沸石咪唑酯骨架ZIF-8修饰整体柱制备及在线检测软骨藻酸应用

陈清爱, 李 珏, 林旭聪, 3

(1. 福建商学院 旅游与休闲管理学院, 福建 福州 350012; 2. 福州大学 化学学院, 福建 福州 350108;3. 福建省产品质量和食品安全检测试剂与仪器工程技术研究中心, 福建 福州 350108)

在丰富的氨基酸、 不饱和脂肪酸等,因此在贝类毒素分析中需要对分析样品进行高效的预处理。在DA毒素的分析中,现有前处理技术主要包括快速、 简易、 廉价、 高效、 安全的样品前处理技术QuEChERS[3]、 固相萃取[4]、 磁性固相萃取[5]等。整体柱型管内固相微萃取(In-tube SPME)技术[6]具有自动化、 小型化和高通量等优点,作为一种新兴的在线前处理技术得到了重视。Song等[7-8]合成了一种磁增强管内微萃取整体柱,与高效液相色谱(HPLC)-紫外光谱(UV)联用实现了对有机铅、有机锡等污染物的灵敏检测。上述研究为In-tube SPME技术应用于DA毒素污染物的在线富集和分析提供了良好支撑,然而普通的整体柱存在的比表面积小(18.4～4.36 m2/g)[9]、 作用位点少的问题,导致整体柱对目标物的吸附作用弱, 不利于DA在柱内的在线富集。 为了解决这个问题, 许多的功能材料可被用于改善色谱固定相的比表面。 其中, 金属有机骨架(MOF)多孔结晶材料具有可调节的孔径、 高度有序的骨架拓扑结构和较大的比表面积, 越来越多地被用于改善色谱固定相的性能[10]。 目前, MOF与整体柱的结合主要是通过将MOF颗粒掺入整体柱的预聚液中, 通过一锅法将MOF颗粒嵌入整体聚合材料[11-12], 但是导致MOF在整体柱中分布不均匀、 MOF被严重包埋等缺陷[13]。迄今, 在整体柱内原位生长MOF的报道甚少,基于MOF修饰的整体柱对DA进行高效在线富集研究仍未见报道。

沸石咪唑酯骨架ZIF-8具有结构稳定、 比表面积大的优点[14],可以极大地改善整体柱聚合相表面吸附性能,并且ZIF-8结构中丰富的Zn2+离子可以与DA毒素中羧基(—COOH)和仲氨基(—NH—)发生有效的配位作用而实现高效吸附[15]。本文基于整体柱柱后衍生引入咪唑基团、 ZIF-8原位生长技术[16], 在多面体低聚倍半硅氧烷(POSS-MA)和甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA)共聚物表面包覆ZIF-8, 制备ZIF-8修饰整体柱, 并以此构建一种基于ZIF-8高比表面吸附和Zn2+配位作用的DA毒素在线In-tube SPME新技术,发挥MOF表面吸附和金属配位作用的协同应用,实现DA在ZIF-8功能化整体柱上的高效在线富集。本文中对整体柱结构和性能进行表征,考察整体柱的选择性,优化实验条件对DA富集的影响,结合高效液相色谱-二极管阵列检测技术(HPLC-PDA),实现贝类产品中DA的在线管内微萃取和灵敏分析。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器设备

1.1.1 试剂

甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA)[纯度97%(质量分数,下同)]、 多面体低聚倍半硅氧烷(POSS-MA)(纯度98%)、 γ-甲基丙烯酰氧丙基三甲氧基硅(γ-MAPS)(纯度98%)、 环己醇、 十二醇(纯度98%)均购自默克Sigma Aldrich公司; 偶氮二异丁腈(AIBN)(分析纯)、 六水合硝酸锌(纯度95%)、 2-甲基咪唑、 1-(3-氨基丙基)咪唑(纯度99%)均购自Aladdin公司; 软骨藻酸(纯度98%)购自Across公司; 所用二次水均为科尔顿超纯水系统处理水。

1.1.2 仪器设备

EasySep-1020LC型液相色谱泵, 美国通微技术股份有限公司; PHS-3C型精密酸度计, 上海大普仪器有限公司; DKB-501A型超级恒温水槽, 上海精宏实验设备有限公司; LC-20A型高效液相色谱仪,日本岛津公司; XL30型扫描电子显微镜, 赛默飞世尔科技有限公司; Nicolet 6700型傅里叶变换红外光谱仪, 美国Nicolet公司; D8 ADVANCE A25型X射线衍射仪,德国布鲁克公司。

