生物质炭施用对水稻土有机质分子结构和组成的影响

宋凯悦，刘志伟，刘 伟，马睿凌，李世贤，卞荣军，郑聚锋*，潘根兴

1.南京农业大学农业资源与生态环境研究所，江苏 南京 210095

2.江苏省有机固体废弃物资源化协同创新中心，江苏 南京 210095

土壤有机碳(SOC)库是陆地生态系统最大的有机碳库，在调节土壤功能、保障作物产量与减缓气候变化等方面发挥着重要作用[1].据估算，全球表层土壤(0～20 cm)SOC 储量约为615 Pg[2]，若深度延伸至1 m，其储量达1 500 Pg[3].尽管深层土壤(20～100 cm)SOC 密度较低，但因储量巨大，其微小变化将对全球生态系统碳循环过程产生重大影响[4].在过去20 年间，表层SOC 动态已经受到了极大的关注[5-6]，但有关深层SOC 库动态的认识还相对不足[7].因此，研究深层SOC 动态对于认识土壤碳循环过程、促进土壤固碳与减缓气候变化具有重要意义.

生物质炭(BC)是生物质材料在完全厌氧或部分限氧条件下热解而成的高度芳香化的固态富碳物质[8]，其作为土壤改良剂，具有改善土壤肥力、提高有机质含量与作物产量以及降低温室气体排放的作用[8-10].已有研究[11-14]表明，BC 施用影响表层土壤有机质的转化、分子组成和结构.例如，龙杰琦等[13]利用傅里叶变换红外光谱(FTIR)技术研究发现，长期(9 年)玉米秸秆炭添加促使全土和大团聚体内有机质结构趋于脂肪化，且增强了微团聚体中有机质的稳定性；Chen 等[14]利用连续提取-气质联用(GC/MS)的方法分析了玉米秸秆炭施用2 年后稻田表层土壤有机质分子组成变化，发现BC 处理增强了表层土壤活性碳库中分子和官能团的多样性，而且提升植物源有机质分子(主要是脂类)的含量.此外，BC 施用于土壤后，以缩合芳香环结构为主的碳源结构会发生氧化裂解，产生可溶性有机碳(DOC)[15]，同时，物理崩解生成的炭颗粒(纳米级)，在田间灌溉和降雨的作用下，将进一步影响其在土壤剖面中的迁移[16-17].然而，目前关于深层土壤有机质分子结构和组成对表层土壤BC 添加的响应认识还相对不足.

水稻土是我国一种独特的水耕熟化人为土壤，稻田农业是保证我国粮食安全的主要支撑.同时，水稻土还具有较高的碳密度，对农业碳库的贡献不可小觑[18].由于长期受水分管理的影响，水稻土表层施用BC 可能因水分运动而影响深层SOC 库的组成[19]，因此，本研究以BC 改良4 年后的水稻土为研究对象，采用FTIR 和Py-GC/MS 技术对土壤有机质分子结构和组成进行分析，从定量和定性角度探究BC 施用下不同深度土壤有机质分子结构和组成的变化，这对于认识和评估不同深度土壤中BC 的固碳效应及预测未来碳库变化具有重要意义，同时也为农业废弃生物质资源合理利用提供参考依据.

1 材料与方法

1.1 试验地概况

BC 田间试验开始于2016 年，地点位于江苏省宜兴市(31°41′N、119°73′E).该地区属亚热带湿润季风气候，年均降水量1 177 mm，年均气温15.7 ℃.土壤类型为第四纪湖积物发育的典型脱潜型水稻土，该地区传统的种植制度为稻-麦轮作.供试土壤基本性质：SOC 含量23.06 g/kg，全氮(TN)含量1.87 g/kg，速效磷含量19.53 mg/kg，速效钾含量129.7 mg/kg，pH=5.70，容重1.32 g/cm3.

1.2 试验设计

田间试验包含两个处理：对照(CK)和施用生物质炭(BC)处理.采用完全随机区组设计，每个处理3次重复，各小区面积为30 m2(5 m×6 m)，且各小区间由0.5 m 宽的缓冲区进行分隔.所用BC 为玉米秸秆在450 ℃限氧条件下热解得到，其基本性质：有机碳含量413.0 g/kg，TN 含量7.97 g/kg，速效磷含量2.36 mg/kg，pH=8.79.在2016 年水稻种植前BC 按15 t/hm2的用量一次性均匀施入土壤表层，并翻耕均匀至0～15 cm.水分管理、耕作、施肥等均遵循当地田间管理措施.

