基于GAS5/miR-21介导的细胞增殖探讨心康冲剂抗心力衰竭大鼠心肌纤维化的作用机制

刘蓉芳 ，郭冰 ，余意 ，李园 ，王敏

1.暨南大学附属江门市五邑中医院，广东 江门 529000；2.湖南中医药大学研究生院，湖南 长沙 410208

心肌纤维化是心肌结构重塑的重要特征[1]，而心肌成纤维细胞（CFs）异常增殖是心肌纤维化开始和发展的关键步骤。miR-21被认为是许多心脏疾病如慢性心力衰竭（chronic heart failure，CHF）的预测和诊断指标[2]。研究发现，miR-21通过靶向抑制磷酸酶及张力蛋白同源物（PTEN）增强PI3K/Akt通路活性，促进CFs增殖而导致心肌纤维化[3]。生长阻滞特异性转录本5（GAS5）是一种控制细胞增殖和生长的长链非编码RNA，可通过调控miR-21表达使PTEN表达增加[4]，通过抑制周期蛋白D1（CyclinD1）和周期蛋白依赖性激酶4（CDK4）表达抑制细胞增殖[5]。而目前从调控GAS5/miR-21介导细胞增殖角度研究中医药抗心肌纤维化的报道较少。

心康冲剂是全国名老中医毛以林教授治疗CHF的经验方。前期研究发现，心康冲剂可抑制miR-21 表达，通过调控PTEN/Akt通路逆转心肌纤维化[6-7]，但其对GAS5表达及成纤维细胞增殖的调控作用尚不明确。本研究通过观察心康冲剂对CHF 大鼠GAS5、miR21、PTEN基因表达及CFs增殖的影响，进一步探讨其抗心肌纤维化的作用机制。

1 实验材料

1.1 动物

5 周龄SPF 级SD 大鼠46 只，雌雄各半，体质量（170±10）g，湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供，动物生产许可证号SCXK（湘）2019-0004。饲养于湖南中医药大学实验动物中心SPF 级动物房，温度（22±2）℃，相对湿度50%±10%，每日光照12 h，自由摄食饮水，标准饲料喂养。本实验经湖南中医药大学动物伦理委员会审批（LLBH-202105180002）。

1.2 药物及制备

心康冲剂（黄芪30 g，人参10 g，升麻5 g，柴胡5 g，桔梗5 g，茯苓15 g，陈皮10 g，麸炒白术10 g，薏苡仁30 g，砂仁6 g，制附片10 g，桂枝10 g，生姜皮10 g，大腹皮10 g），由湖南中医药大学第二附属医院中药制剂室制成干燥颗粒，10 g颗粒相当于原药材3.38 g。缬沙坦胶囊，北京诺华制药有限公司，批号X2925，80 mg/粒。注射用盐酸阿霉素，深圳万乐药业有限公司，批号2103E3，10 mg/瓶。

1.3 主要试剂及仪器

PTEN、Akt、CyclinD1、CDK4、GAPDH 抗体、HRP标记山羊抗小鼠IgG、HRP标记山羊抗兔IgG，美国Proteintech，货号分别为22034-1-AP、10176-2-AP、26939-1-AP、11026-1-AP、10494-1-AP、SA00001-1、SA00001-2；α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）抗体，美国Boster，货号BM0000；Ⅰ型胶原（ColⅠ）ELISA试剂盒，武汉华美生物工程有限公司，货号CSBE08084r；基质金属蛋白酶9（MMP9）ELISA试剂盒，美国Proteintech，货号KE20006；mRNA反转录试剂盒，北京康为世纪，货号CW2569；miRNA反转录试剂盒，北京康为世纪，货号CW2141。荧光定量PCR仪（美国Thermo，型号PIKOREAL96），-80 ℃冰箱（中国美菱，型号DW-HW438），台式高速冷冻离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司，型号H1650R），台式高速冷冻离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司，型号H1650R），小动物专用彩色多普勒超声仪（飞依诺科技有限公司，型号6LAB），全自动酶标洗板机（深圳市汇松科技发展有限公司，型号PW-812），多功能酶标分析仪（深圳汇松科技发展有限公司，型号MB-530），显微摄像图像分析系统（厦门Motic，型号BA410T）。

