ELANE突变相关的中性粒细胞减少症诊治进展

肖于凡 综述,张志勇 审校

(重庆医科大学附属儿童医院 风湿免疫科/国家儿童健康与疾病临床医学研究中心/儿童发育疾病研究教育部重点实验室/儿童感染免疫重庆市重庆重点实验室,重庆400014)

重度先天性中性粒细胞减少症(SCN)的致病基因有ELANE、 GFI1、HAX1、SBDS等,其中最常见的致病基因是ELANE突变,称为SCN1型,遗传方式为单基因常染色体显性遗传。骨髓细胞分化都在早期阶段停止,不能产生正常功能或数量的成熟中性粒细胞,表现为中性粒细胞数量的绝对缺乏,根据中性粒细胞绝对计数(ANC)变化规律不同和临床症状的差异,ELANE突变的表型为SCN和周期性中性粒细胞减少症(CyN),目前报道的SCN患者远多于CyN患者[1-3]。ELANE突变通过影响中性粒细胞弹性蛋白酶(NE)的结构或功能,最终致中性粒细胞减少的具体机制尚不清楚,最常见的是未折叠蛋白反应(UPR)理论。无论SCN或CyN患者,都表现为早发、反复的呼吸道感染、皮肤黏膜感染,严重感染者可危及生命、恶性转化为骨髓增生异常综合征(MDS)或急性髓细胞白血病(AML)是预后不良的重要原因[2-3]。此病临床的治疗方式少且局限,尽早使用粒细胞集落刺激因子(G-CSF)是目前改善临床症状的一线选择和终身治疗方式[4],造血干细胞移植(HSCT)是目前唯一根治手段[2,5],基因编辑是未来根治的方向[5]。

1 发病机制

1.1ELANE基因突变 ELANE基因位于染色体19p13.3上,含有5个外显子和6个内含子。目前,ClinVar数据库中有超过200个ELANE基因突变,包括错义突变、无义突变、同义突变、移码突变、内含子剪切等多种形式,以错义突变为主[1,3,6-7],散发突变病例和家族遗传病例在目前已有的报道中无明显数量差异。突变位点不仅包括成熟酶的编码区,还包括酶原区和启动子区,突变部位倾向于酶活性位点附近(外显子3、4、5和内含子3、4)[5-6]。A57V、G97P、S126L、P139L、V190_F199del、W241X在文献中既有SCN也有CyN病例报道[1,8-10],同一基因型有2种不同的临床表型,目前尚不清楚具体机制。ELANE突变如V65del、N116D、C151Y、G185R、P205R、G214R、G214V,无论SCN还是CyN,都倾向表现出更严重的临床症状,发展为MDS/AML或死亡的风险更高[3,6]。CyN病例中的双位点突变倾向于表现出更严重的临床症状,如A233P合并V235WfsX突变、G192A合并193_195del突变[11-12]。

研究发现,少数SCN患者父母的外周血有ELANE基因突变,但未表现出相应的临床症状,提示存在体细胞嵌合体或不完全外显遗传的可能性[13-14],或亲代生殖系嵌合的可能[13]。反映了ELANE基因突变的遗传不稳定性,ELANE突变本身可能并不是完全导致中性粒细胞减少的原因,或许需要合并其他遗传事件才能发生,需要进一步研究,并且在进行遗传咨询时引起重视。

1.2中性粒细胞弹性酶 中性粒细胞弹性蛋白酶是由ELANE基因编码的267个氨基酸翻译为N-、单个前二肽、C-前肽,经过4次蛋白修饰为具有催化活性的酶(PDB:1HNEE,RefSeq 30-247),成熟的中性粒细胞弹性蛋白酶含有218个氨基酸,主要功能是水解蛋白质底物和参与细胞外诱捕功能。有研究认为,ELANE突变是功能缺失型突变(LOF),翻译修饰不完全导致蛋白质结构缺失,不能正确折叠、加工、分泌或降解[15]。也有研究认为,ELANE突变与NE结构破坏无关,而与NE功能障碍有关[16],但都不能完全解释NE的结构和功能障碍是如何导致中性粒细胞分化成熟停滞。目前,相关的假说较多,归纳为以下几类:(1)ELANE基因无义突变会影响NE肽链的C-端,致NE不易被衔接蛋白3(AP-3)识别,进而错误定位影响早幼粒细胞发育[6,16]。(2)内质网管控蛋白质折叠,ELANE突变产生结构或功能异常的NE,过多异常NE累积可促发内质网应激,启动未折叠蛋白反应(UPR)促进早幼粒细胞凋亡[17]。(3)有学者发现,未发生UPR的情况下,NE错误折叠会产生早幼粒细胞核体(PML-NB),进而致活性氧(ROS)水平升高,ROS诱导突变NE降解[7,18]。(4)Wnt3a与CSF3R联合刺激造血细胞中中性粒细胞的成熟,研究发现SCN患者中淋巴样增强子结合因子1(LEF-1)显著下降,LEF-1表达下降中断WNT3a信号通路,影响NE成熟[16]。

