金属烯碳纳米囊在SERS中的应用研究进展

尹志威,温贻静,石蕊,夏昕,王昚,曹晓旭,程玉琦,曾佳玉,李圣凯,陈卓*

(1. 湖南大学,化学化工学院,化学生物传感与计量学国家重点实验室,分子科学与生物医学实验室,湖南,长沙,410082)

1 引言

表面增强拉曼光谱(SERS)是一种高灵敏度的分子指纹谱识别技术,能够指数级放大拉曼散射信号,因此被广泛应用于表面/界面科学、光谱学、生化检测、成像示踪等领域[1-5]。SERS技术拥有众多独特的优势[6-8]:包括(1)可提供特异性的分子“指纹信息”;(2)检测灵敏度高,可实现单分子水平检测;(3)半峰宽窄,可实现多靶标分析;(4)抗光漂白和光降解性能较好;(5)操作简单,样品需求量少且无损;(6)水分子的拉曼散射信号极其微弱,能够对生物样品等含水量高的样品兼容;(7)SERS增强基底可设计性强。基于以上优势,SERS技术已成为重要的光谱学技术之一。然而在复杂的极端环境下,SERS增强基底一旦被破坏,将极大地削弱拉曼信号输出的再现性和稳定性,不利于SERS的进一步发展和应用。为了克服以上挑战,开发一种稳定性良好和检测灵敏的SERS增强基底具有重要的意义。

近年来,多种能够实现对金属基底的保护并提高检测能力的多功能SERS增强基底已经被开发出来,主要包括以下三种常见的类型:等离激元金属/烯碳材料复合基底[9-13]、等离激元金属/磁性材料复合基底[14-16]、壳层隔离的纳米颗粒(SHINs)基底[17-23]。尽管等离激元金属在复合基底(如:烯碳材料、磁性纳米材料等)上有利于产生“热点”,然而裸露的SERS基底依旧难以抵挡外部环境的侵蚀,尤其在极端和复杂的环境中[10,14,24-29]。因此包裹完好的SHINs基底是一类非常特别的SERS增强基底,SHINs利用保护壳层(例如:烯碳、二氧化硅、二氧化锰和氧化铝等)的特性,将等离激元纳米颗粒(PNPs)核心包裹起来,从而避免外界环境对基底的破坏和干扰,极大地提高拉曼信号输出的稳定性[17,27-29]。但由于电磁增强属于一种长程效应,理论上壳层的包裹会减弱拉曼增强基底的SERS增强能力,因此壳层厚度的控制是调控SERS效应的重要参数之一。在已报道的SHINs基底中,烯碳隔离的金属SERS增强基底(简称:金属烯碳纳米囊)具有独特的优势,原子级厚度的烯碳壳层的隔离不仅保证了金属核的稳定性,而且不会对SERS性能产生明显的阻碍作用[8,30,31]。经过近十多年的发展,金属烯碳纳米囊在分析检测和生物成像等方面取得了巨大的进步。本综述介绍了金属烯碳纳米囊SERS增强基底的开发和应用的最新进展,包括金属烯碳纳米囊SERS增强基底的制备过程与机理,然后重点介绍金属烯碳纳米囊SERS增强基底在分析检测和生物成像的最新进展,最后概述烯碳纳米囊SERS增强基底面临的挑战,以及在其他极端环境中的应用潜力。

2 金属烯碳纳米囊的制备与性质

金属烯碳纳米囊的制备方法主要包括有等离子体射流法[32]、碳弧放电法[33]、湿化学合成法[34]和化学气相沉积法(CVD)[35],因此研究人员可以根据不同应用的需求进行选择。其中等离子体射流法、碳弧放电法和湿化学合成法均难以精准控制烯碳壳层达到原子级厚度。为了获得高质量的烯碳纳米囊,且易于控制尺寸形貌和烯碳壳层厚度,CVD是制备金属烯碳纳米囊SERS增强基底的首选制备方法。

