细胞焦亡在肾间质纤维化中的作用机制①

孙珺 郭兆安 （山东中医药大学，济南250014）

肾间质纤维化（renal interstitial fibrosis，RIF）是众多肾脏疾病进展后期的病理改变，与肾功能损害程度密切相关，同时也是推测疾病预后的重要参考因素。已知持续的炎症反应是RIF的关键，近年来，一种以炎症反应为表现的细胞程序性死亡方式——细胞焦亡引起了研究者的关注［1］。细胞焦亡是细胞接受病原体和危险信号刺激后，依赖半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（caspase）和执行蛋白消皮素D（gasderminD，GSDMD）作用，引起细胞破裂并释放炎症因子的死亡模式。多项研究提示细胞焦亡是RIF的重要启动因素。因此系统地整理细胞焦亡在RIF中的作用机制和研究进展，可启发研究者对于RIF调节机制的新思考。

1 RIF

RIF是一个动态积累的病理过程，由四个联系紧密的阶段组成：启动、激活、执行和进展［2］。其中涉及了炎症细胞浸润、成纤维细胞增殖、细胞外基质（extracellular matrix，ECM）合成沉积和降解失衡等几个关键步骤［3］。在启动阶段，肾脏持续的炎症环境引起免疫细胞的迁移聚集，免疫细胞与激活的肾固有细胞释放多种细胞因子。在激活阶段，各种细胞因子触发肾内上皮-间质转化（epithelial-mesenchymal transformation，EMT），激活间质成纤维细胞和血管周围平滑肌细胞，同时募集循环中的常驻成纤维细胞。RIF执行过程中多种基质生成细胞接收了各种纤维化信号，执行ECM的生成组装和抗水解修饰，引起了Ⅰ型胶原蛋白、Ⅲ型胶原蛋白和纤维粘连蛋白等胶原纤维的沉积。RIF进展阶段肾小管细胞表现出多种损伤后反应，如增殖转分化、坏死、凋亡、焦亡等多种细胞事件，引发组织低氧，微血管密度降低，局部瘢痕形成，肾功能不可逆性丢失，最终发展为肾功能衰竭［4］。

2 细胞焦亡的分子机制

典型的细胞焦亡起始于炎性小体的组装激活，依赖半胱氨酸的内源性天冬氨酸蛋白水解酶caspase介导，经GSDMD切割细胞膜成孔，引起细胞破裂死亡，连同活性促炎因子IL-1β和IL-18释放［5］。细胞焦亡具有鲜明的特征：细胞依赖于caspase-1和caspase-4/5/11介导启动焦亡过程，结果表现为细胞膜成孔，细胞破裂死亡，过程伴随促炎因子IL-1β、IL-18释放，并由此引发更大的联级炎症反应［6］。细胞焦亡最早发现于免疫吞噬细胞，而后研究发现其他类型的细胞如上皮细胞内皮细胞和神经细胞等也均有存在［7］。

2.1 细胞焦亡的经典途径与非经典途径 由caspace-1介导的细胞焦亡属于经典焦亡途径，经过以下几个步骤：细胞在内外危险信号刺激下，组装激活炎性小体，将前体蛋白pro-caspase-1转化为活性形式的caspase-1。随后caspase-1进一步切割活化前体pro-IL-1β、pro-IL-18，产生成熟的IL-1β和IL-18。另一方面，caspase-1切割了裂孔形成蛋白GSDMD。暴露出N-末端效应结构域（GSDMD-NT），被切割后GSDMD-NT移位到质膜区，与脂质成分结合，形成裂孔，细胞肿胀（即气球状的焦小体）裂解，内容物释放［8］。其中包括具有生物活性的促炎因子IL-1β和IL-18（图1），以及各种免疫物质，从而诱发并加强宿主的炎症反应［9］。

图1 细胞焦亡的非经典途径和经典途径Fig.1 Non-classical pathway and classical pathway of pyroptosis

非经典的焦亡途径由人caspase-4/5和小鼠caspase-11直接识别结合脂多糖（lipopoly-saccharide，LPS），活化剪切GSDMD，形成质膜孔洞。被活化的caspase-4/5/11也可以间接通过衔接子蛋白（apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD，ASC）的辅助激活NLRP3，完成pro-caspase-1的剪切和活化，完成细胞焦亡［10］。

