投喂频率对大口黑鲈幼鱼生长及消化的影响

■ 孙洪庆 王 洋 杨 广 朱国霞 白东清

（天津农学院水产学院，天津市水产生态及养殖重点实验室，天津 300384）

大口黑鲈（Micropterus salmoides）又名加州鲈，有“淡水石斑鱼”的美名，隶属辐鳍鱼纲（Actinopterygii）、鲈形目（Perciformes）、太阳鱼科（Ceutrarchidae）、黑鲈属（Micropterus），身体呈纺锤形，最适水温为25～30 ℃[1-3]。该鱼原产于加拿大和美国，于20 世纪70 年代引进我国，适应性强，生长快，养殖周期短，易起捕，肉质鲜美细嫩，无肌间刺，外形美观，深受养殖户和消费者的喜爱[4-6]。我国鲈鱼养殖量，从2018年456 888 t增长到2020 年477 808 t，在养殖管理中，科学合理的投喂频率是至关重要的，研究表明投喂频率与生长发育和机体健康密切相关，不合理的投饲频率会直接影响水产动物的生长、消化、摄食、饲料利用、水质及养殖成本[7]。相关报道表明，养殖密度和饲料投喂量的增加是导致水质环境恶化的原因之一，也是病害频繁暴发的罪魁祸首[8]。目前，国内外研究主要集中在大口黑鲈养殖技术、鱼病治理、繁殖孵化和生长发育等方面，有关投喂频率对大口黑鲈生长、消化和肠道健康的报道寥寥可数[9]。因此，本试验通过研究投喂频率对大口黑鲈幼鱼生长、饲料效率、消化酶活性以及肠道和肝胰脏结构形态，探讨不同投喂频率对大口黑鲈生长发育、消化能力及健康状况的影响。为循环水系统中健康养殖大口黑鲈提供部分参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 试验用鱼

试验用2 000尾健康大口黑鲈仔鱼取自天津蓝科水产养殖有限公司，经过开口驯化，暂养两周后，对幼鱼随机分组，称体重，量体长。初始体质量（5.3±0.6） g，初始体长（6.2±0.3） cm。

1.1.2 饲料配置

饲料原料由天津现代天骄水产饲料股份有限公司提供，用Y-3000S 粉碎机进行粉碎，过80 目筛，按照表1配方进行配制，用MB-22S制粒机制作饲料，孔径2 mm，呈圆柱形，于60 ℃鼓风干燥箱烘干，然后在室温下回潮，并存放于避光通风处，使用前根据大口黑鲈个体大小进行破碎，过筛去除细小颗粒后投喂，颗粒耐久性指数为91%～93%，在水中浸泡30 min散失率为10.7%，饲料配方及营养水平见表1。

表1 饲料配方及营养水平（%）

表2 各级叔丁醇的配置（mL）

1.2 试验方法

1.2.1 试验设计及养殖管理

投喂频率与时间分别为2 次/d（10：00，19：00），3 次/d（07：00，13：00，19：00），4 次/d（10：00，13：00，16：00，19：00），5 次/d（07：00，10：00，13：00，16：00，19：00）和6 次/d（07：00，10：00，13：00，16：00，19：00，22：00）。采用表观饱食投喂法，根据试验养殖期间，不同时间段大口黑鲈个体大小改变饲料大小，每次投喂时间30 min左右，结束投喂15 min后用虹吸法吸残饵并称重。试验期间，采用室内循环水养殖系统，每天用厦门利洋水产科技有限公司水质快速检测盒监测水质情况，养殖中水温保持在26～28℃，溶氧≥6.0 mg/L，氨氮<0.05 mg/L，亚硝酸盐<0.05 mg/L，pH 为6.5～7.6。试验周期为8 周，每组设3 个重复，每个重复50 尾鱼，每组水体体积0.5 m3。

1.2.2 样品采集

8 周养殖结束空腹24 h 后采集样品，每个重复组随机采集30 尾鱼，用丁香酚快速麻醉后，用直尺和电子游标卡尺进行形态指数测量，使用1 mL 针头抽取血液，每尾鱼抽取0.5 mL，放入5 mL 离心管中静置、离心，用于血液生化指标的测定。然后在冰袋上迅速取出胃、幽门盲囊、肠道和肝胰脏，用4 ℃生理盐水冲洗内外，放入-80 ℃冰箱保存，用于消化酶活性测定。另每个重复组随机取6 尾鱼，快速麻醉，冰袋上解剖，取出胃、幽门盲囊、肠道和肝胰脏，用4 ℃生理盐水冲洗掉胃肠内容物，迅速放入中性甲醛中进行固定，用于组织生理学切片观察。

