烟草青枯病拮抗菌TBWR1的筛选鉴定及防病促生能力

杨兴有, 丁安明, 余祥文, 谢 强, 夏 春, 张永辉, 徐传涛, 王卫锋, 陈志华*

(1.四川省烟草公司 烟草科学研究所, 四川 成都 610000; 2.中国农业科学院 烟草研究所, 山东 青岛 266101; 3.四川省烟草公司 泸州市公司, 四川 泸州 646000)

0 引言

【研究意义】青枯病是烟草生产中常见的一种典型细菌性土传病害,其病原菌是雷尔氏青枯菌(Ralstoniasolanacearu)[1]。青枯菌的寄主范围比较广泛,主要有烟草、番茄、马铃薯等植物,青枯病破坏性强,防治比较困难[2]。在高温高湿环境中,青枯菌通过根部或茎部的伤口进入烟株,随后进入木质部,通过脂多糖识别寄主细胞,并产生大量的胞外多糖导致维管束堵塞,同时分泌胞外蛋白酶降解细胞壁,最终引起烟草维管束发生病变,导致植物萎蔫死亡[3]。烟草是我国主要的经济作物之一,其青枯病的发生严重威胁烟草生产。因此,有效预防青枯病的发生是烟草生产与科学研究的重要工作。【前人研究进展】目前,防治青枯病的方法主要有化学防治、农业防治和生物防治3种。化学防治效果不理想,化学农药对土壤环境和水质产生污染,且长期使用导致病原菌产生耐药性[4]。农业防治主要采用与小麦、玉米、水稻的轮作,但轮作存在年限较长的缺点[5-6]。生物防治是施用微生物菌剂控制植物病害,优点是对人畜植物安全,无污染[7],备受欢迎。【研究切入点】目前筛选的烟草青枯病生防菌大多拮抗能力较弱,且大田防治效果不佳。【拟解决的关键问题】从烟草根际土壤中分离对烟草青枯病菌具有拮抗作用的细菌并对菌株进行分类、鉴定,通过室内盆栽试验验证其生防效果以及对烟草的促生作用,为烟草青枯病防治提供新的拮抗菌株。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 土样 供试土样采自四川省泸州市古蔺县大寨乡大寨村烟田,采用五点取样法收集健壮烟株根际土壤样品5份并编号,放入无菌密封袋中,做好标记并放置于4 ℃环境保存。

1.1.2 烟草品种与病原菌 供试烟草品种为烟草青枯病易感品种翠碧一号(CB-1);供试烟草青枯病病原菌为Y45,由云南省烟草农业科学研究院提供。

1.1.3 供试培养基 牛肉膏蛋白胨培养基、NA培养基、NB培养基均购自海博生物技术(青岛)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 烟草根际土壤中细菌的分离及纯化 采用梯度稀释法并涂布于NA培养基上以分离土壤中的细菌。称量1 g土壤样品于10 mL无菌水中制备成浓度为10-1土壤悬液,振荡培养30 min,然后静置30 min。用无菌水稀释至10-3土壤稀释液,吸取100 μL均匀涂布于细菌培养基上,倒置于28 ℃培养箱中培养24 h后观察细菌生长情况。挑取形状、大小、颜色不同的单菌落于NB液体培养基中28 ℃振荡培养24 h。将培养后的菌液在细菌培养基平板上划线培养,放置于28 ℃培养箱,待长出单菌落后经过多次划线培养,得到细菌的纯培养物,并保存菌种。

1.2.2 青枯菌拮抗菌的筛选、鉴定与拮抗活性测定 采用抑菌圈法筛选烟草青枯病菌的拮抗细菌。取200 μL青枯病菌悬液均匀涂布于NA平板上,平板中央放置直径为5 mm的无菌滤纸片,滴加10 μL浓度为1×108cfu/mL的待测菌液,待培养基充分吸收后,倒置于28 ℃恒温培养箱培养24 h,观察抑菌效果并测量抑菌圈的直径。设置重复3次。

将拮抗菌接种于NA培养基上,于28 ℃培养箱中培养24 h,观察菌落形态、大小、边缘、表面、透明度等,并进行革兰氏和甲基红染色。

1.2.3 分子生物学鉴定 拮抗菌的16S rDNA序列采用PCR方法扩增[8]。PCR扩增采用细菌的通用引物,其中正向引物序列为BSF(27F)5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′,反向引物序列为BSR(1942R)5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′。PCR反应体系:27F 1 μL,1942R 1 μL,ddH2O 21 μL,PCR Mix 25 μL,菌株DNA模板2 μL,合计50 μL。PCR反应程序:95 ℃预变性3 min;95 ℃变性15 s,55 ℃复性15 s,72 ℃延伸90 s,35个循环;72 ℃延伸5 min,4 ℃保存。通过琼脂糖凝胶电泳检测、分离和纯化PCR产物,并送派森诺生物科技有限责任公司测序。