2 临床特征

2.1临床特点 中性粒细胞组成人体抗感染的固有免疫系统,严重中性粒细胞减少症容易引起严重的反复细菌或真菌感染,其中金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌和大肠杆菌最常见[4,7,9,11,15]。ELANE突变相关的SCN患者起病年龄常在生后6个月以内,CyN患者常在1岁以内。2020年法国严重慢性中性粒细胞减少症登记处(FSCNR)研究表明SCN和CyN诊断年龄中位数分别为0.19、0.8岁(95例SCN,49例CyN)[2];2004年BELLANNE-CHANTELOT等[6]研究中SCN或CyN诊断年龄中位数分别为2.8、16月龄(54例SCN,27例CyN)。

SCN患者常以脐炎、口炎或肺炎起病[4],CyN多数以口炎为首发临床症状[18]。SCN患者大多遭受终身反复感染,CyN比SCN发病率低,表现为周期性的中性粒细胞数量减少,周期为14～36 d(多数21 d左右),持续约3～7 d,临床症状也呈周期性变化[3,8,19]。两者均以呼吸系统、皮肤黏膜为最常见的感染部位,2015年MAKARYAN 等[3]研究报道,307例ELANE突变相关中性粒细胞减少的患者中,常见的感染分别为口腔溃疡(80%)、肺炎(49%)、脓肿(19%)、败血症(17%)、蜂窝织炎(12%)和腹膜炎(3%)[3]。CyN患者呼吸系统的感染多数集中在口咽部,周期性出现口腔溃疡是最主要的症状,SCN患者口咽部感染更多表现为牙周炎,包含牙龈炎、牙齿松动、牙龈红肿、牙龈出血、牙槽骨吸收等,慢性损伤可能导致早期齿龈坏死、牙齿脱落[8,20]。SCN出现下呼吸道感染的频率比CyN更高,肺部感染起病早、易反复,部分患者出现气管、支气管发育不良或肺纤维化[1,13]。MAKARYAN等[3]研究报道,97例SCN患者63%发生了肺炎,相比之下26例CyN发生肺炎的比率仅有19%。严重感染时可出现呼吸衰竭,需要吸氧甚至气管插管维持氧饱和度[2,19,21]。两者皮肤黏膜感染常表现为无或少脓液的脓肿,SCN常见的感染部位是肛周和脐部[15],严重时需要外科手术治疗[7,21]。除此之外,中耳炎、乳突炎、淋巴结炎、骨量下降、贫血也常有报道[7-8,15,22]。2021年有1例SCN患者感染新型冠状病毒的相关报道,患者为20月龄的男婴,因肺炎入院,病程中因铜绿假单胞菌感染出现典型的腮腺溃疡、肛周脓肿,中性粒细胞数量在新型冠状病毒感染后进一步下降,呼吸道症状整体不重,可解释为中性粒细胞胞外陷阱(NETs)的形成减少[21]。

CyN患者的临床症状相比SCN普遍更轻,少数患者直到其子代确诊后才被发现,部分患者随着年龄增长临床症状明显改善,仅表现为口炎、不再出现感染症状或不出现任何症状[23]。少部分CyN患者表现出严重的临床症状,呼吸衰竭需要气管插管支持,或出现脓毒血症、颅内感染、急性坏死性筋膜炎[13,19],仅2016年报道了1例CyN恶性转化为急性白血病的病例,A233P合并V235WfsX双位点突变的女性患者,4周时首次出现铜绿假单胞菌脓毒血症,17岁时发展为急性髓细胞白血病,需接受造血干细胞移植治疗[11]。

