海水基质活性磷酸盐标准物质研制

张 川,于 涛,于小焱,朱 勇,王丽芳,张晓慧

(1.国家海洋标准计量中心,天津 300112; 2.海洋计量检测技术创新中心,天津 300112; 3.自然资源部第二海洋研究所,浙江 杭州 310012; 4.自然资源部海洋生态系统动力学重点实验室,浙江 杭州 310012; 5.厦门大学 近海海洋环境科学国家重点实验室,福建 厦门 361102)

0 引言

磷是构成生命体的基本元素,在海洋中磷元素是海洋初级生产力的主要影响因素[1],同时磷也是海水富营养化的主要因素之一[2]。磷含量不足会限制生物生长,反之则可导致水体富营养化、生物繁殖过剩,进而造成生态灾害[3]。水体中磷以多种形态存在[4],包括溶解态无机磷/有机磷和颗粒态无机磷/有机磷。依据测定方法和操作步骤还可将其划分为活性磷、可酸解磷、总磷等类别。其中,经过滤后的样品,未经水解或消解,能通过磷钼蓝(Phospho Molybdenum Blue,PMB)分光光度法测得的称为活性磷[4-6]。在海洋科学研究及日常监测、调查工作中,磷酸盐的测定非常重要,建有标准的操作规范[7-8]。测定方法可分为湿化学法、紫外光谱法及离子选择性电极法[9]。为了保证测量结果的准确可靠,在测定过程中均需要使用标准物质开展质量控制[10-11]。

国内研制生产磷酸盐等营养盐标准物质的单位主要有自然资源部第二海洋研究所、国家海洋环境监测中心、中国计量科学研究院等。上述单位研制的标准物质的基质均为氯化钠溶液或纯水[12],将其用于测量海水样品会影响结果的准确性。加拿大国家研究委员会和日本国家计量院研制的MOOS-1、MOOS-3、NMIJ7601-a、NMIJ7602-a、NMIJ7603-a等有证标准物质(Certified Reference Material,CRM)以及韩国海洋科学技术研究所和荷兰皇家海洋研究所研制的曾用于国际间交流比对活动的相关样品,均采用大洋海水作为基质[13]。

本研究采用西太平洋表层海水为基质,通过对海水进行前处理和定量配制来制备海水基质磷酸盐标准物质,并对定值方法进行了优化,评估了制备样品的均匀性及稳定性,采用多实验室联合定值的方式确定了不同浓度的4个批次样品的标准值,并对其不确定度进行了分析。该研究填补了国内活性磷酸盐海水基质标准物质制备领域的空白。

1 材料

1.1 基质材料准备

海水采集自西太平洋(24°42′N,126°03′E),该区域为寡营养盐海域[14],表层海水活性磷酸盐浓度一般约为几十纳摩尔每升。采集时间为2017年7月,采水位置远离大陆或其他潜在污染源,水深大于1 500 m。采用水泵直接抽取表层(5 m左右)海水分装于25 L食品级聚乙烯塑料桶内保存,同时通过现场温盐深测量仪(conductivity-temperrature-depth measuring instrument,CTD)测量海水水温为28.5 ℃,盐度为33.6。采集的大洋海水运回实验室,储存在阴凉避光处,陈化1 a以上备用。陈化后的海水中易降解的有机物降解完全,而活性磷酸盐的浓度基本保持稳定。采用固相萃取富集与分光光度法联用技术测定采集海水的活性磷酸盐本底值为31.6 nmol/L,大约为本研究中试制标准物质浓度(最小为500 nmol/L)的1/17,该本底值对标准物质后续定值可能产生的影响很小,基本可忽略。

1.2 仪器与试剂

本研究使用荷兰斯卡拉(Skala)San++型营养盐自动分析仪作为测定活性磷酸盐的分析仪器。该仪器使用气泡间隔连续流动分析系统搭配紫外分光光度检测器进行磷酸盐浓度的测定。该检测器具备双光束背景扣除功能。测定实验中所用比色皿光程为5 cm。

