区内不同采挖地榜那（铁棒锤）幼苗和叶子中乌头类双酯型生物碱含量的测定*

巴桑德吉 白玛拉宗 旦增央金 边巴顿珠 色珍 贡布

西藏自治区藏医院开发应用研究所，西藏 拉萨 850000

增巴，收载于《中华人民共和国卫生部药品标准·藏药（第一册）》［1］，其汉语名称翻译为铁棒锤幼苗，基源为毛茛科植物铁棒锤A.pendulum、伏毛铁棒锤A.flavum 的干燥幼苗。功能主治主要为清热退烧，止痛，用于流感、瘟疫、热毒、疮疔。榜那（铁棒锤）叶子法定标准中没有收载，《德庆藏药》［2］榜那项下记载“叶，味苦涩，性微凉或平，有小毒。能消炎、止痛、用于发热性疼痛，头痛、牙痛”。近几年，检测榜那块根中乌头类双酯型生物碱报道较多［3-6］，但对其幼苗和叶子中乌头类双酯型生物碱检测几乎没有报道。因此，本课题组对榜那（铁棒锤）幼苗和叶子中乌头类双酯型生物进行了检测，试验结果显示山南浪卡子县卡热乡采集的榜那（铁棒锤）幼苗和叶子中未检测出乌头类双酯到双酯型生物碱；山南浪卡子县亚堆乡和拉萨墨竹工卡县日多乡采挖的榜那（铁棒锤）幼苗和叶子中检出乌头碱，而新乌头碱和次乌头碱未检出。榜那幼苗和叶子中乌头碱含量较高，尤其是幼苗中乌头碱含量在0.6%以上，临床应用时需减量或炮制使用。由于榜那幼苗和叶子中未检测到新乌头碱和次乌头碱，重复性和回收率以及定量限和检测限等试验均以乌头碱作为检测目标。

1 材料

1.1 仪器

岛津LC-20AT 高效液相色谱仪；SPD-M20A 检测器；超纯水机；旋转蒸发器；循环水真空泵；药典筛；分析用的电子天平；粉碎机；分析用的过滤器。

1.2 试剂、试药

水为超纯水，甲醇、乙酸铵、冰乙酸等试剂均为色谱纯。乌头碱（批号DSTDWOOO602）购于乐美天医药/德思特生物研;新乌头碱（批号110799-201609）、次乌头碱（批号110798-201609）购于中国食品药品检定研究所；6 批样品分别采挖于拉萨墨竹工卡县日多乡周边、山南浪卡子县卡热乡周边、山南浪卡子县亚堆乡水源周边，上述样品均经西藏自治区藏医院格桑巴珠专家鉴定。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：岛津碳18 柱（2.50cm×0.046cm，5μm）；流动相：A 为C4H8O-C2H3N（15:25），B 为0.1mol·L-1醋酸铵溶液（每1000mL 中加冰乙酸0.5mL）为流动相，梯度程序洗脱；流速：1.0mL/min；检测波长：235nm。

表1 梯度洗脱程序

2.2 溶液的制备

2.2.1 混标对照品溶液的制备。准确称定新乌头碱、次乌头碱、乌头碱对照品适量，加异丙醇-三氯甲烷（1:1，体积比）混合液制成1mL 含0.3345mg 新乌头碱、0.3165mg次乌头碱、1.2275mg乌头碱。

2.2.2 供试品溶液的制备。分别取不同三地采集的榜那（铁棒锤）幼苗和叶子（过三号筛）约1g，准确称定，置锥形瓶中，准确加入乙酸乙酯-异丙醇（1:1,体积比）混合溶液5mL 和氨试液5mL，浸泡10mL，再加入乙酸乙酯-异丙醇（1:1，体积比）混合溶液45mL，称定重量，超声处理（功率300W，频率40kHz；水温在25 以下）30 分钟，放冷、摇匀、滤过。准确量取续滤液25mL，40℃以下减压回收溶剂至干，残渣精密加入异丙醇-三氯甲烷（1：1，体积比）混合溶液5mL 溶解，滤过，取续滤液，即得。