2 实验方法

2.1 分组及造模

大鼠适应性饲养1周后，随机取6只作为正常组，余40只行阿霉素腹腔注射造模[8]。将10 mg阿霉素粉针剂溶于生理盐水5 mL，配成浓度为2 mg/mL溶液，按1.5 mg/kg腹腔注射，每周2次，连续7周。正常组注射生理盐水1 mL/kg。末次注射后正常饲养1周，行心脏超声检测，并随机取4只造模大鼠左心室心肌和肺组织行HE、Masson染色。以大鼠出现精神萎靡、体质量增长缓慢、毛发枯黄、腹水等表现，超声心动图示左室短轴缩短率（LVFS）＜30%[9]，HE染色见心肌细胞溶解，Masson染色见大量蓝色胶原纤维[10]，即为造模成功。造模中共8只大鼠死亡，剩余32只成模大鼠按随机数字表法分为模型组12只、心康冲剂组和缬沙坦组各10只。

2.2 给药

参考前期给药剂量[11]，心康冲剂组予心康冲剂0.5 g/kg灌胃，缬沙坦组予缬沙坦30 mg/kg灌胃，正常组、模型组予等体积蒸馏水灌胃，每日1 次，连续4周。

2.3 指标检测

2.3.1 心脏超声检测

大鼠予2.5%异氟烷吸入麻醉，取胸前仰卧位固定，脱毛后涂耦合剂，用小动物专用彩色多普勒超声仪，取大鼠左心室长轴切面行M型超声检测，连续记录10 个心动周期，测量LVFS 和左室射血分数（LVEF）。

2.3.2 ELISA检测

大鼠经腹主动脉采血10 mL，3 500 r/min 离心10 min，取血清，按照试剂盒说明书操作，酶标仪测量各孔光密度（OD值），根据标准曲线计算血清ColⅠ和MMP9含量。

2.3.3 HE染色

剪取大鼠左心室心尖投入液氮冻存。余下左心室投入10%多聚甲醛溶液固定，制作石蜡切片，脱水、苏木精染液染色后自来水冲洗，再经75%盐酸酒精分化、氨水处理、酸化伊红乙醇液染色，梯度脱水，透明，封片，于显微镜下观察心肌组织病理变化。

2.3.4 Masson染色

取左心室组织石蜡切片，脱水，先后用10%重铬酸钾-10%三氯乙酸（1∶1）混合液、0.5%天晴石兰、苏木素溶液染色，自来水冲洗，再以0.5%盐酸酒精分化液分化，复红、脱水、透明、封固，采集5个包含2 mm2心肌面积区域图像，应用IBASⅡ图像分析系统计算胶原容积分数（CVF）。CVF（%）=心肌胶原面积÷所测视野总面积×100%。

2.3.5 免疫荧光染色

左心室组织石蜡切片脱蜡、水化后，浸入EDTA缓冲液（pH=9.0）连续煮24 min后冷却，PBS洗涤，3 min×3次，经漂洗、脱水、苏丹黑染色后封闭1 h，加入α-SMA一抗（1∶100），4 ℃避光孵育过夜，再滴加荧光二抗，DAPI避光染色，甘油封片，避光保存，采用荧光显微镜观察，Image J软件进行定量分析。

2.3.6 qRT-PCR检测

称取500 mg左心室组织样品，剪碎后加入Trizol裂解，根据反转录试剂盒说明书反转录合成cDNA，RT-PCR进行扩增。反应条件：95 ℃、10 min，95 ℃、15 s，60 ℃、30 s，共40个循环。2-ΔΔCt法计算目的基因表达量，引物由上海生工合成，引物序列见表1。

