甘蔗核心种质花叶病和宿根矮化病自然抗病性调查与分子检测

王晓燕,马永德,单红丽,李 婕,张荣跃,李银煳,李文凤,黄应昆

(1.云南省农业科学院甘蔗研究所,云南开远 661699;2.耿马县农业农村局,云南耿马 677500)

0 引言

蔗糖产业是我国区域经济发展的重要支柱和边疆少数民族地区农民增收、地方财政增长的主要来源[1]。而甘蔗病害是制约蔗糖产业高质量发展的重要因素之一,其中甘蔗花叶病和宿根矮化病(ratoon stuning disease,RSD)是重要的种传甘蔗病害,对甘蔗产量和品质影响极大[2-3]。

甘蔗花叶病是一种重要的世界性种传病害,1892年Musschenbrock在爪哇首次记述了该病,之后在世界各大蔗区普遍发生,目前已成为我国蔗区发生最普遍,危害最严重的病害之一[3-4]。自然条件下,甘蔗花叶病由马铃薯Y病毒科(Potyviridae)的甘蔗花叶病毒(Sugarcanemosaicvirus,SCMV)、高粱花叶病毒(Sorghummosaicvirus,SrMV)、甘蔗线条花叶病毒(Sugarcanestreakmosaicvirus,SCSMV)等引起。目前,我国蔗区已确定的甘蔗花叶病病原主要有SCSMV、SrMV和SCMV 3种,且在各植蔗省区均有发生[5-7]。其中云南蔗区以SCSMV为主,严重时检出率高达100%[8];福建、四川、广西、贵州、海南和广东等蔗区以SrMV为主,检出率分别为84.8%、74.6%、65.3%、65.3%、58.8%和55.6%;浙江蔗区以SCMV为主,检出率为65.3%[9]。甘蔗宿根矮化病(RSD)是由棒杆菌属细菌(Leifsoniaxylisubsp.xyli, Lxx)寄生于蔗株维管束中引起的一种世界性种传病害,自1944年在澳大利亚昆士兰首次发现以来[10],已有美国、南非、毛里求斯、印度、巴西、中国等多个国家和地区报道了该病的发生,现已遍布世界各蔗区[11-15]。RSD在我国蔗区普遍发生,2009—2012年LI等[16]采用PCR检测对云南、广西21个甘蔗主产区进行抽查,RSD检出率为74.7%。2013—2014年韦金菊等[17]对广西9个主产蔗区进行RSD发生情况调查,RSD检出率为71.22%。2017年沈林波等[18]对广西、云南、广东和海南等省12个代表性蔗区进行抽查,12个蔗区均能检测到RSD,全国平均检出率为16.56%。

培育和推广抗病品种是防控甘蔗花叶病和RSD最为经济有效的措施,而抗病种质资源的发掘利用是抗病育种的基础和关键。我国国家甘蔗种质资源圃保存有3 000多份珍贵种质资源,但这些种质资源的甘蔗花叶病和RSD发生情况及自然抗病性不清,其病原缺乏分子水平的系统检测鉴定。为此,本研究开展了105份甘蔗核心种质资源花叶病和RSD田间自然发病调查及抗性评价,并采样对其病原进行分子检测鉴定,以期为有效开展甘蔗抗花叶病和RSD育种提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

国家甘蔗种质资源圃(National Germplasm Repository of Sugarcane),国家科技资源共享服务平台-作物种质资源库(National Infrastructure for Crop Germplasm Resources)保存的甘蔗核心种质资源105份。

1.2 病害调查与样品采集

于2021年7月甘蔗花叶病发生稳定期,通过目测蔗株叶片症状对国家甘蔗种质资源圃保存的105份核心种质进行甘蔗花叶病田间自然发病率调查。每份核心种质顺序调查100株,记录调查总株数和花叶病发病株数,计算病株率。参照文献[19]和文献[20]中的标准按1～5级分级进行抗性水平分类。结合花叶病调查每份核心种质采集病株叶片样品各1份,用于检测SCSMV、SrMV、SCMV 3种花叶病病毒。

自然发病株率=(病株数/调查总株数)×100%

于2021年12月甘蔗成熟期,每份核心种质随机取6株,每株截取中下部茎节各1节,每节切成约7 cm长,纵向“十字”剖为4份,再用钳子挤压蔗茎,共取约25 mL的蔗汁于50 mL离心管内混匀,样品放于冰箱中,于-20 ℃保存用于检测RSD。每取1个样品后,取样工具先用清水冲洗,再用75%酒精进行消毒。