CVD制备金属烯碳纳米囊的机理与传统的石墨烯CVD合成类似。其原理可概述为:高温下裂解的碳原子直接溶解于金属催化剂中,降低烯碳形成的反应能垒,最终溶解的碳原子偏析到金属表面后形成烯碳壳层[36]。对于碳溶解度低的金属而言,碳原子的溶解和偏析难以发生,主要是通过前驱体分解后直接形成烯碳,并在表面扩散实现包裹[37]。这两种生长机制通常在烯碳CVD合成中共存,两种机制之间的比重大小通常取决于金属催化剂的性能。因此,CVD制备金属烯碳纳米囊可大致分为四个步骤(图1):(1)将金属离子均匀分散在模板以制备金属催化剂前驱体,随后将高温还原的金属纳米液滴(例如:Au、Ag、Cu、Co等)限域模板的空隙之间;(2)高温下碳源(例如:CH4、乙醇、碳量子点、其他有机化合物等)裂解的碳原子在金属催化剂表面溶解,碳原子饱和后沉积在金属催化剂表面;(3)快速降温使碳原子从金属表面析出形成金属烯碳纳米囊;(4)刻蚀模板,将限域在模板空隙之间的金属烯碳纳米囊释放。

图1 金属烯碳纳米囊的制备流程和机理

金属烯碳纳米囊最为独特的结构特征在于金属颗粒表面的少层石墨烯壳层,甚至可以实现原子级厚度,因此金属烯碳纳米囊在具备强局域表面等离激元共振(LSPR)效应时也具有烯碳纳米材料本身的固有性质。通过透射电子显微镜(TEM)测试(图2)可直接观察到金属纳米颗粒表面包覆有一层烯碳层,厚度大约为0.34 nm[38],紫外-可见吸收光谱(UV-vis)测试证明了烯碳壳层的紫外特征吸收峰位于约265 nm处[39-41],荧光光谱证明了金属烯碳纳米囊能够通过荧光共振能量转移(FRET)有效地猝灭荧光信号,减弱了荧光对SERS的影响[42,43],拉曼光谱测试也表明金属烯碳纳米囊的烯碳壳层具有D峰(～1350 cm-1)、G峰(～1580 cm-1)两个固有稳定的拉曼峰,以及拉曼静默区的2D峰(～2650 cm-1),这些拉曼峰可用于成像并作为内标提高精确度[39,44,45]。由于烯碳壳层的化学惰性,金属烯碳纳米囊在中性、酸、碱、盐溶液、生理环境和氧化还原性环境中均展现出优异的稳定性[8,46]。同时,二维烯碳材料具有表面积大、离域π电子结构的特点,通过疏水或者π-π相互作用来负载药物分子或者富集靶向分子,可以进一步拓宽了金属烯碳纳米囊SERS应用的领域[40,47]。我们已经成功制备了不同金属组成、颗粒尺寸和形貌的金属烯碳纳米囊,根据核壳结构的组成差异,可以将金属烯碳纳米囊分为以下三类:单金属烯碳纳米囊、合金烯碳纳米囊和复合烯碳纳米囊(图2)。其中单金属烯碳纳米囊有效解决了SERS基底不稳定的问题,拓宽了SERS的应用场景。尽管如此,多元金属的组合能够提供更多意想不到的性质。例如Co的参杂赋予了磁性,提高了合金烯碳纳米囊在复杂体系中的运动和检测能力,Cu的参杂解决了壳层形成问题,有效催化了表面烯碳壳层的生长。复合烯碳纳米囊被进一步设计,磁性烯碳纳米囊携带多个SERS基底,提高了基底的各向异性以及“热点”数量,增强检测能力。然而,合金的形成以及烯碳壳层的生长都需要一定的条件,这些问题也阻碍了新型金属烯碳纳米囊的开发。截至目前,这些金属烯碳纳米囊已被应用在待测分子的SERS分析以及成像。

图2 金属烯碳纳米囊的分类:单金属烯碳纳米囊(A)、合金烯碳纳米囊(B)和复合烯碳纳米囊(C)的STEM图、EDS和拉曼光谱图。金属烯碳纳米囊命名规则:金属内核@石墨烯外壳,简写为M@G,M = Au、Ag、Cu、Co等