此外，活性caspase-4/5/11可激活Pannexin-1寡聚体依赖性膜通道，释放ATP，刺激细胞膜上嘌呤能2X7受体（P2X7R）调控的非选择性阳离子通道，引起离子异常外流，诱导类似成孔作用，导致细胞焦亡发生［11-12］。另外，RÜHL等［13］研究提示，caspase-11可借助嘌呤能系统，通过K+外流激活NLRP3炎症小体，部分参与细胞焦亡所致的肾脏损伤（图1）。

2.2 炎性小体的识别与激活 炎性小体是一种多蛋白复合物，由模式识别受体（pattern recognition receptors，PRRs）、ASC及效应蛋白caspase构成。胞外PRRs包括膜结合的Toll样受体（Toll-like receptors，TLRs）和C型凝集素样受体。胞内相关PRRs的代表有NOD样受体（NOD-like receptors，NLR）、AIM2样受体（absence in melanoma 2-like receptor，ALR）、RIG-Ⅰ样受体（RIG-Ⅰ-like receptor，RLR）和三联基序蛋白（tripartite motif，TRIM）［14］。其中NLR、ALR、RLR家族蛋白成员和TRIM蛋白是组成炎性小体的关键［15］。

炎性小体是焦亡启动的核心蛋白，其中NLRP3炎性小体是探讨细胞焦亡和RIF的焦点话题。激活NLRP3的因素涉及病原体自身，如某些细菌真菌和病毒［1］；各种代谢产物和内源性分子：ATP、高尿酸血症沉积的尿酸盐晶体、糖基化终产物等［16-17］；紫外线、石棉、硝基苯衍生物等外界的危险物化因素。激活NLRP3炎性小体的方式是多元化的，目前研究证据比较支持的有：①吞噬作用内吞的抗原物质引发溶酶体的损伤破裂，细胞自溶并被受体检测识别，诱导NLRP3活化；②P2X7-pannexin1关联通道开放引起的钾离子的外流可活化NLRP3［18］；③内质网（endoplasmic reticulum，ER）应激、线粒体功能失调与NADPH氧化酶的作用，使活性氧（reactive oxygen species，ROS）生成积累，导致NLRP3激活［19］。此外，GAIDT等［20］发现在人类单核细胞中LPS可依赖特殊的TLR4-TRIF-RIPK1-FADD-caspase 8通路，不借助K+外流实现NLRP3的激活，这可能是一种新的旁路途径。

3 细胞焦亡与RIF

3.1 细胞焦亡参与肾间质纤维化的炎症反应 细胞焦亡后以局部炎症反应为主要表现，可引发并维持炎症状态，放大炎症反应。炎症可以对抗刺激，发挥防御清除作用，保护肾脏。但长时间未消退的炎症会诱导进行性RIF。越来越多的研究表明细胞焦亡和后续炎症反应是RIF的重要参与者：对于5/6肾切除小鼠的研究提示NF-κB/NLRP3炎症通路介导的细胞焦亡影响了细胞外基质堆积，参与了肾脏的纤维化［21］。LUDWIG-PORTUGALL等［22］研究发现小鼠肾脏中树突状细胞NLRP3炎性小体活化及IL-1β和IL-18的产生与肾纤维化相关，炎性小体抑制剂CP-456，773可在早期减轻纤维化程度。此外，MIAO等［23］提出caspase-11作为上游信号，活化caspase-1和IL-1β成熟，促进间质纤维化。

FRANKE等［24］在消除巨噬细胞影响后，研究单侧输尿管梗阻（unilateral ureteral obstruction，UUO）模型小鼠时发现肾小管上皮细胞存在caspase-1和IL-18表达，说明细胞焦亡引发的炎症反应不仅涉及免疫细胞，也与肾固有细胞的激活有关。UUO肾损伤模型中NLRP3基因敲除后的小鼠部分抑制了IL-1、IL-18和caspase-1的成熟，表现出较少的肾小管损伤、肾小管间质炎症和纤维化［25］。在抑制缺血再灌注损伤小鼠IL-18表达后，小鼠表现出肾小管损伤减轻，中性粒细胞和巨噬细胞聚集度下降，下游的促炎分子表达降低，肾功能保存更为完整［26］。这证实了焦亡的免疫细胞和肾固有细胞释放出的IL-1β和IL-18是引发炎症和肾损伤的核心分子，能够吸引循环免疫细胞迁移集聚。IL-1β可刺激肾脏细胞生成促炎介质，加强炎症效应。IL-18位居炎症级联反应中的核心，能够调控IL-1β、TNF-α产生，上调细胞间黏附分子-1，参与肾脏炎症反应和RIF［27］。综合看来，细胞焦亡引发的炎症反应是肾脏慢性损伤和RIF的重要环节。