1.2.3 饲料常规成分的测定

利用常压恒温烘干法（GB/T 6435—2014）测量饲料中水分含量，利用马弗炉550 ℃灼烧法测量饲料中粗灰分含量（GB/T 6438—2007），利用凯氏定氮法测量饲料中粗蛋白含量（GB/T 6432—2018），采用FOSS(KT 200 Kjeltec)），使用鲁氏残渣法测量饲料中粗脂肪含量（GB/T 6433—2006，叶列敏柯脂肪浸提器）。

1.2.4 生长指标测量

特定生长率（%/d）=100×（lnW2-lnW0）/T

增重率（%）=100×（W2-W0）/W0

摄食率（%）=W1×100/T×（W2+W0）/2

饲料系数=W1/（W2-W0）

蛋白质效率=（W2-W0）/（W1×CP）

肥满度（g/cm3）=W2/L3×100

脏体比（%）=W4/W5×100

式中：W0——大口黑鲈初始体质量（g）；

W1——摄食饲料总质量（g）；

W2——大口黑鲈最终体质量（g）；

W4——内脏团重（g）；

W5——大口黑鲈体质量（g）；

T——养殖天数（d）；

L——大口黑鲈最终体长(cm)；

CP——饲料中所有含氮物质（%）。

1.2.5 消化酶活性的测定

α-淀粉酶、脂肪酶和胰蛋白酶活性采用南京建成生物工程研究所有限公司生产试剂盒进行测定，方法参考试剂盒说明书。

1.2.6 肝胰脏和肠道组织切片的制作

试验使用常规的石蜡切片法，组织经过中性甲醛固定后，流动冲洗12 h，依次放入Ⅱ级叔丁醇（20%）、Ⅲ级叔丁醇（35%）、Ⅳ级叔丁醇（50%）、Ⅴ级叔丁醇（75%）和Ⅵ级叔丁醇（100%）进行脱水，脱水后放入液态石蜡中保存，经过包埋后上切片机切片，二甲苯脱蜡，苏木素-伊红染色，在经过不同梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。组织切片后用显微镜进行观察拍照[10]。

1.2.7 数据处理

采用SPSS 20.0 软件进行数据统计分析。首先对试验数据进行单因素方差分析，数据差异显著再进行LSD 和Tukey’s法多重比较。数据均以“平均值±标准误”表示。

2 结果与分析

2.1 投喂频率对大口黑鲈幼鱼生长及饲料利用的影响

由表3 可得，投喂频率影响大口黑鲈幼鱼生长和饲料利用率。其中，3、4次/d组和5次/d组特定生长率显著高于6 次/d 组（P<0.05）；3 次/d 组和5 次/d 组增重率显著高于6次/d组（P<0.05）；5次/d组摄食率显著高于其余各组（P<0.05）；2次/d组和3次/d组饲料系数显著低于4次/d组和6次/d组（P<0.05）；2次/d和3次/d组蛋白质效率显著高于4次/d组和6次/d组（P<0.05），其中3次/d组饲料系数最低，蛋白质效率最高。6次/d组肥满度显著高于3次/d组（P<0.05）；2次/d组脏体比显著高于3、4次/d组和6次/d组（P<0.05）。可见，循环水养殖系统中投喂频率为3次/d时更适合大口黑鲈幼鱼生长。

表3 不同投喂频率对大口黑鲈生长及饲料利用的影响

2.2 投喂频率对大口黑鲈幼鱼消化系统消化酶活性的影响

由表4 可知，投喂频率影响大口黑鲈α-淀粉酶、脂肪酶和胰蛋白酶活性。

表4 不同投喂频率对大口黑鲈幼鱼消化酶的影响(U/mg prot.)

胃中α-淀粉酶活性最大值出现在2次/d 组，显著高于其余各组（P<0.05）；幽门盲囊中6次/d组α-淀粉酶活性最高，与2次/d组差异不显著（P>0.05），显著高于3、4次/d组和5次/d组（P<0.05）；在肠道中，5次/d组α-淀粉酶活性最高，与6次/d组无显著差异（P>0.05），显著高于2、3 次/d 组和4 次/d 组（P<0.05）；在肝胰脏中，4 次/d 组α-淀粉酶活性显著高于其余各组（P<0.05）。

胃中脂肪酶活性最大值出现在5 次/d 组，显著高于其余各组（P<0.05）；幽门盲囊中5 次/d 组脂肪酶活性最高，与6次/d组无显著差异（P>0.05），显著高于2、3 次/d 组和4 次/d 组（P<0.05）；肠道中3 次/d 组脂肪酶活性显著高于其余各组（P<0.05）；肝胰脏中2 次/d组脂肪酶活性最高，与4、5、6 次/d 组无显著差异（P>0.05），显著高于3次/d组（P<0.05）。