3 金属烯碳纳米囊在SERS中的应用

3.1 金属烯碳纳米囊用于分析检测

SERS基于紫外光到红外光的灵活激发光源,可检测分子振动、旋转以及分子内的其他低频模式,可提供包含成分、对称性和环境确定性样品的指纹振动信息,具有超高的空间分辨率,被广泛应用于各种分子的化学成分、分子结构、构象以及分子间相互作用的检测[48]。SERS的分析检测涉及基底与复杂环境之间的关系,因此合理设计SERS基底具有重要意义。相比于传统SERS基底,金属烯碳纳米囊具有更高的稳定性。它是一种将金属纳米核限域在少层烯碳内部的新型材料,兼具有烯碳纳米材料和金属纳米材料的双重优良特性[8]。由于烯碳壳层的保护,烯碳纳米囊在复杂恶劣的环境中具有优异的稳定性,壳层的存在,避免了样品与SERS基底之间的直接接触,也减少了样品的光碳化和其他副反应,从而获得可靠的SERS分析结果[49]。烯碳纳米囊可以通过荧光共振能量转移(FRET)淬灭检测系统的背景荧光,有益于提高SERS分析检测结果的可靠性。此外,金属烯碳纳米囊还具有独特的拉曼散射特征峰,特别是拉曼静默区的2D峰可以作为无干扰的内标,校准实验因素和检测环境导致的信号波动,有效保证了SERS定量的准确性[8]。基于以上特性,烯碳纳米囊在复杂环境检测和生物检测均取得了较好的进展。

3.1.1环境检测

由于水的SERS信号可忽略不计,因此该技术可广泛应用于水环境中的待测分子的检测[8]。Bian等人报道了超稳定Au@G作为SERS基底检测水环境中R6G[50]。Au@G可以有效淬灭背景荧光并减少光碳化和光漂白,使得R6G检测的增强倍数大于100(图3A)。与传统的金纳米颗粒(AuNPs)相比,银纳米颗粒(AgNPs)具有的优越光学横截面和低经济成本使其成为更适合的等离激元共振材料。但由于AgNPs易被氧化,因此限制了Ag在SERS检测中的应用。为了解决上述问题,Song等人基于CVD方法在Ag表面生长烯碳以保护Ag不被腐蚀。为更好地调控表面烯碳壳层的生长情况,在Ag中掺入Cu以催化表面烯碳壳层的生长,形成耐腐蚀、水溶性良好的稳定AgCu@G,可有效增强SERS信号[51](图3B)。随后,Li等人报道了一种利用Au纳米晶体优异的催化活性实现Ag表面烯碳生长的方法,制备得到稳定且具有优异SERS性能的AuAg@G,用于同一环境R6G和BPEA的同时灵敏检测[52](图3C)。并且AuAg@G能够有效区分R6G和BPEA,也能对绿脓杆菌的生物标志物CN-与PYO进行分析,以实现多靶点检测[53]。

图3 A.在有(红色)、无(绿色、黑色)Au@G情况下的R6G的SERS光谱[50];B.在有(红色)、无(蓝色)AuCo@G的情况下的R6G的SERS光谱 [51];C.以AuAg@G为SERS基底的R6G和BPEA检测信号[52];D.不同水样中1.超纯水、2.纯净水、3.自来水和4.天然河水中不含(浅蓝色)和含(深蓝色)50 μM氰化物的SERS光谱[41]

为了使检测过程可控,并定向捕获、富集复杂环境中的检测物,Zhang等人设计了超稳定、可远程磁控的AuCo@G,可在多种水环境中(超纯水、纯净水、自来水和天然河水)有效捕获和清除氰化物。AuCo@G兼具稳定性与对氰化物的捕获能力,利用AuCo@G的2D峰作为内标,富集后识别氰化物的灵敏度可达到5.0 nM,有效提高了SERS分析精度[41](图3D)。