实验室所用超纯水为自来水经过美国密理博(Millipore)Milli-Q型超纯水系统净化而成,其电阻率为18.2 MΩ·cm。抗坏血酸(VC)、四水合钼酸铵[(NH4)6Mo7O24·4H2O]、酒石酸锑钾[K(SbO)C4H4O6·H2O]均采购自Sigma-Aldrich公司,纯度为“优级纯”。磷酸二氢铵中磷、氮成分标准物质(GBW06502)采购自中国计量科学研究院。浓硫酸(97%)采购自天津化学试剂有限公司,纯度为“优级纯”。

2 实验方法

2.1 样品制备

实验采用0.45 μm混合纤维素微孔滤膜对天然大洋海水进行过滤,滤除海水中的悬浮物、不溶性颗粒。采用高温灭菌设备对过滤后的海水在124 ℃下灭菌2 h,采用容器及包装瓶分装,并在同样条件下灭菌 30 min。此过程可灭活天然海水中的各类活体以及容器内可能存在的细菌等微生物,以避免储存期间其生命活动导致水中活性磷酸盐浓度发生变化。将处理后的天然海水作为溶液基质,定量加入磷酸二氢铵标准物质(10 mmol/L)溶解混匀,调制后磷酸盐浓度大约为0.5、1.0、2.0和4.0 μmol/L,分装(批次代号分别为P1、P2、P3、P4)后进行均匀性检验和稳定性检验,并用于定值研究。

2.2 活性磷酸盐浓度测定方法

PMB分光光度法是一种测定水体中活性磷酸盐较成熟的方法:在酸性介质中,活性磷酸盐在酒石酸锑钾的催化下与钼酸铵反应生成磷钼杂多酸,该络合物被抗坏血酸还原为PMB络合物,在710 nm或882 nm波长处可进行分光光度测定[15]。该方法不仅可测定微摩尔级别的样品,结合氢氧化镁共沉淀法[14,16]、流动分析-固相萃取法[17-19]等技术,检出限可达纳摩尔级别,是海水中痕量磷元素分析的有力手段。此外,由于海水高盐及共存离子复杂等特性会造成灵敏度或仪器操作受限,诸如化学发光法、色谱法、质谱法等方法多用于测定淡水水体磷酸盐含量。

2.3 样品均匀性检验方法

均匀性用于描述标准物质特性值的空间分布特征。根据《标准物质的定值及均匀性、稳定性评估》(JJF 1343—2022)[20]的要求,在分装过程中采用分层随机抽样的方法抽取11瓶样品用于检验,每瓶样品平行测定 3次。采用单因素方差分析(F检验)进行统计,若统计量F值小于临界值,则认为样品均匀。

2.4 样品稳定性检验方法

稳定性用于描述标准物质特性值随时间的变化,即样品特性的时间分布特征。研制过程中通过稳定性检验可分析评估稳定性相关的不确定度分量,同时以此确定合适的保存和运输条件以及有效期。检验主要分为长期稳定性和短期稳定性,前者考察标准物质在一般保存条件下1年以上的稳定性,后者考察运输等外部因素引起的短期稳定性变化。长期稳定性检验中,在样品制备后第0、0.5、1、2、4、6、15个月,每次随机抽取1组样品(共7组)进行测定。短期稳定性检验中,分别以不同环境条件保存样品(环境温度为-20、4、25、65 ℃),在样品保存0、1、4、7天后,每次随机抽取1组样品进行测定。

按照JJF 1343—2022[20]的要求采用趋势分析法进行稳定性评估。作时间-测量值数据图,并进行线性拟合。计算直线斜率β1的标准偏差s(β1),并作t检验。若满足式(1)要求,则表明监测数据随时间没有显著性的趋势变化,样品稳定性良好:

|β1|

(1)

式中:t95,n-2为双边检验置信概率95%下t分布临界值。判定长期稳定性时(n=7),t95,n-2查表为2.571;判定短期稳定性时(n=4),t95,n-2查表为4.303。