1.2.4 系统进化树的构建 将测序获得的DNA序列在NCBI数据库中进行BLAST序列比对分析,下载同源序列并通过Clustal和MEGA7.0进行多序列比对和系统发育树的构建,确定其分类地位。

1.2.5 拮抗菌对烟草青枯病的室内防效试验 采用盆栽试验研究拮抗菌对烟草青枯病的影响,盆栽试验在中国农业科学院烟草研究所温室内进行。在3个已灭菌的500 mL三角瓶中加入LB液体培养基,接入拮抗菌菌液并置于28℃振荡培养箱中培养(220 r/min),直到OD600=0.5～0.8。在加入拮抗菌前保持盆栽烟草幼苗(CB-1)土壤中含有充足的水分。量取50 mL菌液灌溉盆栽苗根部,对照(CK)则接入50 mL的NB培养基。间隔3 d后重复接种1次。之后间隔3 d接入青枯菌Y45菌液50 mL/盆(OD600=1.0),对照也接入50 mL Y45菌液[9-10]。每个处理10盆,3次重复。接种青枯菌后,盖上保温盖放置在30 ℃培养箱中,将烟苗在高温高湿的条件下分别培养7 d、14 d和21 d并依据《烟草病虫害分级及调查方法》(GB/T 23222—2008)[11]记录盆栽苗的发病情况。统计发病率、病情指数和生防效果,其计算公式如下:

病情指数=∑(各病级株数×各病情指数)/(调查总株数×青枯病最高病情指数)×100

生防效果=(对照病情指数-处理病情指数)/对照病情指数×100%

1.2.6 拮抗菌对烟草幼苗的促生试验 采用灌溉接种的方式分析拮抗菌对烟草的促生作用[12],方法略有改动。首先将拮抗菌摇至OD600=0.5。在烟草生根期移植盆中对其进行灌根处理,每盆加入拮抗菌液20 mL,每处理10盆,3次重复。对照用NB培养基进行灌溉,间隔7 d浇灌1次,共浇灌3次,然后放在26 ℃条件下培养,观察烟草的生长状况。3周后分别取对照组和处理组,除去土壤,清水洗净,吸干水分,测量株高、叶片长宽、茎围、根系长度、根系生物量等促生指标。

1.3 数据处理

采用Excel对数据进行处理,采用学生t-检验[13]进行差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 烟草根际细菌对青枯菌的拮抗活性

对采集健康烟株根际土壤中细菌进行分离、纯化,共得到土壤细菌54株。利用抑菌圈法对获得的54株细菌进行青枯菌拮抗活性测定,发现1株细菌对烟草青枯病菌具有抑制作用,命名为TBWR1(图1)。该菌株产生的抑菌圈较为明显且透明,直径达21 mm以上。

注：*,**和***分别表示在P<0.05、P<0.01和P<0.001水平下显著,下同。

2.2 拮抗菌株TBWR1的形态鉴定

菌株TBWR1在NA培养基上培养24 h后,镜检观察菌体发现其呈短棒状,菌落为黄乳白色,呈圆形,表面略有褶皱,生长无规则,革兰氏染色阳性、甲基红染色为阴性。

2.3 拮抗菌株TBWR1的分子鉴定

以TBWR1菌株DNA为模板进行PCR扩增发现单一DNA条带,为16S rDNA序列,大小约为1.5 kb。序列基因登录号为EF562603。通过序列比对分析,菌株TBWR1与枯草芽孢杆菌Bacillussubtilis同源性最高。系统进化树分析(图2)表明,菌株TBWR1与枯草芽孢杆菌BacillussubtilisKC849252和BacillussubtilisMN062963在同一分支上且同源性达85%。因此,初步鉴定菌株TBWR1为枯草芽孢杆菌。

2.4 拮抗菌对烟草青枯病的防治效果

从图3看出,烟株接菌后第7天,对照组开始发病,出现萎蔫、枯死的症状,而TBWR1处理组鲜有发病;接菌后第14天,对照组病情指数为40,TBWR1处理组仅为16;接菌后第21天,对照组烟株全部发病,且有超过50%烟株死亡,TBWR1处理组的病情指数为25。拮抗菌TBWR1的生防效果在第21天达71.1%。拮抗菌TBWR1对盆栽试验中烟草青枯病具有较好的防治效果,明显降低接种青枯菌后烟株的发病率和死亡率。