3.2 细胞焦亡与RIF中的免疫细胞 细胞焦亡后，内容物流出，caspase蛋白和IL-1β、IL-18的分泌引起多种免疫细胞的募集激活和细胞因子表达，这是启动间质纤维化的重要方式。巨噬细胞分为M1和M2两种表型，其中M1多见于炎症伊始，M2参与组织修复。有实验证明炎性小体激活后，M1巨噬细胞浸润增加，导致炎症和间质纤维化的发生［28］。M1巨噬细胞可以通过产生细胞因子IL-1β、TNF-α、IL-12等，诱导更多的白细胞群体募集。M2表型分泌多种促纤维化因子，如血小板衍生生长因子（platelet derived growth factor，PDGF）、胰岛素样生长因子-1和TGF-β等，可通过募集和激活成纤维细胞，促进ECM沉积，诱导上皮细胞间充质转换等方式促进肾纤维化［29］。此外M2细胞可使巨噬细胞向成纤维细胞转变，分泌ECM，加速纤维化进程［30］。

树突状细胞作为间接参与者，能够将抗原提呈给T细胞，诱导CD4+T细胞分化［31］；还能和巨噬细胞构筑广泛连续的免疫吞噬网络系统，作为前哨进行监视，驱动免疫活动［32］。依赖于caspase-1介导产生的细胞因子IL-1β和IL-18影响CD4+T细胞的分化，参与指导辅助性T淋巴细胞-1和辅助性T淋巴细胞-17发生反应。而NIKOLIC-PATERSON［33］的研究指出T细胞可直接作用于肾成纤维细胞和周细胞，促进细胞的增殖和分化，并诱导其迁移聚集，引起肾间质基质的沉积和降解失衡。T细胞还可通过改变巨噬细胞纤维化表型参与RIF进展［33］。在多种进行性肾脏疾病中，肥大细胞数量明显增加，一方面肥大细胞衍生的肝素，可以抑制肾成纤维细胞TGF-β1的产生，并减少成纤维细胞浸润，起到抑制纤维化的作用。同时肥大细胞能够激活肾素-血管紧张素系统，导致血管阻力增加，其特有的蛋白酶和纤维蛋白分子的表达也会加速RIF的进展［34］。

3.3 细胞焦亡与肾固有细胞 肾固有细胞的焦亡与RIF存在多种关联。文思［35］的实验发现，VX-765处理高糖状态下的肾小管上皮细胞，焦亡的比例显著降低，肾皮质中GSDMD、IL-1β、胶原蛋白-Ⅰ和纤连蛋白表达下调，证实了VX-765通过抑制肾小管上皮细胞焦亡，发挥保护肾脏纤维化作用。WANG等［36］在糖尿病小鼠实验中发现IL-22可通过下调肾脏NLRP3/caspase-1/IL-1β途径，剂量依赖性地显著降低肾脏细胞裂解物中纤维连接蛋白、Ⅳ型胶原、波形蛋白和α-SMA表达，进而缓解肾小球系膜和间质纤维化。

细胞焦亡后免疫细胞和肾固有细胞分泌TGF-β1、TNF-α、PDGF、FGF-2等因子，依赖Smad2/3磷酸化和MAPK途径诱导EMT发生［37-38］。EMT是RIF的重要途径，30%的成纤维细胞通过EMT衍生自肾脏的管状上皮细胞［37］。GONG等［39］在对NLRP3进行敲除和siRNA转染后，由TGF-β1介导的波形蛋白和α-SMA的生成较先前明显减少，上皮钙黏附素上调，上皮细胞的形态转化减轻。BANI-HANI等［3］依据实验提出IL-18能够独立诱导EMT和肾纤维化，不依赖于下游TGF-β1或TNF-α的产生。EMT发生后，上皮细胞失去特性标志物，细胞表型改变，表现出新的间充质特性，α-SMA与胶原蛋白、纤维连接蛋白生成，并迁移积累，从而引起RIF［40-41］。

