结直肠癌基因甲基化检测的应用价值与临床评价建议

刘茉莉 王辉 季芳 刘美林 何静云

1 国家药品监督管理局医疗器械技术审评检查大湾区分中心 （广东 深圳 518000）

2 国家药品监督管理局医疗器械技术审评中心 （北京 100081）

内容提要： 结直肠癌早期诊断能够有效提升患者的生存率，结直肠镜检查结合病理活检作为结直肠癌确诊的金标准，其有创检测的特性存在一定的局限性，因此建立一种无创的早期诊断方法具有一定的临床使用价值，是对传统检测方法的有效补充。文章重点关注结直肠癌基因甲基化试剂盒在结直肠癌检测中的应用，结合在体外诊断试剂注册审评工作中的经验，对相关产品临床性能评价给出建议。

我国结直肠癌发病率高，晚期结直肠癌病死率高，严重危害人民健康。2020年中国癌症统计报告显示：我国结直肠癌发病率、病死率在全部恶性肿瘤中分别位居第2及第5位，多数患者在确诊时已属于中晚期[1]。研究表明，对结直肠癌进行早期检测能够有效地预防结直肠癌的发生，以及降低结直肠癌病死率[2]。多数早期结直肠癌可以治愈，5年生存率可以达到90%，而晚期则不足10%[3]。世界主要发达国家均已实施针对全国人口的结直肠肿瘤早诊筛查，将其作为基本公共卫生服务。近年来国家卫健委以结直肠癌等高发癌症筛查和早诊早治为切入点，出台了一系列诊疗规范和方案，推进癌症防控关口前移，促进癌症早预防、早筛查、早发现、早治疗。临床上，通过粪便潜血试验/粪便免疫化学试验分析粪便中的微量血液，被广泛用于结直肠癌的早期筛查，但由于其灵敏性和特异性较低使其受到限制[4]。而结直肠镜检查结合病理活检是临床上公认的用于结直肠癌确诊的金标准，准确度高，但也有其自身的局限性：主要表现在其过程繁琐且耗时，而且作为一种有创的侵入性检查方法，有出血和穿孔的风险，因此患者依从性差，不利于早期诊断[5]。近年来非侵入性的结直肠癌诊断方法发展迅速，该方法主要通过检测粪便或血液标本中与结直肠癌发生相关的生物标志物，对传统检测方法是一种很好的补充手段，尤其针对特定的人群，如对结直肠镜检测依从性比较差的患者。

1.结直肠癌生物标志物的发现

癌症生物标志物可以定义为在体液或组织中发现的一种客观可测量的生物分子，例如蛋白质、代谢物、RNA、DNA或表观遗传改变，它们提示癌症的存在或提供有关癌症预后的信息[6,7]。而异常DNA甲基化作为基于表观遗传的生物标志物，由于其发生在癌症早期，且具有癌症特异性、生物稳定性和在体液或组织检测中的可及性，引起了人们的注意，成为肿瘤早期检测强吸引力的研究目标[7]。

DNA甲基化是指甲基基团在催化作用下被添加至胞嘧啶第5号碳的残基上的修饰过程，目前发现主要存在于基因表达调控元件中的CpG岛，是一种化学修饰[8]。DNA甲基化通过控制基因表达和基因组稳定性来定义细胞类型和谱系，是细胞生长发育过程重要的调控机制。DNA甲基化控制机制的破坏会导致多种疾病的发生，包括癌症。异常的DNA甲基化被认为发生在癌症发展的早期阶段，且特定基因甲基化似乎发生在不同的肿瘤阶段[9]。癌细胞DNA异常甲基化主要表现为全基因组低甲基化和位点特异性高甲基化，因此特定基因位点的甲基化可作为重要的肿瘤早期检测的分子标志物[10,11]。