2.5 定值误差统计分析

采用多家实验室联合测试的方式进行定值,参与定值的实验室均具有海水磷酸盐检测计量认证资质。相关实验室来自专业检验检测机构、海洋仪器设备研发机构、科研院所、海洋水质监测业务部门等多个领域的多家单位。向上述单位发送随机抽取的样品及测试说明,由各实验室自行独立测定后按照统一的数据格式反馈结果及质控信息。

对以上数据进行汇总,通过以下统计分析手段剔除异常值和离群值,并进行正态性检验,对符合正态分布的数据,同组取平均值作为定值结果。

1)格拉布斯检验

2)科克伦检验

接公式(2)计算各组数据的C值,查表获得临界值C(α,m,n),其中α为显著性水平,取0.05或0.01;m为数据组数;n为重复测量次数。若C≤C(0.05,m,n),表明各组数据平均值为等精度;若C(0.05,m,n)≤C≤C(0.01,m,n),仍按等精度处理;若C>C(0.01,m,n),则为不等精度。

(2)

3)狄克逊检验

将测定数据按由小到大的顺序排列,第n个数据记为X(n),按照式(3)和式(4)计算r1和rn值。

(3)

(4)

查表获得临界值f(α,n),其中α为显著性水平,n为数据序列数。若r1>rn,且r1>f(α,n),则判定X(1)为异常值;若rn>r1,且rn>f(α,n),则判定X(n)为异常值;若r1和rn值均小于f(α,n)值,则所有数据保留。

4)夏皮洛-威尔克正态分布检验

将数据按由小到大的顺序排列,计算统计量W:

(5)

当W>W(n,p)时,则接受测定数据为正态分布。其中W(n,p)是与测量次数n和置信概率p有关的数值,可查表得到。

2.6 不确定度评定方法

本样品特性值的不确定度由均匀性、稳定性及定值过程三部分引入。通过分析不确定度来源,建立数学模型,对各类来源分别进行分析计算,按照公式(6)计算合成标准不确定度。合成标准不确定度乘以扩展因子k可以得到扩展不确定度(k=2),扩展不确定度除以测量值可以得到相对扩展不确定度。

(6)

式中:uCRM为标准物质的合成标准不确定度,ubb为标准物质的均匀性引入的不确定度,ults为标准物质的稳定性引入的不确定度,uchar为标准物质的定值过程引入的不确定度。

2.6.1 均匀性引入的不确定度

对同一批次样品进行均匀性检验,通过下列公式计算不确定度分量:

(7)

2.6.2 稳定性引入的不确定度

统计稳定性数据,采用线性回归假设,通过下列公式计算不确定度分量:

ults=X×ub

(8)

式中:X为样品保存时间;ub为时间(X)与测定磷酸盐浓度值(Y)线性拟合后,曲线斜率的标准偏差(标准不确定度)。

2.6.3 定值过程引入的不确定度

对多家实验室的测量结果进行统计分析,计算由多家实验室联合定值引入的不确定度分量,计算方式为

(9)

(10)

(11)

3 定值方法优化研究

3.1 反应温度的优化

在PMB生成的反应中,温度影响反应热力学[22-23],进而导致反应效率变化。首先采用分析仪厂商推荐的试剂条件及仪器设定,考察不同反应温度下的测定效果。设置分析仪反应池恒温温度在20～60 ℃范围内依次变化,分别记录同一组样品的测定结果。结果显示在此温度范围内未发现显著的测量结果差异。因此后续实验保证在室温下进行测定,测定过程中仪器自带反应池恒温器统一设定为30 ℃。

3.2 试剂质量浓度的优化

图1 抗坏血酸质量浓度条件优化结果

图2 钼酸铵质量浓度条件优化结果

图3 酒石酸锑钾质量浓度条件优化结果

优化后的测试条件:反应温度为30 ℃,抗坏血酸质量浓度为4 g/L,混合酸中钼酸铵质量浓度为4 g/L,硫酸溶液体积分数为4%,酒石酸锑钾质量浓度为100 mg/L。