肠道中随着投喂频率的增加胰蛋白酶活性呈先升后降趋势，其中3 次/d 组最高，显著高于4、5 次/d 组和6 次/d 组（P<0.05）；肝胰脏中5 次/d 组胰蛋白酶活性最高，显著高于2 次/d 组（P<0.05），与3、4 次/d 组和6次/d组无显著差异（P>0.05）。

2.3 投喂频率对大口黑鲈胃肠道和肝胰脏组织结构的影响

由表5和图1可知，投喂频率对前、中和后肠的绒毛高度、宽度和肌层厚度有影响。前肠中，3次/d组绒毛高度显著高于其余各组（P<0.05）；3 次/d 组绒毛宽度显著高于4、5 次/d 组和6 次/d 组（P<0.05），与2 次/d组无显著差异（P>0.05）；3 次/d 组肌层厚度显著高于2、4 次/d 组和5 次/d 组（P<0.05），与6 次/d 组无显著差异（P>0.05）。中肠中，2 次/d 组绒毛高度显著高于其余各组（P<0.05）；4次/d 组绒毛宽度显著高于3、5次/d和6次/d组（P<0.05），与2次/d组无显著差异（P>0.05）组；2 次/d 组肌层厚度高于其余各组（P<0.05）。后肠中，2 次/d 组绒毛高度显著高于其余各组（P<0.05）；3 次/d 组绒毛宽度显著高于其余各组（P<0.05）；6 次/d组肌层厚度显著高于其余各组（P<0.05）。

图1 投喂频率对大口黑鲈肠道组织结构的影响

表5 不同投喂频率对大口黑鲈肠道组织结构的影响(μm)

由表6和图2可知，投喂频率影响胃的肌层、黏膜下层和黏膜层。3次/d组肌层厚度显著高于2、4次/d组和5 次/d 组（P<0.05）。2 次/d 组黏膜下层厚度显著高于其余各组（P<0.05）。4 次/d 组黏膜层厚度显著高于其余各组（P<0.05）。

图2 投喂频率对大口黑鲈胃组织结构的影响

表6 投喂频率对大口黑鲈胃组织结构的影响(μm)

由图3可知，本试验5个组中，肝胰脏细胞核透明，偏移、细胞空泡化和脂肪滴在各个组中均有出现，在投喂频率相对较高的4、5次/d组和6次/d组中，这种情况更加明显。2次/d组和3次/d组肝胰脏脂肪堆积程度，细胞轮廓、细胞核清晰度优于4、5次/d组和6次/d组。

图3 投喂频率对大口黑鲈肝胰脏组织结构的影响

3 讨论

3.1 投喂频率对大口黑鲈生长的影响

现有的研究显示，投喂频率对水产动物的影响结论不一，有人认为投喂频率不影响大口黑鲈、大杂交鲟和团头鲂的生长和饲料利用率[11-13]，有人认为随着投喂频率的增加，青鱼摄食率显著上升[14]，黄斑蓝子鱼蛋白质效率显著升高[15]，子二代中华鲟稚鱼肥满度和脏体比无显著差异[16]。本研究中，当投喂频率达到6次/d时，对大口黑鲈生长产生抑制，特定生长率显著低于3～5 次/d 组，蛋白质效果显著低于2、3 次/d 组。鱼类种类不同消化道长度不同，对饲料的消化程度有别，饲料在消化道停留时间不同。随着投喂频率变化，鱼类摄食量会增加，鱼类消化道短，饲料停留时间短，导致食物未被吸收便排出体外，进而使鱼类饲料利用率下降，生长缓慢[17-18]。

3.2 投喂频率对大口黑鲈消化酶活性的影响

消化酶活性决定了肠道消化能力的高低，常见的消化酶有脂肪酶、α-淀粉酶和胰蛋白酶[19-20]。投喂频率的增加造成鱼类摄入量过高促进淀粉酶、脂肪酶和胰蛋白酶的合成，适宜的投喂频率对消化酶活性存在一定影响[21]。本研究发现，2 次/d 组大口黑鲈胃中α-淀粉酶活性最高，脂肪酶活性随着投喂频率的增加呈先上升后下降的趋势。这与冯鹏霏[22]和宋国[23]报道的黄颡鱼幼鱼和条石鲷的胃α-淀粉酶2 次/d 组显著高于其他各组的研究结果一致；幽门盲囊作为食物的“储存仓”，可进一步扩大肠道的吸收面积[24]。随着投喂频率的增加，幽门盲囊α-淀粉酶和脂肪酶呈先下降后上升的趋势。这与强俊[25]报道，随着投喂频率的增加，奥尼罗非鱼脂肪酶活性呈先下降后上升趋势研究结果相吻合。