目前，已经被发现的与结直肠癌高度相关的基因甲基化位点有SDC2、Septin9、BMP3、NDRG4等。SDC2基因编码蛋白可介导结直肠癌细胞的黏附等功能，与结直肠癌细胞增殖密切相关。与正常结直肠组织相比，SDC2基因在不同分期的结直肠癌和部分肠进展期腺瘤组织中呈现高度的甲基化现象[12]。Septin 9（SEPT9）是一种参与胞质分裂和细胞周期控制的基因，研究表明，血清Septin9基因甲基化检测在结直肠癌中有较高的敏感性和特异性，多项荟萃分析提示SEPT9检测可运用于结直肠癌检查中[13,14]。

随着肿瘤液体活检技术的兴起，通过在血液样本中检测循环肿瘤DNA，即可获得患者体内肿瘤的全景数据，全面反映与肿瘤组织相同的突变基因组信息。又因为肠道细胞容易脱落至肠腔，而结直肠肿瘤细胞分裂速度较快且对基底膜黏附性降低，会持续不断地脱落至粪便中，因此通过检测血液样本或粪便样本中DNA甲基化成为结直肠癌主要的无创检测手段。

2.结直肠癌基因甲基化辅助诊断产品国内外现状及临床试验研究建议

随着我国国家药品监督管理局和美国食品药品监督管理局相继批准血浆SEPT9基因甲基化试剂，用于特定人群结直肠癌的辅助诊断，基因甲基化检测产品处于持续的申报过程中。目前获批的与结直肠癌检测相关的甲基化位点主要为SEPT9基因、SDC2基因等，产品多为二者的单靶点检测试剂或多个基因甲基化位点联合检测试剂盒。这一类产品目前在国内按照体外诊断试剂第三类进行管理，其风险收益情况需要严格按照医疗器械临床试验管理规范的要求通过临床试验进行验证。

针对这一类产品在临床试验评价中遇到的问题以及需要实现的目的，本文将从审评的角度提出以下几点建议：

该类产品根据预期用途分为辅助诊断类产品和筛查类产品。对于辅助诊断类产品，预期用途限定为：针对需要但因主观或客观原因不愿或不能进行结肠镜检查患者的结直肠癌辅助诊断，不得用于人群筛查。该类产品临床试验可以针对结直肠癌不同分期患者和非结直肠癌患者进行富集入组，即回顾性入组的方式获得样本，目前已经获批的多个基因甲基化单靶点或多靶点检测试剂即通过这种方式进行临床试验。如已经获批的人类SDC2基因甲基化检测试剂盒（荧光PCR法）即通过回顾性入组的方式纳入有效病例数1213例，其中结直肠癌病例374例，非结直肠癌病例839例；对于筛查类产品，预期用途分为针对平均风险人群（40～74岁，无相关症状，无结直肠癌家族史等高风险因素）的结直肠癌筛查和对结直肠癌高风险的人群（40～74岁，便潜血阳性、问卷风险评估阳性或结直肠癌家族史等）进行“精筛”，筛查阳性者应进行结肠镜检查。且筛查类产品对于产品的性能指标有更高的要求，目前没有单独通过基因甲基化检测获批用于筛查的产品，美国食品药品监督管理局和我国国家药品监督管理局已批准的均为粪便免疫化学试验-DNA联合检测试剂盒。针对该类筛查类产品，则需要对预期的筛查人群进行前瞻性入组，目前已批准的KRAS基因突变及BMP3/NDRG4基因甲基化和大便潜血联合检测试剂盒（PCR荧光探针法-胶体金法）产品，即通过前瞻性随机入组4245例结直肠癌高风险受试者的方式进行临床试验。

对于这两类产品的临床评价指标也不一样。对于辅助诊断类产品，主要通过已上市同类产品或者临床诊断标准进行比对，评价考核试剂的临床灵敏度、特异度或阳性/阴性符合率等评价指标。目前已获批试剂的临床性能，与临床诊断金标准对比，灵敏度达在85%左右，特异度90%以上。而对于筛查类产品，除了评价考核试剂的临床灵敏度和特异度，还应对产品阳性预测值和阴性预测值进行系统性评价。目前已获批的KRAS基因突变及BMP3/NDRG4基因甲基化和大便潜血联合检测试剂盒（PCR荧光探针法-胶体金法）针对高风险结直肠癌患者筛查的灵敏度达到90%以上，对进展期腺瘤患者筛查灵敏度超过60%；结直肠癌筛查阴性预测值达到99.6%。较以往粪便/血浆DNA分子检测产品灵敏度有显著提高，特别是针对进展期腺瘤的检出率显著提高。

