中国毛虾自溶前后多肽和氨基酸的变化

祝宝华李晓晖,2,3杨志艳惠婷婷徐晨晨李 燕,2,3

(1. 上海海洋大学,上海 201306;2. 上海水产品加工及贮藏工程技术研究中心,上海 201306;3. 农业部水产品贮藏保鲜质量安全风险评估实验室,上海 201306)

中国毛虾(Aceteschinensis)又称毛虾、虾米等,是中国渤海、黄海以及东南沿岸浅海近海水域特有的一种虾类品种。据统计[1],2020年中国毛虾捕捞量达36.7万t,占虾类捕捞量的30.45%,位列第一。毛虾的主要加工产品为虾皮、虾酱等,产品附加值低。虾体发生肌肉软化主要由自身存在的内源酶(如胰蛋白酶、组织蛋白酶和钙蛋白酶等)引起[2]。虾头中的内源酶在一定条件下被激活,并与周围组织发生反应或者导致蛋白质降解,从而导致虾的自溶[3]。陈诗妍等[4]研究发现,贮藏过程中,虾头中富含的内源酶对虾体中的肌原纤维蛋白重链和肌动蛋白有较强的降解作用,其中胰蛋白酶对肌原纤维蛋白的降解作用最强,且随着贮藏温度和时间的增大,降解程度越大。

中国毛虾干基中粗蛋白含量为(75.85±0.19)%,必需氨基酸(EAA) 含量为39%[5],是制备生物活性肽和氨基酸的优良来源。且毛虾活性肽具有抗氧化性[6]、增强免疫[7]、降血压[8]等活性。Cao等[9]利用Alcalase 2.4L酶酶解中国毛虾蛋白,制备了具有自由基清除活性的低分子肽,且分子量为915～207 Da的小分子肽具有较强的DPPH自由基和羟自由基清除活性。许萍等[10]利用3942中性蛋白酶酶解中国毛虾蛋白,筛选出的二肽(Ser-Pro)具有较高的血管紧张素转移酶(ACE)抑制活性。利用外源酶酶解法以回收蛋白质资源是当前较普遍的低值虾类高值化利用方法[11],但存在成本较高的问题,且对毛虾内源酶特性和自溶降解产物的研究尚未见报道。有研究[12-13]显示,虾的自溶产物具有较好的抗氧化和抑菌活性,能够制备生物活性肽。尹雪莲等[14]采用50 ℃水浴对鹰爪虾头进行自溶反应,筛选得到了抗冻肽。

研究拟探究中国毛虾内源蛋白酶的酶学特性,分析其自溶的最适条件,以及自溶过程中多肽含量、自溶前后游离氨基酸和自溶产物分子量的变化情况,以期为低值毛虾小分子生物活性肽和氨基酸类产品开发提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂

中国毛虾:新鲜毛虾挑拣分装后于-20 ℃贮藏,市售;

抑肽酶、细胞色素C、杆菌肽、Gly-Gly-Gly、Gly-Gly-Tyr-Arg:上海索莱宝生物科技有限公司;

乙腈、三氟乙酸:美国Sigma-Aldrich公司;

大豆肽:兰州沃特莱斯生物科技有限公司;

酪氨酸:分析纯,天津诺奥科技发展有限公司;

三氯乙酸(TCA)、氢氧化钠、硫酸铜、乙醇等:分析纯,国药集团化学试剂有限公司。

1.1.2 主要仪器设备

多头磁力搅拌器:HJ-4A型,金坛市科析仪器有限公司;

台式高速离心机:TG16-WS型,湖南湘仪实验室仪器开发有限公司;

分光光度计:UV-1800PC型,上海美谱达有限公司;

凝胶色谱柱:TSKgelG2000 SWXL型,北京金欧亚科技发展有限公司;

液相色谱仪,E2695型,谱质分析检测技术(上海)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 内源蛋白酶的分离纯化

(1) 硫酸铵法分级沉淀:根据陈康玉等[15]的方法并修改。将粉碎后的中国毛虾虾糜按m虾糜∶V缓冲液为1∶4 (g/mL)加入磷酸缓冲溶液(pH 6.8),4 ℃静置过夜(约8 h),4 000 r/min离心8 min,收集上清液并加入硫酸铵至20%饱和度,4 ℃静置4 h;8 000 r/min离心10 min,收集上清液加入硫酸铵至80%饱和度,4 ℃静置4 h;8 000 r/min离心10 min,收集沉淀。将沉淀按m沉淀∶V缓冲液为1∶1 (g/mL)加入磷酸缓冲液,4 ℃下,于8 000 Da透析袋中透析4 h,重复3次,即得粗酶。