3.1.2生物检测

SERS的高灵敏度使其能实现复杂环境中多分析物的生物检测。Zhao等人[49]开发了一种炔烃修饰的Au@G作为SERS增强基底,用于以乙腈为内标、炔烃为拉曼报告分子的碱性磷酸酶(ALP)的比例检测。该增强基底可在拉曼静默区定量检测碱性磷酸酶的活性,线性范围为0.002-1 U L-1,检测限低至0.13 mU L-1,实现了简单、稳定、可靠的SERS医学诊断(图4A-B)。由于SERS的即时检测面临复杂环境中其他分子的干扰,如非目标分子在底物上的竞争性吸附可能导致分析与定量结果不准确[54]。为解决以上挑战,Zhang等人以Au@G为增强基底,通过引入2D峰作为内标以减少检测系统中的其他物质如酸、碱、蛋白质等的干扰,对具致癌性的结晶紫(CV)进行检测,线性相关系数可从0.778显著提高到0.996[55]。此外,利用Au@G对鱼肌肉和鳞片中的CV进行SERS检测,且无需复杂的样品前处理过程(图4D-F)。Zou等人利用Au@G对与黄疸发病机制相关的胆红素进行SERS痕量检测[44]。该方法无需样品预处理,且具有优异的抗干扰能力,为临床检测胆红素提供了高灵敏的SERS平台(图4C)。

图4 A.检测碱性磷酸酶(ALP)的Au@G增强基底示意图;B.有(红色)、无(黑色)ALP时的SERS光谱[49];C.胎牛血清(FBS)中的Au@G表面的BR的吸附过程[44]。D.CV检测示意图;E.鱼肌肉上的CV检测;F.鱼鳞上的CV检测SERS光谱,M、S分别代表鱼肉,鳞片[55]

金属烯碳纳米囊的SERS检测由于具有优异的稳定性和抗干扰性,因此进一步扩大了金属烯碳纳米囊在生物体内检测的应用。Song等人利用改性AgCu@G检测罗非鱼肌肉样品中的孔雀石绿(MG)和白孔雀石绿(LMG)(图5A),并利用AgCu@G的固有SERS信号作为内标校准检测结果[56]。Liu等人将Ag@G包埋于蚕丝膜中制成具有优异稳定性、光学透明性的柔性SERS基底,实现了小鼠伤口模型中细菌的原位检测(图5B)[57]。随后,Wang等人进一步开发了用于无标记、非入侵性获取分子信息的检测平台(图5C)。在指纹处SERS平台的原位构建,实现了指纹残留物的检测[58]。实现脂溶性和水溶性物质的协同分析检测是在生物体内检测的重要突破,Zhang等人提出了一种基于Au@G在两相界面的自组装,且无需任何表面活性剂和诱导剂的检测策略,在小鼠血液内进行对药物模型分子的多重SERS检测(图5D),实现了多相界面的简单、灵敏的SERS检测[59]。Tang等人同样使用界面组装的Au@G作为SERS基底和分析物富集平台,构建的激光介导的痕量待测物富集策略,避免了“咖啡环效应”引起的信号波动,有望为复杂样品的检测提供可靠的SERS分析平台[60]。

图5 A.不同溶剂洗涤受污染鱼肌肉中的LMG的SERS检测[56];B.金黄色葡萄球菌和大肠杆菌在体内的SERS指纹谱的差异[57];C.用于SERS分析的等离激元阵列构建的示意图[61,58];D.小鼠注射CV和BPEA的血液SERS分析示意图[59]

3.2 金属烯碳纳米囊用于成像

SERS成像的空间分辨率高,可重复多次成像,具有很大的应用潜力。但常用的金、银或铜等SERS基底在成像过程中对外部环境较为敏感[62],与金属直接接触的检测物在强烈或长时间的激光照射下会引起信号分子或附近杂质分子的光碳化[63],导致SERS成像不准确和重现性差等问题,因此精确控制产生拉曼信号的分子和金属探针之间的距离,同时提高SERS探针的稳定性,对于SERS成像同样至关重要。

为了解决这个问题,在金属表面上引入烯碳纳米囊,以保护金属探针不直接与待测分子接触,以保护内部金核免受氧化,提高了金属探针的稳定性[63]。同时,烯碳纳米囊具有独特和易于分辨的拉曼信号:D峰(1355 cm-1)、G峰(1590 cm-1)和2D峰(2706 cm-1),且2D峰不受生物分子的干扰(1800-2800 cm-1),使实现精确生物成像成为可能[64]。

