铁死亡参与帕金森病形成的研究进展*

黄心雨 综述,孟德涛 审校

(1.首都医科大学附属北京康复医院,北京 100144;2.首都医科大学附属北京康复医院帕金森医学中心,北京 100144)

帕金森病(PD)是以运动迟缓、肌强直、静止性震颤等运动症状和焦虑、抑郁等非运动症状为主要表现的神经退行性疾病,以黑质致密部多巴胺能神经元变性缺失及路易小体的形成为主要病理特征[1]。目前,缺乏有效的疾病修饰治疗方法,寻求具有疾病修饰作用的治疗方法是当前PD治疗中亟须解决的问题之一。理解黑质多巴胺能神经元退行性病变及路易小体形成的机制是开发具有疾病修饰治疗方法的前提条件。铁死亡是最近提出的一种受调控的细胞死亡方式,以铁依赖的脂质过氧化为主要特征[2]。PD中的铁超载、脂质过氧化物水平升高、谷胱甘肽(GSH)水平降低等,揭示铁死亡可能参与PD形成的过程[3]。因此,阐明铁死亡在PD发病中的作用对于开发相关靶点的药物至关重要。因此,本文简要回顾了当前对铁死亡的认识,并对其在PD发病中的作用进行了归纳总结。

1 铁死亡-铁依赖的调节性细胞死亡

铁死亡是以铁依赖性脂质过氧化为主要特征的细胞死亡方式[4]。在生理条件下,GSH过氧化物酶4(GPX4)可将LOOH转换为脂质醇(LOH)[5]。GPX4是其核心调控因子,可以被抑制剂RSL3所抑制[5]。敲除GPX4的小鼠会出现神经退行性病变及过早死亡,过表达GPX4可以阻止由RSL3诱导的细胞死亡。为了将LOOH还原为LOH,GPX4需要还原型GSH作为电子供体。GSH在细胞中由谷氨酸和半胱氨酸(Cys)合成。Cys通过转硫化途径由甲硫氨酸合成,也可以通过XcT反向转运体以氧化的胱氨酸二聚体的形式被吸收,然后被还原成胱氨酸。形成Xc-系统XcT单元(由SLC7A11编码)的异源二聚体和将Xc-系统定位于质膜的4F2单元(由SLC3A2编码)是细胞内胱氨酸运输所必需的[6]。通过Erastin抑制XcT反向转运体,使细胞内Cys的含量降低,GSH的合成受损可以导致细胞铁死亡[4]。利用Cys前体提高细胞内GSH水平,可以预防铁死亡。此外,研究发现辅酶Q10(CoQ10)氧化还原酶,即铁死亡抑制蛋白1(FSP1),可以催化CoQ10重新生成其还原形式CoQ10-H2或泛素醇来抑制铁死亡[7]。

铁在铁死亡过程中发挥重要作用,主要以与转铁蛋白(Tf)结合的方式进行运输。铜蓝蛋白(CP)通过氧化二价铁离子(Fe2+)产生三价铁离子(Fe3+),并通过转铁蛋白受体1(TfR1)以Tf-Fe3+复合物的形式被细胞内吞[8]。铁进入核内体后,由于其酸性环境,铁从Tf中释放出来,金属还原酶STEAP3将不溶性Fe3+还原为可溶的Fe2+。通过二价金属转运体1(DMT1)进入细胞质中,Tf和TfR1被回收到膜中以供使用。神经元对铁的摄取也可以通过质膜上的DMT1通道直接发生[8]。构成不稳定铁池(LIP)的胞质游离Fe2+参与芬顿反应,与过氧化氢(H2O2)产生反应生成具有高度活性的羟基自由基(·OH)。铁蛋白的部分功能是储存细胞质中多余的铁,神经黑色素是位于多巴胺能神经元中的一种关键的铁储存蛋白。铁唯一已知的出胞途径是通过膜铁转运蛋白(FPN),被铁氧化物酶(如CP)氧化成Fe3+后离开细胞。除芬顿反应外,铁还可以作为脂氧合酶(LOX)家族的辅助因子介导脂质过氧化物的生成。15-LOX可在长链多不饱和脂肪酸(PUFA)上酶促生成额外的LOOH,主要是位于质膜上含有花生四烯酸(AA)或肾上腺酸(AdA)的磷脂酰乙醇胺(PE)[9-10]。质膜的脂质组成可以决定细胞对铁死亡的易感性,含有AA的长链PUFAs可以增加脂质过氧化的风险[11]。PUFAs要融入质膜的磷脂(PL)中,首先需要通过酰基辅酶A合成酶长链家族成员4(ACSL4)与辅酶A(CoA)结合。PUFA-CoAs可以通过溶血磷脂酰胆碱酰基转移酶3(LPCAT3)整合到质膜中,其中15-LOX专门氧化PLs,使质膜更具渗透性和脆性。ACSL4是铁死亡凋亡途径中的关键角色,抑制或通过遗传方式耗尽ACSL4可阻止铁依赖的脂质过氧化及铁死亡[12]。