表1 各基因PCR引物序列

2.3.7 Western blot检测

采用RIPA 裂解液提取大鼠左心室组织总蛋白，BCA试剂盒检测蛋白浓度。分别取30 μg蛋白上样，10%SDS-PAGE将蛋白分离，转膜、封闭后，加入一抗：Akt（1∶1 000）、CDK4（1∶1 000）、CyclinD1（1∶500）、PTEN（1∶2 000）、GAPDH（1∶3 000），4 ℃孵育过夜，洗去一抗，加二抗（HRP标记山羊抗小鼠IgG 1∶5 000、HRP 标记山羊抗兔IgG 1∶6 000），孵育，显色、曝光、扫描，以GADPH为内参，分析蛋白相对表达量。

3 统计学方法

采用SPSS20.0 统计软件进行分析。计量资料以±s表示，先进行正态性和方差齐性检验，满足正态性采用方差分析，两两比较方差齐采用LSD检验，方差不齐用Games Howell检验；不满足正态性采用秩和检验。P＜0.05表示差异有统计学意义。

4 结果

正常组大鼠毛色光泽，眼睛有神，反应灵敏，体质量明显增加，饮食及二便正常，无腹水及死亡；模型组大鼠毛发无光泽并脱落，活动迟钝，精神萎靡，喜蜷缩，形体瘦小但严重腹水，生长基本停滞，大便稀，共死亡6只；心康冲剂组和缬沙坦组大鼠毛发较有光泽，动作较灵敏，体质量有一定增加，有轻度腹水，各死亡4只。

4.1 心康冲剂对模型大鼠心功能的影响

与正常组比较，模型组大鼠LVFS、LVEF显著降低（P＜0.05）；与模型组比较，心康冲剂组和缬沙坦组大鼠LVFS、LVEF显著升高（P＜0.05）。见表2。

表2 各组大鼠LVFS、LVEF比较（±s，%）

表2 各组大鼠LVFS、LVEF比较（±s，%）

注：与正常组比较，*P＜0.05；与模型组比较，△P＜0.05

LVEF 97.91±1.53 59.29±4.50*74.35±2.19△74.29±1.97△组别正常组模型组心康冲剂组缬沙坦组只数6 6 6 6 LVFS 75.05±5.54 27.59±2.86*38.30±1.83△38.15±1.64△

4.2 心康冲剂对模型大鼠血清Ⅰ型胶原和基质金属蛋白酶9含量的影响

与正常组比较，模型组大鼠血清ColⅠ和MMP9含量显著增加（P＜0.05）；与模型组比较，心康冲剂组和缬沙坦组大鼠血清ColⅠ和MMP9 含量显著减少（P＜0.05）。见表3。

表3 各组大鼠血清ColⅠ和MMP9含量比较（±s，pg/mL）

表3 各组大鼠血清ColⅠ和MMP9含量比较（±s，pg/mL）

注：与正常组比较，*P＜0.05；与模型组比较，△P＜0.05

MMP9 980.074± 160.395 11 568.363±1 227.633*2 739.909±1 219.731△2 680.185± 716.984△组别正常组模型组心康冲剂组缬沙坦组只数6 6 6 6 ColⅠ802.778± 51.697 6 482.041±325.942*1 020.056±124.152△1 108.723±183.993△

4.3 心康冲剂对模型大鼠左心室病理形态的影响

HE染色显示，正常组大鼠心肌细胞呈红色，细胞核呈蓝色，心肌细胞壁完整，细胞排列整齐；模型组大鼠心肌细胞肿胀变性、胞浆溶解，细胞壁模糊，细胞排列紊乱；心康冲剂组和缬沙坦组大鼠心肌细胞肿胀、胞浆溶解程度相对较轻，部分细胞壁较完整。见图1。