1.3 花叶病病毒检测

参照蒋军喜等[21]和李文凤等[22]方法对各核心种质病株叶片样品进行SCSMV、SrMV、SCMV 3种花叶病病毒检测。检测方法为:各核心种质病株样品称取叶片0.2 g,采用北京全式金生物技术有限公司的TransZolPlant试剂盒提取甘蔗叶片总RNA,具体步骤按照说明书操作。以提取的甘蔗叶片总RNA为模板,用TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA synthesis SuperMix 试剂盒(北京全式金生物技术有限公司)并按其说明合成cDNA第一链。分别用SCSMV、SrMV和SCMV病毒特异性引物(表1)对反转录产物进行PCR扩增。SCSMV的PCR反应条件为:20 μL PCR扩增体系中含ddH2O 9.6 μL、2×Easy Taq PCR SuperMix (北京全式金生物技术有限公司) 8.0 μL,cDNA模板2 μL,上下游引物各0.2 μL(20 μg/μL);PCR扩增程序为:94℃预变性5 min;94 ℃变性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min,35个循环;72℃延伸10 min。SCMV和SrMV的PCR反应条件为:20 μL PCR扩增体系中含ddH2O 7.2 μL、2×Easy Taq PCR SuperMix (北京全式金生物技术有限公司) 10 μL,cDNA模板2 μL,上下游引物各0.4 μL(20 μg/μL);PCR扩增程序都为:94 ℃预变性5 min;94 ℃变性30 s,60 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min,35个循环;72 ℃延伸10 min。病原检测阳性对照为经检测鉴定是SCSMV、SrMV和SCMV的植株基因组RNA,阴性对照为茎尖组织脱毒健康植株基因组RNA,空白对照为灭菌双蒸水。

表1 甘蔗花叶病病原检测所用引物Table 1 Primers used to detect the pathogens of sugarcane mosaic disease

1.4 RSD检测

参照LI等[16]和张荣跃等[15]的方法对每份核心种质采集的蔗汁样品进行RSD检测。检测方法为:各样品取4 mL蔗汁,采用北京全式金生物技术公司的Easy Pure plant Genomic DNA Kit植物DNA提取试剂盒提取蔗汁总DNA,具体步骤按照说明书操作。以提取的蔗汁总DNA为模版进行PCR扩增。PCR扩增体系含ddH2O 8.6 μL,2×Easy Taq PCR SuperMix (北京全式金生物技术有限公司) 8 μL,DNA模板3 μL,上下游引物(Lxxl:5′-CCGAAGTGAGCAGATTGACC-3′;Lxx2:5′-ACCCTGTGTTGTTTTCAACG-3′)各0.2 μL(20 μg/μL);扩增程序为:95 ℃预变性5 min,94 ℃变性30s,56 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min,35个循环后72 ℃延伸5 min。预期扩增片段大小为438 bp。RSD阳性对照为经检测鉴定为Lxx的病株蔗汁总DNA,阴性对照为本所脱毒无菌蔗株,空白对照为灭菌去离子水。

2 结果与分析

2.1 甘蔗花叶病调查及SCSMV、SrMV、SCMV病毒检测结果

105份甘蔗核心种质中,1级高抗到3级中抗的有75份,占71.4%。其中,‘赣蔗75-65’‘桂糖69-349’‘桂糖71-67’‘云辐86-13’‘川宁85-78’‘川糖57-416’‘福农91-3623’‘粤农86-295’‘粤农88-162’‘崖城71-255’‘崖城80-139’‘台糖134’‘台糖173’‘新台糖8号’‘C92-52’‘POJ2878’‘RB72-454’‘Phil72-446’‘FR96-405’‘CP94-1100’‘L116’等21份核心种质表现1级高抗,占20.0%;‘桂糖11号’‘云蔗87-58’‘福91-4710’‘福农90-6652’‘闽糖69-421’‘闽糖86-2121’‘闽糖92-649’‘崖城84-125’‘崖城84-37’‘台糖1108’‘台糖160’‘台糖172’‘M438-59’‘PR77-3042’‘MY5770’‘Co740’‘RB83-5054’‘Vmc95-09’‘Q170’‘Q200’‘FR97-33’‘FR97-82’‘FR93-344’‘FR93-803’‘FR94-87’‘CP67-412’‘CP89-2377’等27份核心种质表现2级抗病,占25.7%;27份核心种质表现3级中抗,占25.7%(表2)。

表2 甘蔗核心种质花叶病调查及自然抗病性Table 2 Occurrence investigation and natural resistance of sugarcane core germplasm in mosaic disease

从图1可以看出,105份核心种质样品检测出SCSMV、SrMV两种病毒,所有样品均未检测出SCMV病毒。其中,38份核心种质受SCSMV单独侵染检测出SCSMV,检出率为36.2%;15份核心种质受SrMV单独侵染检测出SrMV,检出率为14.3%;20份核心种质受SCSMV和SrMV复合侵染检测出SCSMV和SrMV,检出率为19.0%(图1)。综合分析结果显示,‘赣蔗75-65’‘桂糖69-349’‘桂糖71-67’‘云辐86-13’‘川宁85-78’‘川糖57-416’‘福农91-3623’‘粤农86-295’‘粤农88-162’‘崖城71-255’‘崖城80-139’‘台糖134’‘台糖173’‘新台糖8号’‘C92-52’‘POJ2878’‘RB72-454’‘Phil72-446’‘FR96-405’‘CP94-1100’‘L116’21份核心种质对SCSMV和SrMV两种病毒均表现为高抗,占20.0%;‘桂糖11号’‘云蔗87-58’‘福91-4710’‘福农90-6652’‘闽糖69-421’‘闽糖86-2121’‘闽糖92-649’‘崖城84-125’‘崖城84-37’‘台糖1108’‘台糖160’‘台糖172’‘M438-59’‘PR77-3042’‘MY5770’‘Co740’‘RB83-5054’‘Vmc95-09’‘Q170’‘Q200’‘FR97-33’‘FR97-82’‘FR93-344’‘FR93-803’‘FR94-87’‘CP67-412’‘CP89-2377’27份核心种质双抗SCSMV和SrMV两种病毒,占25.7%。