1.3 土壤样品采集

2020 年6 月小麦收获后，在田间挖取剖面，依据水稻土发生层次划分为耕作层(A 层，0～15 cm)，犁底层(Ap 层，15～28 cm)和潴育层(W 层，28～50 cm)，分别在每个小区3 个土层中按5 点法随机取样.新鲜土样经充分混合后储存于不锈钢罐运回实验室.在土壤样品处理前，剔除可见的植物残体和石砾，然后将采集的样品过2 mm 筛后分为两份：一份进行自然风干，用于土壤理化性质和有机质分子组成测定；另一份用于土壤DOC 含量分析.

1.4 土壤基本性质测定

土壤和BC 的理化性质分析参照鲁如坤[20]描述的方法.有机碳含量采用重铬酸钾氧化-外加热法测定；TN 含量采用半微量开氏法测定；土壤pH 采用pH 计测定(水土比为2.5∶1)；土壤容重采用环刀法测定；速效磷含量采用NaHCO3浸提-钼锑抗比色法测定；速效钾含量采用NH4OAc 浸提-火焰光度法测定；DOC 含量采用水浸提-TOC 分析仪(multi N/C 2100，德国)测定.

1.5 土壤红外光谱分析

将土壤样品在45 ℃烘箱中烘干，尽可能降低水中羟基对测试结果的干扰[21].将2.0 mg 土样和200 mg 光谱纯溴化钾置于玛瑙研钵中充分研磨过筛，混匀后压片.使用傅里叶红外光谱仪(Nicolet 6700 FTIR，美国)进行样品扫描，红外光谱测试范围介于400～4 000 cm-1之间，样品测定前，用溴化钾压片来扣除背景.表1 显示了该研究光谱中观察到的吸收峰和文献报道中吸收带的官能团分配.

表1 红外吸收峰的主要归属Table 1 Main attributions of infrared absorption peaks

1.6 土壤有机质分子组成分析-热裂解气相色谱-质谱法

根据Spaccini 等[26]描述的方法并稍加修改，采用四甲基氢氧化铵(TMAH)对样品进行甲基化，再通过离线热裂解-气相色谱质谱联用(Off-line Py-GC/MS)处理分析.简言之，称取1.0 g 研磨过100 目筛的土壤样品于石英槽中，移液枪缓慢加入1 mL 25% TMAH溶液(溶于甲醇)使土壤均匀润湿，对样品进行甲基化，然后置于真空干燥器中过夜.干燥后的样品与石英槽一同放入耐高温玻璃管中，并放入裂解炉进行有机质热裂解.将热解炉升温至400 ℃并保持30 min，以氦气(30 mL/min)为载气，裂解产物由氦气流载出，依次进入两个分别装有100 mL 氯仿的圆底烧瓶，该装置用于收集热解产物.待裂解炉完全冷却后，将含有热裂解产物的氯仿溶液混合后进行旋转蒸发，再用不超过2 mL 的色谱纯氯仿溶液将样品复溶后转移至1 mL 的玻璃瓶中，采用氮气吹干.最后加入100 μL 十九烷酸(1 000 mg/L)内标和900 μL 色谱纯氯仿将样品再次复溶后转至色谱进样瓶，采用气相色谱-质谱联用仪(GC/MS，Agilent 7890，美国)进行分析.

将TurboMass Ver 4.5.0 与Agilent Masshunter NIST 17.0 数据库结合，根据质荷比(m/z)，在每个土壤样品中均鉴定出170 多种热解产物.利用来自特征数据集的Py-GC/MS 经验公式，基于其H/C 和O/C比率生成Van Krevelen 图.热解产物的相对百分比是将第1 个对照处理设定为100%，然后在对照值的基础上进行归一化.根据Py-GC/MS 分析结果计算得到有机质分子相对丰度，再对热裂解产物获得的分子按官能团类型进行分类.其中，醇类(AC)、氨基化合物(AD)、胺类(AM)和脂肪族酯(ES)属于不稳定类化合物，多酚类(PH)和杂环氮化合物(HN)属于亚稳定类化合物，烷烃类(AL)和醚(ET)属于最稳定化合物[27].

1.7 数据处理

采用SPSS 26 软件进行单因素方差分析(Duncan′s post-hoc 检验，P<0.05)，确定同一处理不同土层间指标差异的显著性，通过t检验比较同一土层不同处理间的差异显著性(P<0.05).采用Origin 2018 软件对红外光谱图像进行吸光度转化、图像光滑和基线校准.