3.2.1生物成像

2014年,Bian等报道了一种用于乳腺癌细胞MCF-7多模成像的Au@G[50],Au@G在D和G峰的强而简单的共振拉曼信号,可以用作细胞成像的良好拉曼探针(图6A),Zou等进一步证明了Au@G在活生物体线虫中的精确成像(图6B)[46]。为了实现更高的拉曼信号增强和成像,调节Au@G的形态以实现更好的LSPR十分重要。由于金纳米棒具有可调谐的局域表面LSPR,因此在生物医学领域得到了广泛的应用[65]。2017年,Dong等人利用Au纳米棒烯碳纳米囊(AuNR@G)对Hela细胞进行成像,AuNR@G 的D峰和G峰都可用于拉曼成像(图6C),并显示出优异的成像能力[47]。为了提高AuNR@G对目标组织样本的靶向能力,在AuNRs@G表面修饰SYL3C适配体靶向EpCAM(癌细胞特异性标志物),实现了对癌组织的选择性成像[40](图6D)。此外,2019年,Zhang等人在Au烯碳纳米囊中掺入Co成功制备了AuCo@G,可实现氰根在线虫中的分布成像[41](图7A)。以上结果充分验证了金属烯碳纳米囊在细胞、组织和生物体中的成像能力,并且在修饰特异性识别分子(核酸适体、抗体等)后能进一步实现选择性成像,提高成像的精准度和靶向性。

图6 A. MCF-7细胞在有无Au@G孵育的拉曼成像。比例尺=10 μm[50];B. Au@G用于秀丽隐杆线虫的SERS成像。比例尺=200 μm[46];C.具有AuNR@G的HeLa细胞的拉曼图像[65];D. AuNR@G对大鼠癌性乳腺癌和正常肝组织的靶向拉曼成像。比例尺=10 μm[40]

图7 A. AuCo@G在秀丽隐杆线虫和外源氰化物中的SERS成像,比例尺=100 μm[41];B.对感染铜绿假单胞菌的秀丽隐杆线虫进行氰化物的SERS成像,比例尺=200 μm[57];C.炔烃-PEG-功能化AgCu@G的MCF-7细胞的SERS成像,比例尺=10 μm[51];D. AgAu@G细胞成像,MCF-7细胞的高分辨率SERS成像[8]

尽管Ag的光学横截面更大,成本更低,但由于Ag不耐腐蚀,因此降低了等离子体信号并限制了SERS应用。与Au@G相比,Ag@G更强的LSPR效应使其在SERS成像方面具有潜力。为了解决这个问题,Liu等人通过Ag@G实现了CV分子的拉曼成像(图7B),最低检测限可达10-10M[57]。Song等人合成了AgCu@G[51],不仅可以耐强酸腐蚀,AgCu@G烯碳壳层上修饰的炔烃-聚乙二醇在细胞的拉曼静默区域具有强烈的拉曼振动,可以对MCF-7产生更准确的共定位(图7C)。2021年,Li等人合成了AgAu@G[8],结合了双金属优点的同时,并实现了MCF-7的拉曼成像(图7D)。开发基于Ag的金属烯碳纳米囊进一步推进了拉曼成像探针的灵敏度和稳定性。

3.2.2防伪应用

由于界面介导的纳米晶体自组装为传感、催化或光子学提供了极好的策略,因此金属烯碳纳米囊也可以应用于多重编码、防伪等领域。2014年,Nie等人报道了一个以FeCo@G为模板的聚二乙炔组装和光聚合组成的多功能自组装系统[66]。其可逆的颜色变化、强而独特的拉曼散射、荧光发射、灵敏的近红外热响应和独特的磁性特性为该组装系统提供了多重编码防伪能力(图8A)。随后,Wang等人进一步利用Au@G开发了潜指纹(LFP)的成像和个人信息的获取方法[58],烯碳纳米囊增强的D峰和G峰使Au@G成为LFP超灵敏的SERS成像探针,显著的拉曼峰可以清楚地识别LFP的代表性拉曼特征峰(图8B)。