图1 各组大鼠左心室组织形态（HE染色，×400）

Masson染色显示，正常组大鼠肌纤维呈红色，有极少量蓝色胶原纤维；与正常组比较，模型组大鼠可见大量蓝色胶原纤维，夹有红色肌纤维，CVF显著增加（P＜0.05）；与模型组比较，心康冲剂组和缬沙坦组大鼠蓝色胶原纤维相对较少，CVF 显著减少（P＜0.05）。见图2、表4。

表4 各组大鼠左心室CVF比较（±s，%）

表4 各组大鼠左心室CVF比较（±s，%）

注：与正常组比较，*P＜0.05；与模型组比较，△P＜0.05

CVF 4.270±1.074 26.310±4.586*13.603±1.394△14.737±3.756△组别正常组模型组心康冲剂组缬沙坦组只数6 6 6 6

4.4 心康冲剂对模型大鼠左心室α-平滑肌肌动蛋白表达的影响

与正常组比较，模型组大鼠左心室α-SMA表达显著升高（P＜0.05）；与模型组比较，心康冲剂和缬沙坦组大鼠左心室α-SMA 表达显著降低（P＜0.05）。见图3、表5。

图3 各组大鼠左心室α-SMA阳性表达（免疫荧光染色，×400）

表5 各组大鼠左心室α-SMA表达比较（±s）

表5 各组大鼠左心室α-SMA表达比较（±s）

注：与正常组比较，*P＜0.05；与模型组比较，△P＜0.05

α-SMA 3 2 123.000±441.290 3 5 746.000±563.067*3 2 712.667± 88.342△3 2 726.667± 72.459△组别正常组模型组心康冲剂组缬沙坦组只数

4.5 心康冲剂对模型大鼠左心室生长阻滞特异性转录本5、miR-21、磷酸酶及张力蛋白同源物基因表达的影响

与正常组比较，模型组大鼠左心室GAS5、PTEN基因表达显著降低，miR-21表达显著升高（P＜0.05）；与模型组比较，心康冲剂组和缬沙坦组大鼠左心室GAS5、PTEN基因表达显著升高，miR-21表达显著降低（P＜0.05）；与缬沙坦组比较，心康冲剂组GAS5基因表达降低，miR-21表达升高（P＜0.05）。见表6。

表6 各组大鼠左心室GAS5、miR-21、PTEN基因表达比较（±s）

表6 各组大鼠左心室GAS5、miR-21、PTEN基因表达比较（±s）

注：与正常组比较，*P＜0.05；与模型组比较，△P＜0.05；与缬沙坦组比较，▲P＜0.05

组别正常组模型组心康冲3 3剂组3组3缬沙坦PTEN 1.034±0.102 0.125±0.031*0.382±0.142△0.541±0.091△只数GAS5 1.036±0.105 0.184±0.029*0.367±0.083△▲0.593±0.081△miR-21 1.037±0.117 8.747±1.377*4.606±0.990△▲2.991±0.634△

4.6 心康冲剂对模型大鼠左心室Akt、周期蛋白依赖性激酶4、磷酸酶及张力蛋白同源物、周期蛋白D1 蛋白表达的影响

与正常组比较，模型组大鼠左心室Akt、CDK4、CyclinD1蛋白表达显著升高，PTEN蛋白表达显著降低（P＜0.05）；与模型组比较，心康冲剂组和缬沙坦组大鼠左心室Akt、CDK4、CyclinD1蛋白表达显著降低，PTEN蛋白表达显著升高（P＜0.05）。见图4、表7。

图4 各组大鼠左心室Akt、CDK4、PTEN、CyclinD1蛋白免疫印迹

表7 各组大鼠左心室Akt、CDK4、PTEN、CyclinD1蛋白表达比较（±s）

表7 各组大鼠左心室Akt、CDK4、PTEN、CyclinD1蛋白表达比较（±s）

注：与空白组比较，*P＜0.05；与模型组比较，△P＜0.05

组别CyclinD1只数Akt CDK4 PTEN正常组模型组心康冲剂组缬沙坦组0.355±0.046 0.715±0.033*0.538±0.045△0.487±0.043△3 3 3 3 0.100±.0790 0.667±0.103*0.453±0.082△0.312±0.044△0.100±0.039 0.551±0.053*0.396±0.090△0.286±0.051△0.553±0.082 0.186±0.055*0.362±0.028△0.400±0.150△