3.3 定值方法性能评价

配制系列标准溶液及空白溶液,测定后作标准曲线,校准范围为(0～5) μmol/L,线性相关度R2为0.999 9。平行测定11次空白样品并计算标准偏差(s),方法的检出限VMDL按照公式VMDL=s·t(10,0.99)计算,其中t(10,0.99)=3.17,检出限结果为0.03 μmol/L。

采用日本国家计量院制造的编号为NMIJ7603-a、NMIJ7602-a的高浓度和中浓度天然海水活性磷酸盐标准物质作为验证样品,对定值方法的可靠性和准确度进行验证(见表1),结果显示该定值方法误差在0.05 μmol/L以内,可靠性良好。

表1 定值方法准确度和可靠性验证结果

采用优化后的定值方法对本研究制备的4种浓度的海水活性磷酸盐标准物质进行9次重复性测定,相对标准偏差(relative standard deviation,RSD)值见表2。从数据可见,随着样品浓度值的减小,RSD基本呈增大趋势,这与大多数痕量分析结果类似,即目标物浓度越接近方法检出限,测量结果精密度越差。

表2 定值方法精密度验证结果

4 标准物质检验定值结果

4.1 均匀性检验结果

单因素方差分析结果(表3)显示,4种浓度活性磷酸盐标准物质的均匀性检验的F值均小于临界值(2.30),说明4种海水活性磷酸盐标准物质的均匀性良好,符合标准物质样品的要求。

表3 均匀性检验结果

4.2 稳定性检验结果

长期稳定性检验中对抽取的样品在15个月内先后测量7次,4种浓度活性磷酸盐样品在不同时间测定的结果及统计数据见表4和图4。经分析,全部样品的稳定性均满足公式(1)要求,即随时间推移,特性值没有显著变化趋势,可认为是稳定的。

表4 长期稳定性检验结果

图4 长期稳定性检验结果

短期稳定性是为了考察样品在运输、野外条件下可能受到的影响。将样品保存在4个环境温度中分别进行7天内稳定性评价(见图5和表5)。经分析,在包含高温、低温、常温的全部环境条件下,所有样品稳定性均满足公式(1)要求,即随时间推移,特性值没有显著变化趋势,可认为是稳定的。

表5 短期稳定性检验结果

图5 短期稳定性检验结果

4.3 定值结果及不确定度

本研究中共6家实验室参与了联合定值,均采用PMB分光光度法测定。其中两家实验室采用流动分析技术,通过在线反应方式完成分析,其余4家实验室参照GB/T 12763.4—2007[7],采用手工离线方式完成显色及测定。各实验室数据经过统计检验,均符合要求并被采纳(表6和表7)。

表6 原始数据统计检验结果

表7 联合定值测量结果

统计分析后得到所研制标准物质的目标物标准值及各个不确定度分量,对各分量进行合成后计算得到标准不确定度,取包含因子k=2,得到相对扩展不确定度分别为10%、5%、3%和2%(表8)。

表8 不确定度分析结果

5 结论与展望

本研究以西太平洋表层海水为基质,制备了0.5～4.0 μmol/L系列浓度的海水活性磷酸盐标准物质。通过定值方法研究、验证、应用及均匀性、稳定性统计检验等,对该标准物质的相关性能进行了评价,结论如下。

1)通过对PMB分光光度法进行优化和验证,确认该方法检出限为0.03 μmol/L,可满足本研究中所制备的低浓度标准物质的定值测量需求。

2)通过均匀性检验和稳定性检验,确认所制备的标准物质均符合批次内均匀性要求,且长期稳定性可达15个月,在高温、低温、常温不同贮存环境下7天可保持特性值无显著性变化。

3)经不确定度分析,4个批次标准物质最终定值的相对扩展不确定度为2%～10%。

本研究成果可直接用于海洋样品分析中的质控环节,或用于校准海洋专用磷酸盐分析仪器等方面,由于与分析目标物基质一致,可有效减小基质差异引起的测量误差。鉴于目前样品覆盖浓度范围较小,且不确定度指标与已有产品仍有差距,后续研究将继续完善制备技术和定值技术,针对不同海域特点研制更宽浓度范围的样品,以满足我国海洋生态保护修复及环境监测等多方面的需求。