对于基因甲基化检测试剂盒，在进行临床试验时，应重点考虑选择新基因位点的临床意义，应有充分的证据证明该基因位点与结直肠癌发生发展具有直接的关系，对于多靶点联合检测的产品，应充分论证多靶点组合的临床意义，对于其阳性判断值的设置应科学合理。而为了充分评价产品性能，应纳入所有分期及病理分型的结直肠癌样本，特别是应纳入进展期腺瘤和早期结直肠癌患者样本，以验证基因甲基化试剂盒对结直肠癌早期诊断的临床性能。同时，为了评估产品的特异性，还应纳入一定例数的消化道肿瘤患者样本（如胃癌、食管癌、肝癌、胆管癌、胰腺癌等），非消化道肿瘤患者样本以及临床常见的消化道良性疾病（如结直肠腺瘤、结直肠息肉、结直肠炎症、痔疮等），应考虑不同癌种对试剂盒检测性能的干扰。样本例数的估算应参考体外诊断试剂临床试验指导的要求，建议通过单组目标值法进行估算。该类产品作为一类比较新的产品，临床意义还需通过临床试验进行验证，因此，临床试验分为两部分，一部分验证产品的临床意义，即判断产品检测结果与疾病状态的关系；一部分验证试剂盒检测生物标志物的准确性。对于第一部分，推荐使用临床诊断金标准，即结直肠镜和病理诊断方法作为对比方法；对于第二部分，则推荐使用已上市产品或者实验室参考方法如sanger测序等对不同的基因位点进行同源样本的准确性验证，对于已有同类产品上市的，也可直接与同类产品进行比较。对于新验证的基因甲基化位点，建议补充考核试剂对结直肠癌患者手术前后的样本进行连续检测的结果，以验证该基因位点与疾病状态的直接关系。如已经获批的人类SDC2基因甲基化检测试剂盒（荧光PCR法）即对40例结直肠癌切除根治术前、后的受试者进行了短期随访。使用考核试剂对符合短期随访要求的受试者粪便样本进行检测，检测结果显示39例检测阳性全为术前与病理结果相符，术后阴性与结直肠癌手术后的结果相符。

3.小结

尽管基因甲基化检测具有无创检测的优点，但由于通过无创方法获取体液和粪便中脱落细胞的DNA样本量往往含量比较低，分离纯化存在一定的难度，且正常细胞来源的DNA还会对检测结果造成干扰，因此该方法检测的灵敏度可能不太高，同时相关基因甲基化在结直肠癌发生发展中的机制尚未十分明确，需要补充短期或长期随访数据及其他临床证据以验证该基因甲基化与结直肠癌的关系。因此该类产品有其限定的预期用途，并不适用于愿意并能够接受结直肠癌相关诊疗指南推荐的常规筛查试验如结直肠镜检测或组织病理活检的患者。如美国食品药品监督管理局批准的Epi proColon®，该产品用于检测来自患者全血标本的乙二胺四乙酸血浆中甲基化Septin 9 DNA，明确该产品也不适用于有结直肠息肉、结直肠癌或相关癌症、炎症性肠病、慢性溃疡性结肠炎、克罗恩病、家族性腺瘤性息肉病病史的结直肠癌高风险患者。高危人群还包括有结直肠癌家族史的人，特别是有两个或两个以上的一级亲属患有结直肠癌，或一个或多个未满50岁的一级亲属患有结直肠癌等。因此，在开发这类产品时，相关企业应明确产品的临床定位，从而根据产品的临床定位针对性地开展临床试验。