5 讨论

心肌纤维化可导致心功能异常，抗心肌纤维化是治疗CHF的一个方向[12]。CFs活化增殖是心肌纤维化发生发展的中心环节。CyclinD1通过激活G1期特有的CDK4蛋白推动细胞周期由G1期进入S期，促进细胞分裂、增殖。当CyclinD1、CDK4过表达后，可促进成纤维细胞增殖，从而促使心肌纤维化发生[13]。PTEN可抑制Akt激活后上调的ColⅠ、Ⅲ型胶原蛋白、α-SMA及MMP2合成，抑制CyclinD1和CDK4诱导的细胞增殖[13-14]，阻止细胞G1/S期转化，抑制纤维化形成[15]。相反，如PTEN表达被抑制，则上调CyclinD1、CDK4表达，促进细胞G1/S期转化，促使纤维化形成。长链非编码RNA GAS5可以碱基互补配对为基础共享结合miR-21 反应元件，通过“海绵样”吸附miR-21，使miR-21 功能降低或丧失，削弱miR-21 对PTEN 的抑制，使PTEN在转录水平表达升高[16]，从而抑制Akt活化后诱导的细胞增殖。

根据临床症状，可将心肌纤维化归属于中医学“心悸”“喘证”“水肿”等范畴。毛以林教授经过长期临床实践认为，心力衰竭心肌纤维化的关键病机是宗气下陷、脾肾阳虚、水湿内停[17]。心康冲剂以真武汤、升陷汤及参苓白术散为基础组成，能升补宗气、温阳利水，对CHF水湿浸渍患者能利尿消肿，提高心功能，改善预后。方中大剂黄芪、人参补心肺以升宗气，共为君药；茯苓、薏苡仁健脾利水，陈皮行气利水，砂仁运脾化湿，共为臣药；制附片温肾阳，桂枝温阳化气，生姜皮、大腹皮专利肌肤之水，共为佐药；柴胡、升麻提升清阳之气，桔梗舟楫之药，为使，诸药和而为功。前期研究表明，心康冲剂可抑制miR-21、Akt表达，促进PTEN表达，逆转心肌纤维化[6-7，18]。本实验显示，模型组大鼠HE 染色可见心肌细胞溶解，LVFS、LVEF降低，说明其心功能下降。免疫荧光染色、Masson染色显示模型组大鼠心肌纤维化明显，且miR-21、Akt、CDK4、CyclinD1、MMP9、ColⅠ表达升高，GAS5、PTEN 表达降低，提示模型组大鼠GAS5、PTEN表达受抑制，CFs增殖活跃。经心康冲剂干预后，模型大鼠LVEF、LVFS升高，心肌细胞肿胀较轻，MMP9、ColⅠ含量降低，说明心康冲剂可提高大鼠心功能，减轻心肌纤维组织增生，可能通过上调GAS5、PTEN 表达，下调miR-21、Akt、CDK4、CyclinD1表达阻滞CFs增殖。本研究探讨了心康冲剂对GAS5/miR-21 介导的CHF 大鼠CFs 增殖的调控作用，为心康冲剂抗心肌纤维化提供更多依据。然而本结果并未完全说明心康冲剂可通过GAS5/miR-21靶向调控PTEN/Akt通路抑制CDK4、CyclinD1表达，从而实现细胞增殖阻滞。今后将分别对GAS5、miR-21进行靶向调控，再观察心康冲剂对PTEN/Akt通路及CFs增殖的影响，以进一步明确其是否通过GAS5/miR-21靶向调控PTEN/Akt通路抑制细胞增殖。