1.2 整体柱制备和在线富集检测

ZIF-8修饰整体柱的制备过程及对DA的在线富集检测流程如图1所示。

1.2.1 整体柱基质的制备

将质量分数分别为17.5%、 12.5%的GMA单体、 POSS-MA单体溶解于由质量分数分别为30%、 40%的环己醇、 十二醇混合而成的溶剂中,混合均匀,加入单体和致孔剂总质量1%的引发剂AIBN,将所得的混合液涡旋混匀、 脱气,配成聚合液。将预聚液使用容积1 mL注射器缓缓注入烯基衍生的石英毛细管中,密封两端,平放置于60 ℃水浴中聚合反应20 h,制得整体柱基质。使用液相色谱泵通入甲醇,洗去前体、 致孔剂以及低聚物残留,备用。

1.2.2 ZIF-8修饰整体柱的制备

将1-(3-氨基丙基)咪唑的浓度为1 mol/L的甲醇溶液注入20 μL定量环中,体积流量为1 μL/min,通过液相色谱泵将1-(3-氨基丙基)咪唑的甲醇溶液推入装有整体柱基质的石英毛细管中,直到pH试纸变蓝后继续通10 min。将两端密封,置于65 ℃水浴反应12 h。反应完成后采用液相色谱泵通入甲醇将1-(3-氨基丙基)咪唑衍生的整体柱清洗至流出液呈中性,保存。

(a)ZIF-8修饰整体柱的制备

(b)在线管内富集-高效液相色谱(HPLC)分析流程

将硝酸锌的浓度为20 mmol/L的甲醇溶液注入定量环中,以6.5 mPa的压力将溶液推入1-(3-氨基丙基)咪唑衍生的整体柱中反应30 min;将浓度为20 mmol/L的2-甲基咪唑通入Zn2+衍生的整体柱,反应形成ZIF-8,完成一次生长。将整体柱清洗5 min后循环重复若干次上述反应,在整体柱内原位生长ZIF-8。

1.2.3 在线富集检测方法

ZIF-8修饰整体柱对DA的在线富集检测过程包括柱上富集吸附、洗脱和检测。

1)柱上富集吸附。 将含有DA的样品注射入2 mL样品环, 采用计量泵将定量环中样品溶液注入所制备的ZIF-8修饰整体柱中, 进行In-tube SPME富集。

2)洗脱。向整体柱内继续通入三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)缓冲液,清洗背景物质和未结合的DA分子;切换流动相,选择浓度为10 mmol/L、 pH为6.5的磷酸盐缓冲液为洗脱液[15], 通入整体柱中, 洗脱DA, 所得洗脱液通入HPLC系统六通阀的采样管, 收集洗脱液20 μL。

3)HPLC检测。切换六通阀到注射状态,使样品注入HPLC中进行检测。检测条件如下:色谱柱为C18色谱柱(填料粒径为5 μm,内径为4.6 mm,长度为250 mm), 流动相为乙酸与乙腈体积比为83∶17的水溶液, 测定波长为242 nm,体积流量为1.0 mL/min,进样体积为20 μL。

1.2.4 贝类样品的准备

取新鲜的花蛤、 贻贝贝肉,剪碎后匀质。称取1.00 g匀浆贝肉样品放置于容积10 mL离心管内,加入2 mL提取液(甲醇与水的体积比为4∶6),涡旋混匀 2 min,以转速10 000 r/min离心分离5 min,取上清液。残渣采用1 mL提取液重复提取2次,合并上清液,混匀,离心分离;上清液用 0.22 μm滤膜过滤,置于4 ℃避光环境保存。

加标样品: 取1.00 g匀浆贝肉品样置于离心管中,加入不同质量的DA,振荡混匀。后续提取、 离心、 过滤等操作同上。

2 结果与讨论

2.1 整体柱制备与表征

2.1.1 结构表征

聚合单体中GMA和POSS-MA用量、致孔剂中环己醇和十二醇的比例对整体柱基质结构的影响如表1所示。结果表明,随着POSS-MA用量的增加,ZIF-8修饰整体柱渗透性减弱,整体柱结构变得致密;随着致孔剂中十二醇用量的增加,整体柱渗透性增强。配方3所制备的整体柱渗透性适中,因此应用于后续研究。图2为制备的ZIF-8修饰整体柱的SEM图像。由图可以看出,整体柱柱内填料与柱壁结合紧密,整体聚合结构较为均匀、 通透。