图 2 TBWR1菌株的系统进化树

图 3 拮抗菌TBWR1对青枯病菌的生防效果

2.5 TBWR1菌株的促生作用

由图4可见,与对照组相比,TBWR1拮抗菌株处理后的烟株整体生长势增强、在处理后第7天、14天、21天与对照相比有显著差异,其中,第21天对照株高平均达4.8 cm,TBWR1处理组达6.6 cm,株高显著增加(图4和图5)。说明,拮抗菌能显著促进烟草株高的生长。

对烟草叶片(自下而上数第3片叶)的长度和宽度进行统计分析发现,TBWR1拮抗菌株处理能显著增加叶片长度,而对叶片宽度无显著促生作用。同样,TBWR1拮抗菌株处理能显著增加烟株的茎围(图5)和根系鲜重(图6)。表明,TBWR1拮抗菌对烟草地上部分和地下部分均表现出显著促生作用。

图 4 TBWR1拮抗菌对烟草生长势的促进作用

图 5 TBWR1拮抗菌株处理烟草叶片的发育和茎围

图 6 TBWR1拮抗菌对烟草根系发育的促生效果

3 讨论

青枯病是由青枯雷尔氏菌引起的典型土传病害且不易防治。由于该病菌致死率高、寄主范围比较广,普遍分布于世界烤烟种植区,特别在热带和亚热带烟区易造成巨大经济损失,严重威胁烟草生产[4,14]。有研究认为,根际微生态失衡是青枯病发生的主要原因[15]。植物土壤微生物所形成的相互依存的生态系统遭到破坏,而根际微生态失衡对土壤微生物的环境造成进一步恶化,更不利于植物的健康生长,造成病原微生物大量繁殖,最终导致土传病害暴发[16]。

植物根际土壤中有不计其数的细菌,这些细菌有的促进植物生长发育,提高植物的抗病性,维持正常的生态平衡;有的抑制植物生长[7,13,17]。土壤中存在寄主或病原菌,有可能存在拮抗的生防菌株。拮抗菌株具有和病原菌生长环境相同,因此利用拮抗菌防治青枯病是具有应用前景的防治措施[18]。拮抗菌中研究较多的是芽孢杆菌属,芽孢杆菌具有较强的定殖能力,这类菌株有抗逆性强、对营养需求较简单,且产生内孢子,也易分离筛选,对植物的病害防治有重要作用[12,19-20]。研究从烟田健壮烟株根际土壤中分离筛选对烟草青枯病菌拮抗作用相对较强的菌株TBWR1,通过系统发育分析该菌株属于芽孢杆菌属,在培养皿内抑菌试验和盆栽防效试验中对烟草青枯病菌均表现出良好的抑菌效果,并进一步通过促生试验,证明拮抗菌TBWR1能显著促进烟草生长势,对株高、茎围、叶长等地上部分和根系等地下部分生长均具有显著的促进作用。研究结果为烟草青枯病的生物防治提供了新的生防菌株。

段燕萍等[18]研究表明,枯草芽孢杆菌SH7菌株产生的主要抑菌活性物质为蛋白多肽类物质,对烟草青枯病的防治效果达66%。有研究报道,番茄中解淀粉芽孢杆菌对青枯菌有较强的拮抗作用,防治效果在70%以上,能较好抑制番茄青枯病的侵害[6,21];枯草芽孢杆菌可以在番茄的根系上定殖并提高植株的株高、叶绿素含量和生物量以及果实的产量[22];接菌枯草芽孢杆菌YBM-4后,与对照相比,烟苗根系更丰富,茎秆更粗壮,从而有利于吸收更多的营养物质使烟叶产量和品质得到较大提高[23]。表明,枯草芽孢杆菌属的多个菌株在帮助植物抵御病害、促进植物生长方面具有积极作用[24]。这些与本研究结果一致,但同时研究拮抗菌的生防效果和促生效果还鲜有报道。研究用拮抗细菌TBWR1处理后,烟株的抗病性显著增强,生防效果达71.1%,同时施加TBWR1促进了烟草的株高、叶长和茎围的增加以及根系的生长。推测其原因可能是拮抗菌TBWR1的施加改善了土壤根部有益细菌的生长环境,与病原真菌相互竞争[25-26],而且产生了抑制病原细菌的生长和促进植物生长的物质,如抗菌脂肽类、核酸类、多烯类等物质[27-28]。拮抗菌TBWR1抗病相关功能基因及抗病相关机理需要进一步研究,同时需要进行田间试验验证其对烟草青枯病的防治效果,为丰富拮抗菌种资源提供理论和试验依据。

4 结论

从烟田抗病烟株根际土壤中分离纯化出1株对烟草青枯病具有良好拮抗作用的枯草芽孢杆菌TBWR1。拮抗菌TBWR1对青枯病的生防效果达71.1%,并能显著促进烟草的生长势。说明,拮抗菌TBWR1在烟草青枯病生物防治中具有潜在利用价值。