2.3 线性关系考察

取“2.2.1”项下混标对照溶液，用移液管精密量取混标对照品溶液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、0.9、1mL，分别置于1mL 量瓶中，加C3H8O-CHCL3（1：1，体积比）溶解并稀释至刻度，摇匀，即得7 个不同浓度的对照品溶液。在上述色谱条件下，分别进样取10μl，测定峰面积，绘制标准曲线，得标准曲线,线性关系良好，新乌头碱回归方程Y=1.18946×107+19357.9（0.9999）,线性范围0.3345～3.3345ug；次乌头碱回归方程Y=1.25962×107+21658.7（r=0.9999），线性范围0.3165～3.165ug；乌头碱回归方程为Y=1.11739×107+71598.5（r=0.9999），线性范围1.2275～12.275ug。

2.4 精密度试验

准确吸取浓度为新乌头碱0.2007mg/mL、次乌头碱0.1899mg/mL、乌头碱0.7365mg/mL混标对照品溶液10μl，按上述色谱条件，连续进样6 次，测得新乌头碱RSD＝0.244%（n＝7）、次乌头碱RSD＝0.159%（n＝7）、乌头碱峰面积的RSD＝0.590%（n＝7），表明仪器精密度良好。

2.5 稳定性试验

取同一份混标对照品溶液适量，分别放置0、2、4、6、8、10、12、24小时后，按上述色谱条件，进样量10μl，测定峰面积。结果显示，新乌头碱峰面积积分值RSD为0.222%（n=8）次乌头碱峰面积积分值RSD 为0.353%（n=8）乌头碱峰面积积分值RSD 为0.532%（n=8），表明对照品溶液基本在24h内稳定。

2.6 重复性试验

取同一批榜那叶子粉末适量，约1g（过三号筛）共6 份，精密称定，按上述供试品溶液的制备方法制备，再按上述色谱条件进样测定，测定峰面积。结果显示，样品中乌头碱的RSD＝1.624%（n＝6），表明本方法重复性较好。

2.7 加样回收试验

取山南浪卡子县亚堆乡采挖的榜那叶子（过三号筛）约0.5g粉末，共6份，精密称定，于每份样品中加入适量乌头碱对照品溶液，按上述供试品溶液的制备方法制备，再按上述色谱条件进样测定，回收率为95.23%，试验数据见表2。

表2 亚堆榜那（铁棒锤）叶子中乌头碱回收率试验测定结果表

2.8 定量限与检测限测定

以乌头碱检测为主，制备乌头碱对照品溶液，结果显示，其定量限为9.712μg/mL；检测限为2.305μg/mL。

2.9 样品含量测定

取不同采挖地榜那（铁棒锤）幼苗和叶子粉末各1 g（过三号筛），精密称定，分别按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按上述色谱条件进样测定，以峰面积计算样品中乌头碱的含量，结果见表3和图1。

图1 对照品混标溶液（A）；山南浪卡子县亚堆乡采集的榜那（铁棒锤）幼苗（B）和叶子（C）；拉萨墨竹工卡县日多乡周边采集的榜那幼苗（D）和叶子（E）；（1）新乌头碱；（2）次乌头碱；（3）乌头碱

表3 不同地区购置及采集榜那（铁棒锤）药材中乌头碱含量测定表

3 结果

在该色谱条件下能检出山南浪卡子县亚堆乡和拉萨墨竹工卡县日多乡采挖的榜那（铁棒锤）幼苗和叶子中的乌头碱，其中山南浪卡子县亚堆乡采挖的榜那（铁棒锤）幼苗和叶子中的乌头碱含量分别为0.66%和0.46%；拉萨墨竹工卡县日多乡周边采挖的榜那（铁棒锤）幼苗和叶子中的乌头碱含量分别为0.67%和0.34%.2019 年课题组对上述两地采挖的榜那根中乌头碱做了检测，试验结果为山南浪卡子县亚堆乡和拉萨墨竹工卡县日多乡采挖的榜那块根中的乌头碱含量分别是0.56%和0.34%，从乌头碱含量比较榜那不同药用部位毒性分别为：幼苗＞根＞叶子，藏医大多数专家认为榜那（铁棒锤）的块根毒性最大，其次是幼苗，法定标准《中华人民共和国卫生部药品标准·藏药（第一册）》［6］中榜那（铁棒锤）项下的性味中记载“本品有大毒”，而其收载的榜那（铁棒锤）幼苗项下的性味中记载“本品有毒”；《德庆藏药》［7］榜那幼苗项下记载“根（9—10 月采挖），效用同幼苗，但毒性较大。”这些记载与本次试验结果相反，由于法定标准中没有榜那块根及幼苗中乌头碱的定量测定，上述结果还需进一步研究。但考虑临床安全性，建议在使用榜那块根及幼苗时需进行炮制或减少用药剂量。