普遍认为ELANE突变导致的SCN比CyN患者的临床症状更严重,部分患者恶性转化为MDS、AML或更罕见的急性淋巴细胞白血病(ALL),尤其G-CSF普遍应用后,虽延长了SCN患者的生存时间,但SCN恶性转化率也随之增加。2006年国际严重慢性粒细胞减少症登记(SCNIR)确认了高剂量G-CSF暴露与白血病转化之间的关系[24],同年相继提出了SCN恶性转化的累积发生率超过25%[6,24]。2010年ROSENBERG等[25]研究表明,使用G-CSF 15年后,MDS/AML死亡的累积发生率为22%,因脓毒血症死亡的累积发生率为10%;2020年FSCNR研究提示MDS/AML的10年累积发生率为4.4%,20年累积发生率为5.5%[2]。除了恶性转化外,脓毒血症、呼吸衰竭、颅内感染或移植失败都会导致SCN死亡[2,13-15,21,23,25]。

2.2辅助检查 血常规是首次发现和监测中性粒细胞减少症的重要检查,重症中性粒细胞减少症患者长期维持中性粒细胞计数降低,至少3次出现中性粒细胞水平低于0.5×109L-1有助于诊断[15]。CyN患者中性粒细胞数量呈周期性减少,潜在患者建议3～4个月血常规连续监测,每周至少3次,连续计数超过2个周期[11],少部分CyN患者成年后中性粒细胞数量周期性改变会消失[23]。

骨髓细胞学检查是协助诊断的重要检查,无论是SCN还是CyN,骨髓涂片中成熟中性粒细胞均罕见,粒细胞左移,停滞在早幼粒细胞/中幼粒细胞阶段,髓样细胞数量显著减少,成髓细胞和早幼粒细胞水平低,单核细胞和嗜酸性粒细胞水平较高[13,15,21-22],定期的骨髓细胞学检查也有利于早期发现患者是否恶化为骨髓增生综合征或急性白血病。

基因检测是诊断的“金标准”,对患者及潜在携带者的ELANE基因组DNA和cDNA序列进行分析,测序包括启动子区域、外显子和内含子-外显子边界,有助于临床症状及预后的预测[3,15]。

鉴于ELANE突变与MDS/AML的相关性,建议每年进行血常规监测和骨髓细胞学检查,尤其出现不典型症状或体征时,临床医生更应进行积极的检查。

3 治 疗

3.1感染管理 预防和控制感染对患者生存质量至关重要。尽管G-CSF治疗可以改善中性粒细胞计数,但仍存在感染的风险,尤其是口腔感染,定期监测血常规和口腔科随访,保持个人口腔卫生、定期牙齿检查,有助于改善患者预后[7,15,20]。目前少见报道SCN或CyN患者使用灭活或减毒活疫苗免疫后出现不良反应。

3.2粒细胞集落刺激因子 粒细胞集落刺激因子作为一线治疗方法,通过代偿机制纠正中性粒细胞水平及降低发生脓毒血症的风险,提高患者的生存率和改善生活质量。2006年PHILIP等[24]研究的374例SCN患者在G-CSF使用后SCN患者脓毒血症死亡率下降到每年0.9%。

几乎所有ELANE突变相关的中性粒细胞减少症患者对G-CSF治疗有反应,但每例患者使用剂量差异非常大,2004年BELLANNE-CHANTELOT 等[6]研究表明,SCN使用G-CSF剂量的中位数高于CyN。2020年FSCNR随访研究表示,112例ELANE突变患者使用G-CSF治疗的患者平均剂量为9.8 μg/(kg·d)[2]。普遍推荐(包括ISCNR)治疗的初始剂量为5 μg/(kg·d)[15,24],根据患者临床症状增减剂量,中性粒细胞绝对计数超过1.0×109～1.5×109L-1为治疗目标,且<25 μg/(kg·d)的G-CSF用量可明显改善大多数患者的临床症状[14]。G-CSF难治性患者需要大剂量G-CSF治疗来控制频繁和严重的感染,最大用量可高达300 μg/(kg·d)[22]。

随着生存时间的延长,SCN患者恶性转化风险成为日益关注的问题。有研究指出长期使用G-CSF治疗的患者发生MDS/AML的风险较高[15,24-25]。2015年MAKARYAN等[3]研究报道的307例患者中,SCN或CyN使用G-CSF 20年后发生MDS/AML、移植或死亡的累计发生率分别为46%、7%。80%发展为AML的SCN患者被发现有集落刺激因子3受体(CSF3R)的获得性体细胞突变,且大剂量G-CSF治疗(>8 μg/(kg·d))或累积剂量超过10 000 μg/kg的患者会增加恶性转化的风险[3,11,26]。