图8 A. FeCo@G@PDA装配系统的多码防伪应用[66];B. Au@G的界面自组装用于潜指纹识别[58]

4 总结与展望

本综述系统性地总结了CVD方法制备金属烯碳纳米囊的机理、性质和分类,并分别介绍了金属烯碳纳米囊在分析检测和生物成像的研究进展。根据核壳结构内部金属的组成差异,可以将金属烯碳纳米囊分为以下三类:单金属烯碳纳米囊、合金烯碳纳米囊和复合烯碳纳米囊。烯碳壳层不仅提供了保护性能,且几乎不影响内部金属的SERS增强效果,赋予了金属烯碳纳米囊在各种环境下具有超强的稳定性以及良好的SERS灵敏度,使得金属烯碳纳米囊在生理环境、酸性环境、氧化还原环境和油脂环境均具有稳定的SERS信号输出。因此,金属烯碳纳米囊具有广泛的应用前景。

金属烯碳纳米囊具有以下特点:(1)可避免待测分子和外界复杂环境中的分子与内部金属核直接接触,既减少了待测物分子的光碳化,也避免了不必要的副反应;(2)固有的D、G和2D三个拉曼散射特征峰可以作为稳定的拉曼标签或者内标;(3)基底表面具有大的比表面积,能够通过疏水或者π-π相互作用捕获待测分子或者负载靶向分子,可实现特异性检测以及靶向分析和成像;(4)能够通过FRET过程有效猝灭生物体系的背景荧光信号或者荧光探针的信号,有效减弱荧光对SERS信号的干扰;(5)可通过界面自组装为传感提供检测分析平台实现多重编码以及防伪。基于以上众多优势,结合金属烯碳纳米囊内部金属核优异的SERS和双光子发光性能,可实现对生物分子的灵敏分析、区分革兰氏阴性菌和阳性菌、指纹中残留分子的鉴定和识别、癌细胞或组织的靶向SERS成像;利用合金烯碳纳米囊多元金属内核的其它性质,AuCo@G可实现对氰化物的捕获检测与清除,磁分离富集进一步提高了SERS灵敏度;此外,利用复合烯碳纳米囊独特的内标纳米结构的设计,该结构由在烯碳磁性纳米囊上修饰的大量金纳米颗粒(AuNPs)组成,以解决传统内标相关的问题。减弱的背景干扰以及优异的稳定性,大大提高了SERS的定量精度,可减少富集损失和分析物分布不均匀引起的定量误差。除了更改金属核的组成成分,金属烯碳纳米囊的表面修饰也被进一步探究,核酸适体修饰的金属烯碳纳米囊可实现在细胞、组织水平的靶向SERS成像,实现了生物分子的SERS分析。

截至目前,金属烯碳纳米囊已经在SERS分析检测、生物SERS成像和防伪应用等取得了突破性的进展,但在生物体内的探索仍面临挑战。金属烯碳纳米囊在非生命体系中展现出优异的分析能力,在细胞水平上也具有良好的细胞相容性和血液相容性,目前也进一步应用于小鼠疾病模型的体内治疗,但是在大型哺乳动物中尚未有相关的数据支持,且长期纳米毒性依旧处于不清晰的阶段。因此后续的工作将致力于探索金属烯碳纳米囊在小型哺乳动物中的长期毒性,器官分布以及主要代谢途径,并拓展金属烯碳纳米囊在大型哺乳动物模型中的原位SERS检测。此外,开发具有多功能的新型金属烯碳纳米囊对于发展超稳定的SERS基底也同样非常重要。然而,合金的形成以及烯碳壳层的生长条件苛刻,开发新型的金属烯碳纳米囊合成技术也是未来的突破口,这将极大地提高金属烯碳纳米囊功能的丰度。我们相信金属烯碳纳米胶囊在不久的将来会应用到更多极端环境(如:高压高渗的海底、极酸或极碱的环境等)中的SERS检测与成像。