熟地黄微生物限度检查方法适用性研究

叶宝玉 莫小丹 李 蔚 刘俊文

中药饮片微生物限度检查法系2020 年版《中华人民共和国药典》通则1108 新增[1-2]，该方法可用于检查中药材、中药饮片微生物污染情况[3]。熟地黄性微温，味甘，可补益肝肾，滋阴养血，是治疗痹证的经典药物[4]，药用历史久远，是我国广泛使用的养生保健、防病治病的中药材。熟地黄富含氨基酸、糖类、地黄素、梓醇等多种微量元素，具有提高机体免疫力、抗氧化、抗衰老、促进造血等作用[5-6]。也有相关研究显示其具有抑制氧化应激、细胞凋亡的特性[7-9]。现代药理研究表明，熟地黄的主要作用成分为天然大分子化合物熟地黄多糖，其在调节内分泌系统、治疗心血管疾病、降血糖、提高免疫力、抗炎、镇咳、抗真菌等方面具有良好的效果[10]。本研究旨在通过对熟地黄微生物限度方法适用性研究，并建立相应的微生物限度检查方法，防止因检验方法的不科学造成错检或误判[11-12]，确保有关熟地黄饮片药物生物安全性评价的可靠性。

1 仪器与样品

1.1 仪器

电子天平 MP500B（1/100，上海恒平科学仪器有限公司），高压灭菌器 GF88DX（致微厦门仪器有限公司），SW-CJ 系列洁净工作台SW-CJ-2FD（苏州安泰空气技术有限公司），生化培养箱HPX-Ⅱ-250（上海跃进医疗器械有限公司），霉菌培养箱HMJ-Ⅲ-250（上海跃进医疗器械有限公司），电热恒温培养箱DHP-9082B（上海一恒温培养箱），移液器（Thermo Scientific）。

1.2 菌种

金黄色葡萄球菌[CMCC（B）26003]、铜绿假单胞菌[CMCC（B）10104]、大肠埃希菌[CMCC（B）44102]、乙型副伤寒沙门氏菌[CMCC（B）50094]、枯草芽孢杆菌[CMCC（B）63501]、白色念珠菌[CMCC（F）98001]、黑曲霉[CMCC（F）98003]均由广东环凯微生物科技有限公司提供。本实验用的菌种均为第三代工作菌株。

1.3 培养基

胰酪大豆胨琼脂培养基（TSA）（批号200909），沙氏葡萄糖琼脂培养基（SDA）（批号191112），pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液（稀释液）（批号220113），胰酪大豆胨液体培养基（批号210617），麦康凯液体培养基（批号200308），麦康凯琼脂培养基（批号200815），RV 沙门菌增菌液体培养基（批号200116），木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基（批号200904），肠道菌增菌液体培养基（批号191231），紫红胆盐葡萄糖琼脂培养基（批号211125），均购自北京陆桥技术股份有限公司。

1.4 样品

熟地黄，购自江西樟树成方中药饮片有限公司，批号20120101。

2 方法与结果

2.1 菌液的制备

根据2020 版《中华人民共和国药典》四部通则1105 及1006 要求，将各试验菌制成菌悬液，浓度在50～100 cfu/ml。

2.2 供试液的制备

称取75 g 熟地黄，利用GF88DX 高压灭菌器进行常规灭菌处理，其中用于沙门菌检查的20 g 熟地黄未做灭菌处理。

取已灭菌处理的熟地黄25 g，加稀释液至250 ml，充分振摇15 min，制成1∶10 供试液。取1∶10 供试液20 ml，置于沸水浴30 min，立即冷却，制成1∶10 耐热菌检查供试液。

取已灭菌处理的熟地黄25 g，加稀释液至500 ml，充分振摇15 min，制成1∶20 供试液。取1∶20 供试液20 ml，置于沸水浴30 min，立即冷却，制成1∶20 耐热菌检查供试液。

取1∶10 供试液20 ml，加稀释液至100 ml，混匀，制成1∶50 供试液。取1∶50 供试液20 ml，置于沸水浴30 min，立即冷却，制成1∶50 耐热菌检查供试液。

2.3 微生物计数方法适用性试验

2.3.1 第一次微生物计数方法适用性试验

2.3.1.1 需氧菌总数试验试验组：取9.9 ml 的1∶10 的供试液各5 份，分别加入5 种试验菌0.1 ml 混匀，取1 ml 注入培养皿中，分别倾注TSA，平行制备2 皿。供试品对照组：取1∶10 供试液，用稀释液代替菌液，其他试验操作同试验组。菌液对照组：取9.9 ml 的稀释液5 份，分别加入0.1 ml 各菌液，其他试验操作同试验组。

2.3.1.2 霉菌和酵母菌总数试验取9.9 ml 的1∶10的供试液各5 份，分别加入白色念珠菌、黑曲霉菌液0.1 ml 混匀，取1 ml 注入培养皿中倾注SDA，其他操作同需氧菌总数试验。

2.3.1.3 耐热菌总数试验分别取5 支1∶10 耐热菌检查供试液9.9 ml，其他操作同需氧菌总数试验。

依据《中华人民共和国药典》2020 版四部准则1108，回收率（%）=（试验组菌落数-供试品对照组菌落数）/菌液对照组菌落数×100%，平皿倾注法中所有试验菌的回收率应在50%～200%。由表1 可知，枯草芽孢杆菌的回收率小于50%，不符合标准要求，故常规法供试液（1∶10）不适用于检测熟地黄中需氧菌、耐热菌总数。霉菌和酵母菌所对应的两种试验菌回收率在59%～113%，符合《中华人民共和国药典》2020 版四部要求。