2.1.2 红外光谱和物相表征

图3为整体柱基质、 ZIF-8、 ZIF-8修饰整体柱的红外光谱和X射线衍射(XRD)谱图。由图3(a)的红外光谱可以看出,相比于整体柱基质,ZIF-8修饰整体柱在波数421 cm-1处出现了明显的Zn—N键的吸收峰以及位于波数1 153、 1 572 cm-1的咪唑基团的吸收峰,这些谱峰与ZIF-8的特征峰一致,表明ZIF-8在整体柱表面进行有效修饰。

表1 整体柱基质的配方及渗透性

图2 沸石咪唑酯骨架ZIF-8修饰整体柱的扫描电子显微镜图像

(a)红外光谱(b)XRD谱图图3 整体柱基质、 沸石咪唑酯骨架ZIF-8、 ZIF-8修饰整体柱的红外光谱和X射线衍射(XRD)谱图

由图3(b)的 XRD谱图可看出,在ZIF-8修饰整体柱中,位于衍射角2θ为7.3°、 10.36°、 12.72°、 14.72°、 16.5°、 18.039°、 22.16°、 24.52°、 24.72°等处的衍射峰对应于ZIF-8的(011)、 (002)、 (112)、 (022)、 (013)、 (222)、 (114)、 (233)、 (134)等晶面的衍射峰,表明ZIF-8在整体柱聚合相中成功合成。

2.1.3 比表面积表征

整体柱基质、 ZIF-8修饰整体柱的氮气吸附-脱附曲线如图4所示。由图可见,ZIF-8修饰整体柱聚合相的基于静态氮气多层吸附的比表面积大幅度增加。整体柱基质的比表面积为25.16 m2/g,整体柱基质表面原位修饰ZIF-8之后,比表面积大幅增长到了230.92 m2/g。整体柱表面被ZIF-8修饰后比表面积的大幅增加,并引入了更多的结合位点,可以有效提高整体柱的吸附性能。

2.2 性能

2.2.1 pH的影响

ZIF-8与DA的结合是通过Zn2+与DA分子中的羧基发生螯合作用产生的。DA分子中存在着3个羧基和1个仲氨基,羧基的解离常数pKa分别为2.10、3.72、 4.97,DA在溶液中的存在形态受溶液pH影响较大,导致DA分子中的羧基质子化,与Zn2+的螯合效率受到影响。

图4 沸石咪唑酯骨架ZIF-8修饰整体柱和整体柱基质的氮气吸附-脱附曲线

pH对ZIF-8修饰整体柱在线富集DA效率的影响如图5所示。可以看出,随着pH由6.0增大到7.0,ZIF-8修饰整体柱在线富集DA的效率逐渐提高,其原因是,随着pH增大,DA分子中羧基的解离程度逐渐增大,而ZIF-8上的Zn2+正电性受影响较小,DA分子中的负电荷羧基与Zn2+结合程度增大。随着pH由7.0增大到8.0,整体柱在线富集DA的效率显著下降,主要原因是ZIF-8上的Zn2+结合OH-,使得整体柱表面的正电性降低,Zn2+与DA分子中羧基结合效率降低,整体柱对DA的回收率随之下降。

图5 pH对沸石咪唑酯骨架ZIF-8修饰整体柱在线富集软骨藻酸效率的影响

2.2.2 流动相流量的影响

流动相流量对ZIF-8修饰整体柱在线富集DA性能的影响如图6所示。通过在定量环前并联反压阀,调整柱前压力为0.5～7.5 mPa,从而调节流动相的流量。随着流动相流量的变化,整体柱对DA的回收率保持在92.4%～95.7%,流动相流量的变化未对整体柱在线吸附DA的效率产生明显影响。