肾固有细胞的焦亡除了遵循上述“焦亡-炎症-纤维化”的方式启动RIF外，与RIF还有更为紧密直接的联系。NLRP3不通过白细胞介素的作用，而是直接与肾小管上皮细胞内的TGF-β信号相互调节［42］。TGF-β/Smad途径介导并调节了NLRP3表达，而且NLRP3和Asc同样参与了TGF-β介导的Smad2和Smad3磷酸化通路。通过这种方式，NLRP3炎性小体可以成为EMT过程的独立影响因素。

3.4 RIF化中细胞焦亡与自噬的相互调节 自噬是纤维化进展的重要调节因素，自噬-溶酶体途径能够通过胞吞纤连蛋白，激活溶酶体进行降解，以此调控细胞外基质的代谢平衡。研究表明，二氢杨梅素可调控糖尿病大鼠中miR-155-5p/PTEN信号通路和PI3K/AKT/mTOR信号通路，促进自噬，减少细胞外基质合成，增加细胞外基质分解，降低RIF［43］。XU等［44］实验检测到自噬激活剂MAP1S的缺失导致纤连蛋白的自噬清除过程受抑制，细胞外基质沉积，同时MAP1S能够抑制肾皮质近曲小管上皮细胞caspase-1介导的细胞焦亡。LU等［45］发现姜黄素通过调节UUO大鼠自噬，减少ROS的产生和线粒体DNA损伤，降低活性NLRP3炎性小体的比例，进而发挥其抑制纤维化的作用。自噬缺陷细胞表现出受损线粒体的清除障碍、大量的ROS蓄积，同时线粒体DNA释放，激活NLRP3炎性小体，上调caspase-1介导的细胞焦亡发生和IL-1β和IL-18的生成［46］；另一方面，自噬体可直接抑制炎性小体的组装过程，自噬双层膜隔绝吞噬pro-IL-1β、ASC等组件后，与溶酶体形成自溶酶体，并靶向其降解，从而下调caspase-1处理的底物浓度，抑制焦亡的后续反应［47］（图2）。这说明自噬可能通过直接影响ECM和间接调控焦亡两种方式参与RIF过程。

图2 细胞自噬参与调控细胞焦亡的机制Fig.2 Mechanism of cell autophagy involved in pyroptosis

但在梗阻性肾病小鼠中，LIVINGSTON等［48］发现了相反的结果：激活细胞自噬后，引发了明显的炎症反应和肾小管细胞死亡，促进间质纤维化的进行。还有研究发现氧化应激损伤可影响线粒体功能，引发自噬依赖性细胞死亡，促进肾小管细胞分解、肾小管萎缩坏死和肾纤维化形成［49］。自噬可能通过协同激活肾小管细胞死亡、加强间质的炎症反应，上调如碱性成纤维细胞生长因子-2和纤维连接蛋白-1等促纤维化分泌蛋白，正向影响RIF的进展。RIF中自噬和焦亡并非单一拮抗的关系，其中存在多种串扰关联，保持动态平衡，抵抗外来刺激和损伤。一方表达太过或不及，均能够导致稳态失调，肾脏发生病理改变，诱发肾功能不全和间质纤维化的发生。

4 总结和展望

综上所述，细胞焦亡在RIF的进展中扮演着极其重要的角色，目前研究以NLRP3、caspase-1介导的焦亡途径为主要研究切入点。目前针对细胞焦亡的化学药物、基因靶向、中草药等治疗手段预防或改善了初期RIF，保护了肾功能，渐渐表现出了一定的治疗意义，但具体的药理作用仍在探索中，缺少清晰详尽的定论。现存研究表明细胞焦亡在一定程度上影响了炎症反应和RIF的结果，进一步明确细胞焦亡与RIF之间的分子生物学关联和作用机制，更有针对性地施以靶向治疗，或许是日后研究的目标与方向。