2 结果与讨论

2.1 生物质炭施用下不同深度SOC 和DOC 含量的变化

图1 所示，与CK 处理相比，BC 处理的A 层SOC含量增加了13.0%，然而，BC 与CK 处理之间Ap 层和W 层SOC 含量无明显差异，表明BC 施用能显著促进表层土壤固碳.究其原因主要是：①BC 富含惰性有机碳，其进入土壤不仅可以增加SOC 含量，而且还提高对生物降解的抵抗力[9,28]；②BC 在表层土壤中长期存在增强了对SOC 的物理保护作用.由于BC具有较高孔隙度和较强吸附能力，SOC 被吸附于BC孔隙或BC 表面，这阻隔了孔隙内的SOC 与微生物及其胞外酶的接触[29-30]，随着BC 的老化，BC 表面的羧基可能进一步增强有机-BC-矿物的相互作用，从而促进了土壤团聚体形成而增强了土壤对原SOC 的物理保护作用，进而抑制了对原SOC 的分解(即产生负激发效应)[31-32].③BC 施用因提高肥力而促进植株和根系生长，这将增加植物源碳向表层土壤的输入量，因而可以促进表层土壤碳固定[6].然而，由于稻田土壤中存在致密的Ap 层，植物根系、BC 碎片等有机物进入表层，除了易分解部分被快速矿化外，难降解部分或大颗粒部分的纵向淋失量也较少[33]，因而在深层土壤(Ap 层、W 层)SOC 总量的变化不明显.

图1 不同处理下各土壤深度SOC 和DOC 含量Fig.1 SOC and DOC contents at different soil depths under different treatments

DOC 是土壤碳库中最活跃的碳组分，在土壤生物地球化学过程中发挥着重要作用，其含量变化与有机质输入及微生物利用密切相关[12,34].本研究中，与CK 处理相比，BC 处理的A 层和Ap 层DOC 含量分别显著增加22.3%和20.8%，但对W 层DOC 含量影响不显著.由于BC 的施用年限较长，本身的活性组分已被分解，因此，A 层和Ap 层中DOC 含量增加主要归因于BC 长期施用后的间接效应.研究表明，BC改良土壤能提高植物根系生物量并能产生较多的根系分泌物[35]，而且根系生长可能破坏大团聚体，释放其中的活性有机碳，这些有机物均可能成为土壤DOC 潜在的来源[36].He 等[36]研究表明，活根及其分泌物破坏了土壤有机质超分子的稳定性，从而提高了土壤DOC 含量.因此，长期BC 施用影响下的根际过程可能是土壤A 层和Ap 层中DOC 释放的重要驱动因素.然而，受碳源限制，深层土壤微生物对碳的需求高于表层[37]，虽然BC 施用提高了W 层土壤DOC 的输入，但其作为易分解碳源在淋溶过程中易被微生物迅速利用，因此，W 层土壤DOC 含量未发生显著变化.

2.2 生物质炭施用下不同深度土壤有机质红外光谱分析

如图2 所示，随土壤深度的增加，1 432 cm-1处的吸收峰逐渐增强，表明芳香族化合物的相对丰度在逐渐增加.这主要是因为表层土壤有机质在好气条件下矿化率较高，随着土壤深度增加，土壤中氧气含量逐渐降低，多酚氧化酶活性受到抑制，导致芳香族物质(如木质素)的富集，因而增加了深层土壤1 432 cm-1处的相对峰强度[23].

图2 不同处理下各深度土壤的红外光谱特征Fig.2 Infrared spectral characteristics of soil at different depths under different treatments

中红外光谱分析表明，长期BC 施用增强了土壤有机质化学组成的稳定性.与CK 处理相比，BC 处理增强了各土层1 635 cm-1处吸收峰相对强度，而A 层和Ap 层中1 034 cm-1处吸收峰相对强度有所降低.这表明BC 施用增加了各土层芳香族碳组分的相对峰强度，即更稳定的有机化合物产生富集[23]；而纤维素等多糖中C-O-C 键的拉伸振动减弱，即不稳定碳水化合物有所降低[25]，这些结果进一步表明BC 长期施用降低了土壤碳代谢，这可能是其增强土壤碳库稳定性的一个重要机制[38].这是由于BC(玉米秸秆)本身含有较多的羧基碳[27]，而且富含高度浓缩的芳香环结构，生物稳定性强，因而施入土壤后难降解性芳香族化合物的相对丰度得到提高[8]；同时，BC 可能促进了芳香族化合物的向下迁移，进入深层土壤的芳香族物质易与铁氧化物发生络合反应，不易被微生物接触利用[39].因此，1 635 cm-1处吸收峰相对强度在BC处理下明显增加.此外，BC 中丰富的孔隙结构和较大比表面积，为微生物的生长代谢提供了良好的生存环境，微生物活性及代谢能力增强，加快了土壤中植物源的糖类、氨基酸等活性物质的分解，这可能导致了多糖及碳水化合物峰强度的相对下降[15].