不同三地采集的榜那叶子和幼苗中均没有检测到新乌头碱和次乌碱，其中山南浪卡子县卡热乡采挖的榜那幼苗和叶子中乌头碱也未检测到，为了进一步验证该结果，在供试品制备过程中分别添加了新乌头碱和次乌头碱、乌头碱对照品，结果显示，供试品中能检出保留时间与上述对照品相应峰，说明如果样品中有新乌头碱和次乌头碱和乌头碱，该制备方法和色谱条件均能提取和检测。2019 年课题组对上述三地采挖的榜那块根进行了上述对照品检测时，除了山南浪卡子县卡热乡采挖的榜那块根中未检测到，其他两地采挖的榜那块根中均检出乌头碱和次乌头碱，但次乌头碱含量极低［8］。多数藏医专家认为生长于山南浪卡子县卡热乡的榜那药材临床使用时功效比其它地采挖的榜那药材理想，而且毒副作用小，其毒副作用是否与其不含乌头碱有关，还需药效试验验证。

4 讨论

榜那幼苗为藏医习用药材，地方标准中有收载，而榜那叶子法定标准中未收载。《德庆藏药》收录的榜那幼苗中将榜那叶子称为榜那幼苗的别名，并且记载幼苗和叶子的功效等同。不知是否为翻译上的误差，还是临床使用时两种混用，还需进一步考证文献资料。

试验中发现，流动相B 的PH 值对色谱峰的保留时间有影响，因此，需要PH 计控制ph 值。在供试品的制备过程中，异丙醇-乙酸乙酯（1:1，V/V）混合溶液和氨试液需同时加入，否则单独加入氨试液会使药材粉末结块，溶剂不能充分浸提，回收率达不到95%以上。

色谱条件选择时，参考［9-12］文献方法检测榜那中乌头类双酯型生物碱时，均出现乌头类双酯型生物碱不能完全分开，或样品中在目标峰周边有其他峰干扰，通过调节上述流动相的比例及梯度洗脱时间，未得到理想的结果。另外，文献［13］测定榜那中乌头类双酯型生物碱时，发现用“草乌”的色谱条件样时，供试品中的乌头碱能完全分离，但新乌头碱、次乌头碱和乌头碱混标对照品稳定性试验出现干扰峰，随时间的放置主峰周边出现小峰，重复试验，结果相同，疑似混标对照品发生分解。用“制川乌”色谱条件时，供试品中的乌头碱能完全分离，梯度洗脱时间缩短10 分钟，对供试品中各目标峰无影响。

供试品制备方法，由于样品为榜那的幼苗和叶子，所以含叶绿素较多，为了除去叶绿素，又不影响其活性成分，参考文献［14，15］先后用了不同的提取方法：氨试液浸泡样品，直接用乙酸乙酯提取，滤液做供试品；少量氨试液和乙醚先浸泡样品，然后用乙醚、氯仿萃取多次，再用0.05mol/L 提取，蒸干，残渣用0.01%盐酸-甲醇溶解；乙醚-氯仿（3：1）混合液与氨试液浸泡样品过夜，再用混合液萃取多次，上述方法虽然都除去了叶绿素，但乌头碱的含量均小于药典“制川乌”提取方法。另外，为了减少试验过程中的误差，样品用氨试液浸泡，然后用异丙醇-乙酸乙酯（1:1，V/V）直接提取，续滤液作为供试品，但试验结果显示乌头碱含量明显小于药典“制川乌”提取方法。