2 PD中的铁死亡

2.1铁在PD形成中的作用 铁在代谢过程中发挥辅助因子的作用,对大脑健康尤其重要,参与神经递质合成、线粒体呼吸、髓鞘合成和硫簇蛋白合成等过程[13]。由于大脑的高代谢活性和对铁的依赖,随着年龄的增长,铁在大脑中沉积增加,此种沉积较多发生在与神经退行性疾病相关的区域[8]。PD患者黑质致密部胶质细胞和多巴胺能神经元中铁的升高尤为明显,并且铁的水平与疾病的严重程度相关。铁的异常沉积最可能是由于铁调控蛋白改变引起的铁稳态失衡引起的[14]。携带导致铁相关蛋白功能失调(如Tf)突变的患者患PD的风险增加[15]。

2.2氧化应激在PD形成中的作用 氧化应激是导致PD形成的主要因素之一[16]。通过诱导氧化应激反应可以形成PD模型。氧化应激由氧化还原状态的失衡引起,包括活性氧(ROS)的过度产生和抗氧化系统反应不足以抵抗ROS引起的危害。ROS是由氧衍生而来的高度活性分子,包括超氧化物(O2-)和·OH等自由基及H2O2等非自由基分子。·OH是最具挥发性的ROS之一,具有氧化应激下的细胞毒性效应,由H2O2和Fe2+通过芬顿反应产生。线粒体是H2O2和ROS(尤其是O2-)产生的主要场所之一[17]。大脑中大部分的O2-由复合体I产生的,在PD患者的黑质和额叶皮层及成纤维细胞和血小板中存在功能失调的复合体I,导致超氧化物生成增加[17]。复合物I的缺陷与CoQ10缺失相关,促进线粒体ROS的产生和膜脂过氧化。

细胞中存在抗氧化系统来维持氧化还原状态的平衡,如其受损,会导致氧化应激反应过度和细胞死亡。GSH是大脑大量使用的一种抗氧化剂,通过直接作用清除具有高度活性的O2-和·OH自由基来清除ROS。氧化应激在PD中的发生部分原因是GSH水平的降低,在黑质中尤为明显。VALLERGA等[18]研究发现,细胞内GSH水平下降可以增加对铁死亡的敏感性。GSH水平降低可以促进LOOH的积累。此外,由于GSH是Fe2+的天然配体,其在黑质水平的降低还可以减弱多巴胺能神经元的抗氧化能力,促进·OH和ROS的产生。DJ-1是另一种细胞抗氧化酶,在调节氧化应激、ROS形成和线粒体功能中发挥关键作用。DJ-1基因(PARK7)功能突变与常染色体隐性早发性PD相关,伴有线粒体氧化应激增加、基础细胞呼吸下降和氧化多巴胺的积累[19]。DJ-1可以通过保存硫化转硫途径,促进Cys和GSH的生物合成,起到铁死亡抑制剂的作用。DJ-1降低导致脂质ROS积累,可以提高细胞对铁死亡的敏感性[20]。此外,GSH水平的变化和LOOH的增加会影响关键抗氧化酶(如GPX4)的表达。