2.3 生物质炭施用下不同深度土壤有机质分子组成的变化

利用Py-GC/MS 技术对不同深度土壤有机质分子组成进行分析，发现水稻土有机质分子丰度随土层深度的增加而降低(见图3).土壤有机质组分的O/C在0～0.5 之间，O/H 在0.6～2.1 左右.参考Van Krevelen图[40]划分标准，本研究区土壤有机质分子组成以脂质及高度不饱和脂质化合物为主，化合物类型主要为脂肪族乙醇、脂肪酸、氨基化合物、烷烃类等.醇类、氨基化合物、胺类、脂肪族酯、脂肪酸、杂环氮化合物、苯酚酯和多酚类这8 种化合物在总成分中占比超过80%(见图4).在CK 处理中，随土壤深度的增加，烷烃类、杂环氮化合物、苯酚酯和多酚类相对丰度呈增加趋势，而氨基酸、醇类、氨基化合物、胺类、糖类等物质的相对丰度呈降低趋势.在BC 处理中，上述官能团表现出相似的变化规律，即不稳定组分随土层深度的增加而降低，较稳定组分的相对丰度则高于表层(见图4).其中，烷烃类相对丰度的增幅较大.研究表明烷基碳来源于植物生物聚合物(角质和蜡)和微生物代谢产物，其疏水性与土壤中难降解有机质组分密切相关[41]，并且其比例随土壤深度的增加而增加[42]，烷基化合物的留存扩大了土壤有机质中疏水性区域，进而增强了SOC 的封存[41].同时，稻田土壤微生物可能对氨基酸和胺类的利用较高[27]，被微生物难利用的疏水性分子和芳香化合物相对丰度则随土壤深度的增加而增加，因而土壤有机质分子组成趋于稳定.

图3 热解GC/MS 鉴定的有机质分子组成Van Krevelen 图Fig.3 Van Krevelen plot of molecular composition of organic matter identified by pyrolysis GC/MS

图4 热解GC/MS 鉴定的化合物类别归一化相对丰度Fig.4 Normalized relative abundance of compound classes identified by pyrolysis GC/MS

与CK 处理相比，BC 施用增加了各深度土壤有机质分子丰度，并且BC 施用下的土壤有机质分子组成中仍以脂质及高度不饱和脂质化合物为主，但木质素衍生的化合物及缩合芳香化合物丰度较对照处理有所增加(见图3).在A 层土壤中，BC 处理的烷烃类、胺类、脂肪酸、杂环氮化合物、苯酚酯和多酚类相对丰度较CK 处理显著增加，增幅分别为127.8%、52.4%、12.0%、37.8%、76.6%和30.2%.而在Ap 层和W 层土壤中，BC 处理的烷烃类、胺类、杂环氮化合物、苯酚酯及多酚类的相对丰度较CK 处理也有明显增加，但增幅有所下降(见图4).这主要存在以下原因：首先，BC 施用于土壤后释放出的自身胺类物质能在土壤中稳定滞留[27].并且BC 富含由脂肪族和含氧官能团连接的稳定芳香化结构[43]，这些高度芳香化结构和疏水性脂肪族碳的存在使BC 的生物稳定性强，因此可以在环境中长期留存且不易被矿化[44]，这可能是深层土壤中苯酚酯及多酚类相对丰度较高的重要原因.再者，BC 输入可能增加了深层土壤中植物、动物和微生物源的难降解性脂肪族碳的相对丰度，这是因为生物大分子之间能够形成抑制酶降解的化学键，或是非酶聚合过程将低分子量脂质转化为脂肪族大分子[45].本研究中，A 层土壤的氨基酸、氨基化合物、二元羧酸、羟基酸和糖类的相对丰度在BC 处理下分别降低73.7%、38.2%、56.6%、50.6%和70.9%.而BC 处理的Ap 层和W 层土壤中氨基酸、氨基化合物、脂肪族酯、羟基酸的相对丰度则大幅降低，特别是W 层，BC 处理下氨基酸、二元羧酸、固醇类和糖类等官能团均未检测到(见图4).已有研究表明，BC 施用能够提高微生物活性以及对羰基酸和羟基酸的利用能力[46]，从而降低深层土壤中碳水化合物和羧酸等不稳定组分的相对丰度，进而提高了深层碳库的稳定性.

3 结论

a) BC 一次施用对水稻土有机碳库及分子组成的影响在4 年尺度上具有持续效应且因土壤深度而异.BC 施用主要增加了耕作层(A 层)中SOC 的含量以及耕作层(A 层)、犁底层(Ap 层)中DOC 的含量.

b) 不同深度土壤有机质分子结构、组成对表层BC 施用呈现不同响应.BC 施用使得各深度土壤有机质结构中芳香族C=C 吸收峰强度增加，土壤耕作层(A 层)和犁底层(Ap 层)中多糖C-O-C 吸收峰强度减弱，土壤有机质结构趋于芳香化；并且剖面芳香性和疏水性化合物的相对丰度因BC 施用而增加，氨基酸、氨基化合物、二元羧酸、羟基酸和糖类等不稳定组分大幅降低.因此，BC 在水稻土表层施用有助于增强深层土壤有机质稳定性.