3.3造血干细胞移植 造血干细胞移植仍是目前唯一根治方法,移植供体来源多为无关供者,其中脐带血和骨髓干细胞较为常用。目前,关于移植指针总结为以下几点:(1)G-CSF治疗效果差:①<1岁开始使用G-CSF[1];②中性粒细胞数量无法上升至0.5×109/L或仍继续下降[24],G-CSF使用后,仍有反复或严重感染[1,7];③大剂量G-CSF(>8 μg/(kg·d))治疗后粒细胞无升高的难治性SCN[2,6,25];(2)随访过程中发现CSF3R基因突变[2];(3)严重脓毒血症或恶性转化MDS/AML/ALL[1-2,7]。

从理论上来讲,移植后最理想的情况是完全嵌合体,因此预处理方案十分重要,优先选择清髓的预处理方案,比如白消安(Bu)、环磷酰胺(Cy)、抗人胸腺细胞免疫球蛋白(ATG)组成的Bu-Cy-ATG(MAC)预处理方案[2,4]和氟达拉滨(Fu)、白消安(Bu)、抗人胸腺细胞免疫球蛋白(ATG)组成的Fu-Bu-ATG(MAC)预处理方案[4]。56%的SCN患者移植后中性粒细胞计数稳定,不再出现反复感染,无需G-CSF治疗。目前,预防GvHD常用的药物有环孢霉素(CSA)、霉酚酸酯(MMF)、甲氨蝶呤(MTX)、氟达拉滨(Fu)、他克莫司(Fk)、强的松(Pred)等药物[2]。FSCNR提出ELANE相关的中性粒细胞减少症患者的HSCT预后良好,移植后5年生存率为87.5%,移植生存率为95.0%,长期生存率为90.0%[2],目前GvHD是患者移植后预后差和死亡的主要原因[1-2]。

3.4其他 目前,治疗方式少且局限性多,因此一些基于CRISPR/Cas9 ELANE基因编辑[5]、NE抑制或增强G-CSF功能的新治疗方法可能在未来应用于临床。2021年EKATERINA等[9]研究提出烟酰胺与G-CSF协同治疗可改善疗效,2017年MAKARYAN等[27]提到一些内源性重组或合成的NE抑制剂已进入临床前阶段,如K562、MEG-01、MK0339等药物,抑制中性粒细胞弹性蛋白酶可能是未来的一种治疗选择,2020年有研究提到CRISPR/Cas9 介导的ELANE基因热源性校正编辑或突变的等位基因敲除治疗在ELANE突变患儿中的潜在应用,开发了一种基于CRISPR-Cas9-AAV6的基因修复方法[26]。2022年MAKARYAN又将NE抑制剂和基因编辑两种治疗方法通过人早幼粒细胞HL60进行实验比较,2种方法对SCN和CyN的疗效都有巨大潜力,但NE抑制剂作为口服药物似乎是更好的治疗方式[28]。

4 小 结

ELANE突变导致的中性粒细胞减少症有SCN和CyN 2种表现型,常染色体显性遗传,是罕见的原发性免疫缺陷病,突变位点多,以杂合错义突变为主。目前,发病机制研究不清,临床特征为起病早、感染反复、部位多,金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌和大肠杆菌感染最常见,呼吸系统、皮肤黏膜为最常见的感染部位,SCN比CyN的临床表现更加严重,部分患者恶性转化为骨髓增生异常综合征或急性白血病,甚至死亡。血常规、骨髓涂片有利于早期发现,基因分析不仅是诊断的“金标准”,还有助于预测临床表现,如V65del、N116D、C151Y、G185R、P205R、G214R、G214V突变、A233P合并V235WfsX、G192A合并193_195del都倾向于表现出更严重的症状,因此同一基因型表现为不同表型、基因型与临床症状的关系亟待研究。预防感染有助于患者的长期管理,G-CSF药物治疗有助于改善临床症状,HSCT是目前应用于根治此病的唯一治疗手段。NE抑制剂作为G-CSF的替代治疗药物仍处于非常早期的阶段,基因编辑也是未来治疗的研究方向。