2.3脂质过氧化在PD形成中的作用 脂质代谢和细胞脂质组成决定细胞对铁死亡的敏感性。含有磷脂的PUFA,特别是质膜中含有AA或AdA的PE是最容易发生铁死亡的脂质[21]。细胞发生铁死亡的能力取决于PUFA的数量和细胞定位,富含AA的细胞对铁死亡敏感[21]。游离PUFAs经ACSL4酯化后,通过LPCAT3结合到膜磷脂[22]。双烯丙基碳是脂质驱动铁死亡的关键,可以增加活性ROS、LOX和周围脂质过氧化物攻击的易感性[21]。脂质过氧化过程包括起始、增殖和终止3个步骤。活性ROS首先从双烯丙基碳中抽象出一个氢原子,形成碳中心脂质自由基(PL·)。该自由基迅速与氧反应,形成脂质过氧自由基(PLOO·),随后从邻近的脂质中进一步提取氢,繁殖出新的PLOO·和脂质过氧自由基(PLOOH)。脂质过氧化反应可以被FSP1-CoQ10H2系统所抑制,也可以由抗氧化酶(如GPX4)将PLOOH转化为PLOH所抑制。大脑中脂质浓度仅次于脂肪组织,其高耗氧状态使其对脂质过氧化特别敏感,脂质过氧化是PD患者黑质细胞死亡的原因之一。尸检分析显示,PD患者黑质中脂质过氧化的毒性副产物丙二醛(MDA)水平升高,血浆中LOOH水平也升高。此外,另一种脂质过氧化代谢物4-羟基-2-壬烯醛(HNE)及壬烯醛蛋白加合物也出现相应增加,PD患者的脑脊液中HNE升高与黑质中铁沉积相关[23]。SHCHEPINOV等[24]研究发现,MPTP处理的小鼠在补充D-PUFAs后,黑质纹状体的损伤会得到保护,D-PUFAs可以减缓自由基的生成。YANG等[25]研究证实用D-PUFA预处理细胞可以防止PUFA氧化和铁死亡。铁的升高与多巴胺能神经元内高水平的PUFAs结合,创造了一个对脂质过氧化特别敏感的环境,这意味着铁、多巴胺或脂质稳态的轻微失衡,多巴胺能神经元便会出现铁死亡。

钙非依赖磷脂酶A2β(PLA2G6)是另一个铁死亡相关的关键酶,这种酶水解甘油磷脂的sn-2酰基链,释放出游离脂肪酸和溶血磷脂[26]。PLA2G6纯合突变患者表现出的神经变性,与PD的神经病理学相似。KINGHORN等敲除果蝇PLA2G6基因的同源物iPLA2VIA发现果蝇出现存活率降低、运动障碍及机体对氧化应激(尤其是线粒体)的超敏反应,并与脂质过氧化水平的增加有很强的关联性。

2.4其他调节因子在PD形成中的作用 核转录因子(Nrf2)是抗氧化反应的主要调节因子,可以预防细胞发生铁死亡[27]。在氧化应激条件下,Nrf2易位到细胞核,诱导内源性抗氧化蛋白的表达,防止脂质过氧化。Nrf2活动下降导致GSH水平降低。Nrf2在对抗内在的氧化应激中发挥作用。Nrf2定位于PD患者黑质中的细胞核,而其他神经退行性疾病(如阿尔茨海默病)定位于受影响脑区的细胞质。PD中的这种核易位表明,氧化应激下多巴胺能神经元的内在脆弱性导致了Nrf2的细胞和(或)疾病依赖性招募。在果蝇PD模型中,Nrf2的激活和核易位对MPP+损伤具有保护作用,可以阻止果蝇运动障碍和神经元丢失的发生。NADPH是一种参与LOOH消除的细胞内还原剂。细胞内NADPH水平被认为是铁死亡敏感性的生物标志物。研究表明,PD患者体液中氧化NADPH生成氧气的一种酶复合体NADPH氧化酶水平发生了改变,其亚单位NADPH氧化酶1和4在黑质中均有所增加[28]。CoQ10及其还原形式CoQ10-H2是有效的线粒体和脂质ROS抗氧化剂,也被认为是内源性的铁死亡抑制剂[2]。最近研究证实,CoQ10能够在不依赖GPX4的情况下抑制磷脂过氧化和铁死亡[7]。CoQ10水平降低会导致ROS生成增加,从而促进铁死亡。补充CoQ10可以降低PD小鼠模型血浆、肝脏和大脑中的脂质过氧化标志物,并保护MPTP诱导的多巴胺能神经退行性变和α-syn聚集。硒是细胞抗氧化系统的关键元素,对硒半胱氨酸的形成和硒蛋白(如GPX4)的合成至关重要[29]。硒可以影响铁死亡的敏感性,补充硒可以增加对铁死亡抵抗能力,缺硒导致敏感性增加,主要通过调节GPX4的水平和活性来实现[30]。大脑中硒的水平在黑质和尾状核中最高。硒对PD具有保护作用,即补充硒可减少百草枯诱发PD大鼠模型的运动障碍和DNA损伤,足以逆转纹状体多巴胺及其代谢物的消耗。