鱼类肠道消化吸收能力与消化酶活力密切相关，而摄入饲料、摄食习性的差别都会对肠道消化酶造成影响[26]。本研究发现，肠道中5 次/d 组α-淀粉酶活性显著高于2、3 次/d 和4 次/d 组；脂肪酶和胰蛋白酶活性显著高于4、5次/d组。而谢苏明[27]研究发现，2次/d组大口黑鲈脂肪酶活性最高；褚志鹏[13]发现投喂频率对大杂交鲟α-淀粉酶和脂肪酶无显著影响；Xie 等[28]发现投喂频率对大黄鱼肠道胰蛋白酶活性有显著影响。鱼种差异和食性差异等内源因素和养殖周期、养殖模式、温度、水体酸碱度和光暗周期等外源因素均会对鱼类消化酶活性产生影响[29-30]。

肝胰脏是鱼类的代谢和排毒器官，在鱼体中起着去氧化、肝糖的储存和分泌性蛋白质合成等功能，消化酶，胆汁等也是由肝胰脏合成。本研究中，投喂频率影响肝胰脏中消化酶活性，其中，4 次/d 组α-淀粉酶活性显著高于其他组，胰蛋白酶活性呈先上升后下降趋势，脂肪酶活性呈先下降后上升的趋势。而卫育良等[31]发现，投喂频率对红鳍东方鲀的α-淀粉酶活性无显著影响，脂肪酶活性呈先上升后下降的趋势，肉食性鱼类对淀粉利用率较差，随着投喂频率的增加，摄入的淀粉含量变高，从一开始刺激淀粉酶的分泌到淀粉过量堆积刺激脂肪酶的分泌的过程[21，32]。

3.3 投喂频率对大口黑鲈胃肠道和肝胰脏组织结构的影响

肠道是鱼类体内生理代谢和营养消化吸收的重要器官，肠绒毛为肠道中吸收饲料中养分的主要结构，肠绒毛的高度和宽度的大小决定了肠黏膜的养分吸收面积，也表明肠道的健康情况[33]。肠道肌层厚度反映了肠道的收缩与扩张能力，当肠道功能紊乱肠道对饲料中营养成分吸收能力下降导致肌层变薄[34-36]。本试验中，各组前、中、后肠的绒毛高度、宽度和肌层厚度均存在差异。其中在前肠中3 次/d 投喂绒毛高度、宽度和肌层厚度均高于其余各组，肠道消化吸收能力和健康状况较好。有研究表明，大口黑鲈前肠皱襞数量显著多于中肠和后肠，前肠为肠道的主要消化场所，而中肠和后肠的环境则为食物残渣和粪便的排出提供了有利条件[37]。在Imsland 等[38]的报道中；每天投喂的圆鳍鱼肠道出现上皮结构紊乱，而每周投喂3 d和4 d投喂组的肠道健康状况较好、固有层延长以及发炎等现象，进一步表明不合理的投喂频率会对鱼类肠道造成损伤。

大口黑鲈为有胃鱼，其胃由黏膜层、黏膜下层、固有层、肌层组成，呈Y形，分为3个部分：最前端与食道相连为贲门部，最后端与幽门盲囊相连为幽门部，中间主体部分为胃体部[39]。胃腺细胞存在于黏膜层中，黏膜层的厚度关系到胃腺细胞数量的多少，肌层由平滑肌构成，肌层厚度影响胃的收缩能力和消化能力[40-41]。本试验中，随着投喂频率的增加，胃肌层和黏膜层厚度呈先上升后下降的趋势。其中3次/d投喂组肌层厚度和黏膜层厚度均处于较高水平，由此推测，投喂频率在3次/d时胃消化吸收能力处于较高水平。

通过组织切片观察，本试验中大口黑鲈2、3、4、5 次/d 和6 次/d 组肝胰脏均发现脂肪滴和细胞空泡化的情况，在4、5、6 次/d 组中情况尤为严重，每天投喂4、5、6 次/d 存在形状不规则的细胞，这种情况被称为脂肪化。Shearer[42]发现，当投喂频率过高时，大鳞大麻哈鱼肝胰脏中脂肪积累量上升，造成肝胰脏患病风险增加；吉富罗非鱼中，当投喂频率过高时，其肝胰脏受到损伤[43]。以上说明过多的脂肪积累在肝脏中，引起鱼类肝细胞细胞核偏移、细胞空泡化和细胞轮廓模糊，破坏了肝胰脏细胞结构，也就是说肝胰脏中脂肪过量堆积是引起肝胰脏病变的可能之一[44]。由此推断，本试验中投喂频率为2、3次/d时，大口黑鲈肝胰脏健康状况较好状态。

4 结论

综上所述，本试验通过分析不同投喂频率对大口黑鲈的生长、饲料效率、消化能力组织器官健康状况，得出在循环水养殖系统下3次/d投喂组为该环境下大口黑鲈幼鱼适宜投喂频率。