表1 1∶10 供试液组的需氧菌总数、酵母菌总数方法适用性试验结果

2.3.2 第二次微生物计数方法适用性试验需氧菌总数试验：取5 份9.9 ml 的1∶20 供试液于试管中，其他操作同2.3.1 需氧菌总数试验。耐热菌总数试验：分别取1∶20 耐热菌总数检查供试液9.9 ml，装于5支试管中，其他操作与需氧菌总数试验相同。由表2可知枯草芽孢杆菌的回收率均小于50%，不符合《中华人民共和国药典》2020 版四部的标准要求，说明熟地黄对枯草芽孢杆菌具有一定抑制作用，因此将供试品进一步稀释，进行回收率试验。

表2 1∶20 供试液组的方法适用性试验结果(需氧菌/耐热菌)

2.3.3 第三次微生物计数方法适用性试验需氧菌总数试验：取9.9 ml 的1∶50 供试液5 份，其他操作同2.3.1 需氧菌总数试验。耐热菌总数试验：分别取1∶50 耐热菌总数检查供试液9.9 ml，装于5 支试管中，其他操作与需氧菌总数试验相同。5 种计数菌的回收率均在50%～200%范围内，符合《中华人民共和国药典》2020 版四部要求，即采用该方法进行需氧菌总数试验。见表3。

表3 1∶50 供试液组的方法适用性试验结果(需氧菌/耐热菌)

2.4 控制菌方法适用性试验

2.4.1 试验组大肠埃希菌：取1∶10 供试液10 ml，大肠埃希菌液1 ml 加入100 ml TSB，充分摇匀，30～35 ℃培养24 h。取1 ml 上述培养物接种在麦康凯液体培养基培养后划线接种于麦康凯琼脂培养基平板，观察与记录指示结果并进行鉴定。

沙门菌：取制备好的供试品10 g，沙门菌液1 ml加入100 ml TSB 混匀，30～35 ℃培养24 h。取0.1 ml上述培养物，加入9.9 ml 的RV 沙门增菌液体培养基中培养后接种划线于木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基平板，观察与记录指示结果并进行鉴定。

耐胆盐革兰阴性菌：取在23 ℃培养2 h 的1∶10 供试液20 ml，用TSB 稀释成1∶100 和1∶1 000供试液。取培养2 h 后的1∶10 供试液1 ml 两份，接种于两管10 ml 肠道菌增菌液体培养基中，分别加入大肠埃希菌液（不大于100 cfu/ml）和铜绿假单胞菌液（不大于100 cfu/ml）。取1∶100 和1∶1 000供试液同法操作。将以上6 支试管在33 ℃下培养48 h，划线于紫红胆盐葡萄糖琼脂培养基平板上，33 ℃培养24 h，查看平板是否有菌落生长并进行鉴定。

2.4.2 对照组供试品对照组以稀释液代替菌液，其他操作与2.4.1 试验组相同。阴性对照组以10 ml稀释液代替供试品，不加菌液，其他操作与2.4.1 试验组相同。阳性对照组不加入供试品，其他操作与2.4.1 试验组相同。

2.4.3 试验结果试验组、阳性对照组的指示结果为菌生长且鉴定为大肠埃希菌，而供试品对照组、阴性对照组指示结果无菌生长。见表4。

表4 大肠埃希菌试验结果

试验组、阳性对照组的指示结果为菌生长且鉴定为有沙门菌，而供试品对照组、阴性对照组指示结果无菌生长。见表5。

表5 沙门菌试验结果

熟地黄耐胆盐革兰阴性菌检查试验中EE 体积为10 ml，3 个样品试验组的3 个稀释级（1∶10、1∶100、1∶1 000）均有菌生长，且鉴定为大肠埃希菌和铜绿假单胞菌。供试品对照组、阴性对照组均无菌生长，结果表明熟地黄耐胆盐革兰阴性菌的检查可采用直接接种法。见表6。

表6 耐胆盐革兰阴性菌试验结果

3 讨论

中药饮片是中药材通过炮制加工而成的，可直接用于中医临床的产品，是初级加工产物，也是一类特殊的药品，其微生物限度检查方法是标准制定过程中的重要环节。不同厂家同品种的中药饮片由于生产工艺的不同，其抑菌活性也会有差别，生产企业和监管单位应根据实际情况对微生物限度检验方法进行相应调整[10-11]，以提高检验方法的可靠性。

本研究中发现采用常规法1∶10、1∶20 供试液对熟地黄饮片进行微生物限度检查适用性试验，枯草芽孢杆菌的回收率小于50%，不符合药典要求，说明熟地黄对枯草芽孢杆菌具有一定抑制作用。为降低供试液单位体积抑菌成分浓度，达到消除干扰的目的，最终采用溶液稀释法将熟地黄进行1∶50稀释后进行供试品需氧菌总数检查，常规法进行霉菌和酵母菌总数试验，直接接种法开展控制菌试验，大肠埃希菌和沙门菌均为试验组和阳性对照组存在有关菌落生长，供试品对照组和阴性对照组不存在有关菌落生长，说明该控制菌检查方法适用于熟地黄饮片，保证了对熟地黄中药产品的客观评价。