图6 流动相流量对沸石咪唑酯骨架ZIF-8修饰整体柱在线富集软骨藻酸效率的影响

2.2.3 共存金属离子和氨基酸的影响

以色氨酸和金属离子(K+、 Ca2+、 Na+、 Mg2+)为干扰物,将DA和干扰物按质量比为1∶100混合,对DA进行富集洗脱,考察DA回收率来衡量ZIF-8修饰整体柱对DA吸附性能的影响,结果如图7所示。从色氨酸和金属离子作为干扰物时的洗脱液色谱图可以看出,两者中均出现了明显的DA的色谱峰,回收率分别为无干扰物情况下的(93.4±1.5)%和(91.2±1.3)%(重复3次)。由于DA分子中有3个pKa不同的羧基,相比氨基酸,DA与Zn2+有更强的结合能力,因此ZIF-8与DA结合能力比对高浓度色氨酸的强。贝肉样品中常见的碱金属和碱土金属与DA中羧基作用弱,对ZIF-8上Zn2+结合DA的作用不产生干扰。

2.2.4 方法检测限、 稳定性和重现性

采用所制备的ZIF-8修饰整体柱, 对DA进行100倍富集, 联用HPLC-PDA, 对DA标准溶液进行测定, 方法的检测限(LOD)(信噪比(S/N)为3)达到0.03 ng/mL, 定量限(LOQ)(S/N为10)为0.05 ng/mL。 鉴于贝类样品提取液中存在较多的共存物质, 样品处理过程中1.0 g贝肉采用4 mL提取液提取后进行分析, 贝肉样品中DA的检测限分析结果如图8所示。 可以看出, 贝类样品中DA经过100倍富集后的检测限 (S/N=3)为0.3 μg/kg,方法灵敏。

所制备的ZIF-8修饰整体柱在线富集检测DA的稳定性和重现性结果见表2。 ZIF-8修饰整体柱对DA在线富集检测的日内、 日间、 批次间的回收率均在92%以上,3次重复测试的相对标准偏差(RSD)

(a)色氨酸(b)金属离子(c)无干扰物图7 色氨酸、 金属离子为干扰物及无干扰物条件下软骨藻酸(DA)萃取洗脱液色谱图

图8 贝肉样品中软骨藻酸(DA)的检测限

分别为1.2%～1.9%、 1.6%～2.6%、 1.7%～3.2%, 表明整体柱具有良好的重现性。 进一步考察ZIF-8修饰整体柱的稳定性以及使用寿命, 对同一根整体柱进行同上操作, 连续使用30 d后的回收率仍大于86%, ZIF-8键合整体柱具有良好的使用寿命。

2.3 在线检测DA应用

将花蛤和贻贝的贝肉样品分别经ZIF-8修饰整体柱富集、 洗脱, 联用HPLC-PDA进行DA检测(简称本文方法), 结果见表3。 由表可见: 对于未加标的空白样品, 均没有检测到DA的色谱峰; 对不同浓度DA的加标样品, DA的检出信号随着DA浓度的增大而增大, 所制备的ZIF-8修饰整体柱联用HPLC-PDA对样品中的DA有较好的富集和检出能力, 在加标质量浓度为0.4～4.0 μg/kg时, 方法回收率为(91.4±2.4)%～(94.5±1.0)%, 与采用C18填料萃取柱进行固相萃取(SPE)前处理的液相色谱-质谱(LC-MS)方法相比, 两者检测结果基本一致, ZIF-8修饰整体柱联用HPLC-PDA在线富集检测贝肉样品中DA的结果良好。

表2 沸石咪唑酯骨架ZIF-8修饰整体柱在线富集检测软骨藻酸的稳定性和重现性

3 结论

基于整体柱柱后衍生引入咪唑基团、 ZIF-8原位生长技术, 本文中制备了ZIF-8修饰整体柱, 联用HPLC-PDA, 实现了DA的在线富集及灵敏分析。 结果表明, ZIF-8修饰整体柱的比表面积达到230.92 m2/g, DA分子中的羧基与ZIF-8表面的Zn2+发生配位作用, 对DA的在线吸附效果显著,对DA标准溶液的检测限为0.03 ng/mL, 对贝肉提取液的检测限达到0.3 μg/kg, 对DA分析灵敏度高;

表3 贝类样品中软骨藻酸的回收率(重复3次)

对DA在线富集检测的日内、 日间、 批次间的回收率均在92%以上,3次重复检测RSD分别为1.2%～1.9%、 1.6%～2.6%、 1.7%～3.2%,具有良好的稳定性和重现性。应用于花蛤和贻贝样品分析,DA回收率分别达到了(92.4±2.5)%～(94.5±1.0)%、 (91.4±2.4)%～(92.6±1.5)%,结果良好,可为贝类产品中DA毒素在线高效富集和灵敏检测提供了一种新的技术。