(2) Sephadex G-50凝胶层析:采用去离子水平衡柱子(1.6 cm×50 cm),粗酶液用0.45 μm滤膜过滤后,用去离子水洗脱,流速0.5 mL/min,紫外检测波长280 nm,收集出峰组分。冷冻干燥后进行酶学性质研究。

1.2.2 酶活力测定 采用福林酚法[16]。

1.2.3 最适pH和最适温度的选择 30 ℃下于不同pH(2.0,3.0,4.0,5.0,6.0,7.0,8.0,9.0,10.0,11.0)下稀释酶液,测定蛋白酶活力;最适pH下,考察温度(30,35,40,45,50 ℃)对蛋白酶活力的影响。

1.2.4 毛虾蛋白自溶制备多肽单因素试验

(1) 自溶温度:固定pH 7.0,反应时间3 h,考察自溶温度(20,30,40,50,60 ℃)对多肽质量浓度的影响。

(2) 自溶pH:固定反应时间3 h,最佳自溶温度,考察自溶pH(5,6,7,8,9,10)对多肽质量浓度的影响。

(3) 自溶时间:固定最佳自溶温度,最适pH,考察自溶时间(1,2,3,4,5,6 h)对多肽质量浓度的影响。

1.2.5 正交试验 在单因素试验基础上,选择自溶pH、自溶温度和自溶时间进行三因素三水平的正交试验,优化毛虾蛋白自溶的最佳工艺条件。

1.2.6 多肽含量测定 参照鲁伟等[17]的方法,利用大豆肽(含量>99%)制作标准曲线方程为y=0.053 7x,R2=0.986 9。

1.2.7 游离氨基酸含量测定 参照程亚美等[18]的方法。

1.2.8 分子量测定 采用凝胶色谱法(GPC)[19]。以抑肽酶、细胞色素C、杆菌肽、Gly-Gly-Gly、Gly-Gly-Tyr-Arg为标准品,通过制备洗脱体积—分子量标准曲线和比较样品的洗脱量来计算分子量分布。色谱条件:色谱柱TSK-GELG2000SWxl(7.8 mm × 300 mm),流动相为乙腈—水—三氟乙酸(V乙腈∶V水∶V三氟乙酸为45∶55∶0.1),检测波长220 nm,温度30 ℃。样品经0.22 μm滤膜处理,进样量10 μL,流速0.5 mL/min。

1.2.9 数据处理 所有试验至少重复3次,采用SPSS 20、Origin 8.5等软件进行统计分析和绘图,结果表示为平均值±标准差。

2 结果与分析

2.1 内源酶的分离纯化

由图1可知,毛虾虾糜液经纯化后,仅得到单一峰,表明提取物质单一,含量高,提取效果好。

图1 Sephadex G-50凝胶层析纯化内源酶

2.2 酶的最适pH和最适温度

由图2(a)可知,内源蛋白酶在碱性条件下活性较高。当pH值为2.0～8.0时,随着pH值的升高,蛋白酶活力增大,在pH 8.0时达最大值4 818 U/g。当pH值>8.0时,蛋白酶活力随pH值的增加逐渐降低。王贺等[20]研究表明,凡纳滨对虾虾头中碱性蛋白酶的酶活性峰为pH 8～10。

字母不同表示差异显著(P<0.05)

由图2(b)可知,内源蛋白酶的最适温度为45 ℃。当温度为30～45 ℃时,随着温度的上升酶活力增强。当温度<40 ℃时,酶活力值上升平稳,说明在此温度范围内的蛋白酶较为稳定。当温度由40 ℃升至45 ℃时,酶活力迅速增长并达最大(6 916 U/g)。当温度为50 ℃时,酶活力显著下降,表明毛虾内源蛋白酶不耐高温。潘滨等[21]

研究发现,凡纳滨对虾体内碱性蛋白酶的最适温度为40～60 ℃。

2.3 单因素试验

2.3.1 自溶温度 由图3可知,当自溶温度<40 ℃时,随着自溶温度的升高,多肽质量浓度不断上升。当自溶温度为40 ℃时,多肽质量浓度达到最大(8.2 mg/mL),此后自溶温度继续上升,多肽质量浓度迅速下降,说明温度过高,内源酶失活,导致自溶水解效果减弱。故选择40 ℃为最适自溶温度。

字母不同表示差异显著(P<0.05)

2.3.2 自溶pH 由图4可知,随着起始pH值的增大,多肽质量浓度呈先升高后降低趋势。环境为偏酸性时,多肽质量浓度较低,且随着酸性的减弱,多肽质量浓度缓慢升高。当pH值<8.0时,多肽质量浓度急剧升高,在pH 8.0时达最大,之后开始下降。这表明毛虾内源蛋白酶属于一种碱性蛋白酶。陈志峰[22]研究发现,生晒毛虾内源酶的自溶适宜pH为7.5～8.0,此时氨基态氮含量达到最高。故选择pH 8.0为最佳自溶pH。