图1 105份甘蔗核心种质花叶病病原检测韦恩图Fig.1 Venn diagram for pathogen detection of mosaic disease in 105 sugarcane core germplasms

2.2 RSD检测结果

PCR检测结果表明,105份甘蔗核心种质中88份感RSD呈阳性,阳性检出率为83.8%;17份未感RSD呈阴性,占总检测数的16.2%(图2)。可见,自然条件下,甘蔗核心种质易感RSD,比例偏高;而抗RSD甘蔗核心种质极少,抗性水平偏低。

图2 105份甘蔗核心种质RSD检测结果Fig.2 RSD detection results of 105 sugarcane core germplasms

3 结论与讨论

甘蔗种质资源是现代甘蔗育种中抗病基因的重要来源,抗病种质资源的发掘利用是抗病育种的基础和关键,筛选抗病种质、拓宽抗病遗传基础对选育抗病品种具有重要意义。本研究对国家甘蔗种质资源圃保存的105份甘蔗核心种质进行花叶病和宿根矮化病田间自然发病调查及其病原检测与抗性评价,分析明确了各核心种质对甘蔗花叶病和RSD的自然抗病性,检测确认核心种质受SCSMV、SrMV两种病毒单独或复合侵染,综合评价筛选出双抗SCSMV和SrMV的核心种质48份、抗RSD的核心种质17份、多抗SCSMV、SrMV和RSD的核心种质11份,为深入开展甘蔗抗花叶病和RSD育种提供了丰富的抗病基因源和参考依据。

分子检测结果显示,105份核心种质样品检测到SCSMV、SrMV 2种病毒,所有样品均未检测出SCMV病毒;38份核心种质受SCSMV单独侵染,检出率为36.2%;15份核心种质受SrMV单独侵染,检出率为14.3%;20份核心种质受SCSMV和SrMV复合侵染,检出率为19.0%,由此表明SCSMV是云南蔗区花叶病主要病原,这与WANG等[8]和李银煳等[23]的研究结果一致。而其他学者研究认为,云南蔗区以SrMV为花叶病主要病原,检出率为95.0%;SCSMV次之为56.8%[9],这可能与采样地域、气候或种苗调运、品种轮换、病毒相互竞争、农事操作等有关。关于SCSMV和SrMV的田间消长动态还需进一步研究。

为摸清我国不同蔗区RSD发生情况和自然抗病性,2009—2017年,张荣跃等[15]、LI等[16]、韦金菊等[17]和沈林波等[18]对云南、广西不同蔗区不同主栽品种的RSD发病情况进行调查,确认RSD在各蔗区普遍发生,阳性检出率分别为59.54%、74.7%、71.22%和16.56%。本研究105份甘蔗核心种质的RSD阳性检出率为83.8%,显著高于以上学者的研究结果,可见,甘蔗核心种质易感RSD,比例偏高;而抗RSD甘蔗核心种质极少,抗性水平偏低。

生产上甘蔗花叶病和RSD的防控措施多样,其中选育和种植抗病品种是最为经济有效的措施,鉴于SCSMV已成为甘蔗花叶病主要病原[8,23],RSD发生严重[15-16],今后应加强多抗SCSMV、SrMV和RSD甘蔗新品种选育。而本研究筛选的多抗SCSMV、SrMV和RSD的核心种质,可作为珍贵抗病基因源,与常用育种亲本杂交,选育抗花叶病和RSD甘蔗新品种,供生产上推广应用。其次,作为防治RSD的主要措施,生产和种植健康种苗已在巴西、古巴、澳大 利亚等国应用多年。甘蔗健康种苗的生产主要有温水脱毒和组培脱毒两种方法。卢文洁等[24]研究表明温水脱毒对甘蔗有明显的增产增糖效果,新植公顷增产最高49 830 kg,1年宿根公顷增产最高达29 895 kg,2年宿根公顷增产最高达23 656 kg,蔗糖分提高0.35%～0.86%,宿根年限延长2～3年。组培脱毒既可去除RSD病菌又可脱去甘蔗病毒获得健康种苗,如2020年González-Arnao等[25]采用冷冻渗透疗法和组织培养,除去病蔗体内SCMV获得无毒苗。建议在我国各蔗区建立甘蔗专用健康种苗圃,将其作为防治甘蔗病害和增产增糖的手段,以提供脱毒健康种苗在生产上大面积推广应用,促进甘蔗产业健康、可持续高质量发展。