2.5α-syn在铁死亡中的作用 聚集的α-syn是路易小体的主要成分之一,被认为是PD关键的病理标志。了解α-syn与铁死亡的关系,对理解铁死亡在PD形成中的作用非常重要。α-syn对调节与铁死亡途径相关的铁和脂质代谢方面发挥作用。铁螯合剂、D-PUFAs和铁抑素ferrostatin都能抑制毒性α-syn寡聚物诱导的细胞死亡[2,21]。

α-syn可以与Fe2+和Fe3+很强的结合,通过将无序的蛋白质转化为β-片层结构促进其寡聚。铁暴露于过表达α-syn的神经元培养物中,会增加聚集体形成及其对铁死亡的敏感性。此外,α-syn寡聚物与神经元中铁的相互作用可诱导ROS和脂质过氧化的产生,降低GSH水平,通过铁依赖的脂质过氧化诱导铁死亡[31]。因为PD患者多巴胺能神经元铁含量高,并且由于多巴胺代谢具有内在的高氧化环境。铁螯合剂不仅对PD相关的神经毒素损伤具有神经保护作用,而且可以减少体外α-syn聚集,拯救α-syn聚集小鼠模型中由铁暴露引起的行为缺陷[30,32]。铁可以调节α-syn的生物物理特性,在神经元铁稳态中发挥作用。α-syn在其5′UTR mRNA区域包含一个铁反应元件(IRE),在铁超载时调节神经元参与调节蛋白质翻译的结合位点。作为一种铁调节蛋白,铁消耗导致α-syn的翻译减少,而神经元中α-syn过表达导致Fe2+水平升高。α-syn作为一种铁还原酶,将Fe3+还原为Fe2+,并增加了铁依赖ROS和LOOH产生的敏感性。BAKSI等[33]提出,α-syn通过促进铁蛋白结合铁的摄取直接介导铁代谢,并与TfR1在质膜中共定位。α-syn的消耗会导致TfR在核内体中滞留,并消耗细胞铁储备,而α-syn的增加会通过干扰溶酶体水解酶的运输和破坏铁自噬来影响溶酶体的活性。α-syn调控细胞铁输入的另一种机制是通过上调铁转运蛋白DMT1的能力。BI等[34]的研究表明,α-syn诱导的p38丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)磷酸化parkin使其E3泛素连接酶活性失活,通过泛素化减少DMT1的降解。

α-syn除了与PD中的铁代谢相关之外,也与铁死亡的脂质代谢相关。α-syn与载脂蛋白具有高度的序列同源性。当暴露于游离或与磷脂结合的PUFAs时,α-syn会经历结构变化。PUFA的脂质过氧化产物可诱导α-syn的修饰,促进细胞中毒性寡聚物的形成[35]。其次,α-syn可以调节某些膜PUFAs的代谢。当α-syn在神经元或脑组织中过表达时,PUFAs在质膜中的脂质比和膜流动性都增加。而α-syn KO小鼠的脑内细胞质脂肪酸组成发生改变,膜流动性降低。α-syn还可以通过感知脂质堆积缺陷和诱导脂质横向扩张,有助于膜重构。上述研究表明,α-syn在膜脂肪酸组成中发挥作用,可以调节膜流动性、囊泡组装和突触传递。综上所述,α-syn在多巴胺能神经元中会产生促进铁死亡的环境。

3 小结与展望

通过对铁死亡认识的不断深入使人们对PD的形成过程有了进一步的理解。PD形成过程中的脂质过氧化升高,GSH水平降低,DJ-1和CoQ10缺乏,GPX4减少,铁沉积和α-syn聚集均考虑与铁死亡过程相关。PD患者黑质细胞铁死亡是PD形成的关键。揭示铁死亡过程参与PD形成的病理生理过程是当前研究的热点之一。开发抵抗铁死亡的策略可能是对PD患者进行疾病修饰治疗的关键之一。