCAC) 对浓缩后的Lys-C 复性液进行纯化，纯化结果见表3 和图5。如图5(a)所示，与复性浓缩样 (Lane 1) 相比，洗脱样(Lane 2) 中除了分子量为28 kDa的Lys-C 条带，还存在几条低分子量的杂条带，而对亲和层析后的样品进行超滤浓缩 (Ultrafiltration, UF) 后，得到的超滤样(Lane 3) 中杂条带更为明显，可能是Lys-C 纯化过程中存在自降解现象。为去除超滤样品中小分子量的降解蛋白，本研究选择Sephacryl S-100 层析进行蛋白的进一步纯化。如图5(b)所示，虚线标记的蛋白主峰为Lys-C 的吸收峰，蛋白回收率可达84.8%。最终，经多步纯化后可获得95%纯度的重组Lys-C 样品 (Lane 4)，其终产量为48 mg/L。

图5 Lys-C 的纯化Fig.5 Purification of Lys-C

表3 Lys-C 各步纯化结果Table 3 Lys-C purification results of each step

2.4 重组Lys-C 的活性分析

本研究通过酶切三肽和胰岛素前体两种底物对重组Lys-C 的活性进行分析。首先取1 mL 重组Lys-C 样品 (约1 mg)，稀释20 倍后，使用比色法测得酶切三肽底物的比酶活为10.2 U/mg，与商用标品具有相近的酶切活性，纯化倍数可达118 倍。另一方面，为进一步验证重组Lys-C 样品的酶切活性，取1 mL重组Lys-C 样品对30 mL 胰岛素前体 (7 mg/mL) 进行酶切，分别在反应0、0.5、4、8 h 和18 h 时取样。随着酶切时间的延长，依次出现了中间产物1、中间产物2 和目标产物，存在明显的酶切先后顺序(图6)。当酶切4 h 时，胰岛素前体绝大部分已转化为中间产物，但未酶切出目标产物，结果表明第1 个酶切位点容易被Lys-C 切开，而第2 个和第3 个酶切位点则较难被切开，酶切速率相对变慢。经18 h 酶切后，重组Lys-C 样品几乎能将所有的胰岛素前体转化为目标产物，酶切转化率可达93.5%。

图6 Lys-C 酶切胰岛素前体的HPLC 图谱Fig.6 HPLC chromatograms of the insulin precursor digested by recombinant Lys-C

3 讨 论

本研究探索出了可行的Lys-C 包涵体复性和纯化工艺流程，步骤分别为：(1) 高压匀浆裂解菌体；(2) 多次洗涤包涵体；(3) 8 mol/L 尿素溶解包涵体；(4) Sephadex G25 层析；(5) 添加40～80 mg/L pre-Npro，4～8 ℃复性36 h；(6) TFF 浓缩；(7) NTA-Sepharose层析；(8) 超滤；(9) Sephacryl S-100 层析。最终，纯化获得的重组Lys-C 样品具有较高的酶切活性，且产量高于目前文献报道水平 (表4)。

表4 大肠杆菌重组表达Lys-C 的产量结果Table 4 Yield analysis of recombinant expression of Lys-C in E.coli

对于枯草杆菌蛋白酶、α-裂解蛋白酶等蛋白酶，前导肽可作为分子伴侣在体内或体外的蛋白折叠中具有重要功能[19,23]。这种与分子伴侣有相似性质的前导肽称为分子内分子伴侣 (Intramolecular chaperone，IMC)，而位于成熟肽N 端的IMC 主要促进三级结构的形成，在体外以游离肽的形式辅助成熟肽重折叠。受此启发，本研究在复性液体系中除加入氧化还原对和化学添加剂外，尝试添加前导肽pre-Npro。pre-N-pro 的添加在缩短复性时间的同时显著提高了Lys-C 的复性率。相较不添加pre-N-pro，Lys-C 酶活提高到4.8 倍。这证明了pre-N-pro对于Lys-C 的正确重折叠确实具有辅助作用，为解决其他蛋白复性率低的问题提供了重要思路。此外，复性后的Lys-C 对pre-N-pro 具有切割活性，大部分的pre-Npro 会发生降解，无需额外的纯化步骤，这简化了Lys-C 蛋白的后续纯化工艺。

本研究发现高活性的Lys-C 容易发生自降解现象，文献报道Lys-C 容易在以下几个位点发生剪切：Lys48/Lys49 (5 kDa 或22 kDa)、Lys203 (6 kDa)、Lys30-Lys155 (13 kDa) 和Lys30-Lys203 (18 kDa)[24]。为了抑制Lys-C 的自降解现象，本研究尝试在复性和纯化过程中添加EDTA 和磷酸盐缓冲液，然而未能达到较好的抑制效果。因此，为了提高Lys-C 的活性收率，后续研究中，我们将对Lys-C 的纯化条件进一步优化，尝试在低温、高盐或酸性溶剂环境下进行柱层析[22]。另外，研究表明对Lys 残基进行化学修饰或定点诱变，或有助于从根源上解决Lys-C 自降解问题[25]。

综上，本研究最终获得了具有较高产量和活性的重组Lys-C，并能有效完成三肽底物及胰岛素前体的准确酶切，取得了Lys-C 工业化生产的阶段性成果，整体策略也为其他包涵体蛋白的复性和纯化提供了重要思路。在未来的研究中，可探索Lys-C 应用于酶切具有技术功能特性的定制化蛋白水解物，或开发更先进的Lys-C 多酶组合酶切方法，进一步扩大其应用价值。