字母不同表示差异显著(P<0.05)

2.3.3 自溶时间 由图5可知,毛虾酶解液中多肽质量浓度随自溶时间的延长而逐渐增加。当自溶时间<3 h时,多肽质量浓度显著增加(P<0.05);当自溶时间>3 h时,随着自溶时间的增加,多肽质量浓度的变化趋于平稳。其原因可能是反应初始阶段,蛋白酶的底物丰富,酶活性较高,但随着自溶时间的增加,底物减少,酶活力逐渐下降[23]。故选择3 h为最佳自溶时间。

字母不同表示差异显著(P<0.05)

2.3.4 正交试验 根据单因素试验结果,选择自溶pH、自溶温度和自溶时间为因素,以多肽质量浓度为响应值,进行三因素三水平正交试验。试验因素水平见表1,试验设计及结果见表2。

表1 正交实验因素水平表

表2 正交试验设计方案及结果

由表2可知,各因素对中国毛虾自溶生产多肽的影响程度依次为自溶时间>自溶pH>自溶温度,最佳方案为A2B2C3,即自溶pH 8.0,自溶温度40 ℃,自溶时间4 h,进行3次平行验证实验,测得多肽质量浓度平均值为10.36 mg/mL。

2.4 毛虾自溶水解液中游离氨基酸和分子量变化

2.4.1 游离氨基酸含量变化 由表3可知,毛虾自溶水解液中共检出17种游离氨基酸(色氨酸未测)。毛虾自溶后游离氨基酸总含量提高了(26.16±0.02)%,必需氨基酸总占比由(40.22±0.42)%增长至(43.64±0.52)%,必需氨基酸与非必需氨基酸的比值由0.67提高至0.77,二者均超过了世界卫生组织(WHO)和粮食及农业组织(FAO)建议的参考值(40%和0.6)[24],表明毛虾内源蛋白酶解液具有较高的营养价值。水解产物中的疏水性游离氨基酸含量增加了(25.59±0.08)%。有研究[25-26]表明,疏水性氨基酸能有效清除DPPH自由基和超氧自由基,说明毛虾自溶产物具有良好的抗氧化潜力。鲜味氨基酸比例由(25.49±0.13)%下降至(22.03±0.21)%,甜味氨基酸比例由(13.32±0.34)%下降至(11.54±0.18)%,苦味氨基酸比例由(46.50±0.42)%提升至(51.04±0.32)%,与胡玲萍等[27]的结果相似。因此,利用中国毛虾自溶液制备调味品时,应慎重选择自溶条件。

2.4.2 多肽分子量分布变化 由图6可知,毛虾蛋白经内源酶自溶作用后,能够降解成不同分子量的小分子多肽。其中,分子量>5 000 Da的多肽占比由自溶前的18.75%显著下降至6.22%(P<0.05),分子量为3 000～5 000 Da的多肽占比由自溶前的1.62%显著增加至7.00%(P<0.05);分子量为1 000～3 000 Da的多肽自溶前占比为9.48%,自溶后该分子量范围的多肽未测出;而分子量<1 000 Da的小分子肽占比由自溶前的70.15%显著增加至86.77%(P<0.05)。综上,毛虾自溶产物中分子量<1 000 Da的小分子多肽比例明显提升,表明中国毛虾内源蛋白酶对大分子蛋白具有降解作用,自溶法具有制备生物活性肽的潜力。

图6 自溶前后产物的分子量分布

3 结论

对中国毛虾内源蛋白酶进行了分离纯化。结果表明,毛虾内源蛋白酶的最适温度为45 ℃,最适pH为8.0,具有碱性蛋白酶的特性,不耐高温。毛虾内源蛋白酶的最适自溶工艺条件为自溶pH 8.0、自溶温度40 ℃、自溶时间4 h,该条件下的多肽质量浓度为10.36 mg/mL。自溶后,总游离氨基酸和必需氨基酸占比分别提升了(26.16±0.02)%和(8.50±0.03)%,疏水性氨基酸占比增加了(25.59±0.08)%,鲜味氨基酸和甜味氨基酸占比分别降低了(3.46±0.02)%和(1.78±0.01)%,而苦味氨基酸占比增加了(4.54±0.02)%;内源蛋白酶降解产物分子量分布<1 000 Da的占比由70%提升至87%。后续将进一步研究自溶技术生产的小分子肽功能活性(如抗氧化、抗菌、降血压等)。