量子点微球免疫层析试纸条检测鸡蛋中恩诺沙星的性能评价

张富生王宇宸卢礼生邓家军陈俊松杨琳芬郭 静吴仁伟赖卫华

(1. 江西省农产品质量安全检测中心,江西 南昌 330077;2. 南昌大学食品科学与资源挖掘全国重点实验室,江西 南昌 330047;3. 九江市农产品质量安全中心,江西 九江 332000)

恩诺沙星属于喹诺酮类广谱抗菌药,对革兰氏阴性菌和阳性菌均有良好的抗菌作用,在降低畜禽动物的发病率和死亡率等方面起到十分显著的作用,已成为现代畜牧养殖业中不可缺少的药物之一[1]。但是,畜牧业中滥用恩诺沙星和超标使用恩诺沙星的现象普遍存在[2-3],其后果一方面是导致动物性食品中存在兽药残留,影响人类的健康;另一方面,各种养殖场大量排泄物向周围环境排放,兽药又成为环境污染物,给生态环境带来不利影响[4]。

中国对兽药使用和残留污染防控非常重视,GB 31650—2019和GB 31650.1—2022对各种食品中的兽药残留有明确限量规定,其中恩诺沙星在鱼、家禽、猪、牛、羊和其他动物组织中不得超过100 μg/kg,在禽蛋中不得超过10 μg/kg。

目前,恩诺沙星的主要检测方法有高效液相色谱法[5-6]、质谱联用法[7-10]、表面增强拉曼散射法[11-14]、酶联免疫吸附法[15-16]和免疫层析检测方法[17-21]等。其中, GB/T 21312—2007是确证方法,可以对恩诺沙星进行精确定量检测,但其设备昂贵、操作复杂、检测成本高、周期长等,因而无法满足大批量样本快速筛查的需要。目前,国家对食品安全的重视程度不断提高,对快速检测产品的需求越来越大,对食品安全限量标准的要求越来越严格,对食品安全快速检测方法灵敏度的要求也随之提高。灵敏度要求非常高的情况下,传统的快检方法通过肉眼进行颜色深浅的判断,主观性强,容易造成误差,出现较多的假阳性和假阴性结果,也无法提供数字化结果[22-24]。

量子点微球荧光免疫层析法是一种新型快速检测技术[25]。使用结构性能和光学性能优异的量子点荧光微球作为标记物,基于竞争抑制免疫层析技术原理,通过便携式荧光读取仪进行数据读取和分析,根据已设定的标准曲线计算样品中待测物质含量,对动物源性食品中金刚烷胺进行定量检测,提高了检测灵敏度,实现了对目标物的数字化检测,减少了人为因素导致的假阳性或假阴性结果。国家市场监督管理总局2023年1月发布了《关于规范食品快速检测使用的意见》[26],研究拟参照其附件4《食品快速检测产品符合性评价技术要求》,对恩诺沙星(鸡蛋)量子点微球免疫层析试纸条快检产品进行符合性评价,以期为鸡蛋中恩诺沙星的现场快速筛查提供产品选择依据。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

1.1.1 主要仪器

干式荧光免疫分析仪:AF-100型,激发光和发射光波长分别为365,610 nm,江西维邦生物科技有限公司;

恒温孵育器:DH-200型,武汉钟瑞生物科技有限公司;

天平:ZT-2型,0.01 g,上海赞维衡器有限公司;

振荡器:JC-25型,金坛区白塔金昌实验仪器厂;

掌上离心机:Meteor 7.2k型,宁波拓普森科学仪器有限公司。

1.1.2 主要材料

150个经参比方法检测为阴性的鸡蛋样本:市售;

50个与确证方法比较的实际鸡蛋样本:江西省农产品质量安全专项监测的50批次鸡蛋样品,编号为1～50;

恩诺沙星(鸡蛋)量子点微球免疫层析试纸条:定量检测范围为2.5～40.0 μg/kg,江西维邦生物科技有限公司;

恩诺沙星、环丙沙星、马坡沙星、洛美沙星、氧氟沙星、诺氟沙星、培氟沙星、达氟沙星、二氟沙星、氟甲喹、噁喹酸和沙拉沙星等标准品:德国DR.E公司。

1.2 试验方法

1.2.1 盲样样本制备 按照GB 31650.1—2022要求,鸡蛋中恩诺沙星的最大残留限量为10 μg/kg。依据《关于规范食品快速检测使用的意见》中附件4《食品快速检测产品符合性评价技术要求》制备加标样本。使用经参比方法检测为阴性的鸡蛋样本进行加标,因恩诺沙星属于有国家限量要求的物质,制备3个浓度水平的加标样本。空白样品、标准限量要求的0.5倍浓度水平加标样本用以评价快检方法的假阳性率,每个浓度水平的样本50份,标准限量要求1倍浓度水平的加标样本50份,用以考察快检方法的假阴性率。

1.2.2 量子点微球免疫层析试纸条的样本前处理和检测方法

(1) 样本前处理:取样部分按GB 31650 执行(将鸡蛋去壳后搅匀),准确称取4 g样本于50 mL离心管中,加入3 mL恩诺沙星样本提取剂,漩涡振荡混匀2 min,4 000 r/min离心5 min,准确吸取100 μL上清于离心管中,加入500 μL恩诺沙星样本稀释液混匀,离心2 min,上层溶液即为备用待测液。

(2) 检测方法:测试前打开干式荧光免疫分析仪,将产品ID卡插入仪器读取产品标准曲线,将恒温孵育器设置反应温度为37 ℃,反应时间为10 min。检测时将恩诺沙星量子点微球荧光免疫层析快速检测卡平放至恒温孵育器上,用移液器吸取90 μL备用待测液加入检测卡加样孔中,37 ℃孵育10 min,反应结束后将检测卡插入干式荧光免疫分析仪检测卡槽中进行数据读取,仪器会自动给出测试结果。

1.2.3 灵敏度评价 检测恩诺沙星加标浓度为10 μg/kg的样本50份,并按式(1)计算灵敏度。

(1)

式中:

P+——灵敏度,%;

N11——检出阳性结果的阳性样品数;

N1——总阳性样品数。

1.2.4 交叉反应率评价 在空白样本中添加环丙沙星、马坡沙星、洛美沙星、氧氟沙星和诺氟沙星标准品,使其终质量浓度为1 000 μg/L,用恩诺沙星量子点微球荧光免疫层析快速检测试剂盒检测,记录检测结果为阳性的最小浓度,并按式(2)计算交叉反应率。

(2)

式中:

CR——交叉反应率,%;

C1——目标物质检出限,μg/L;

C2——干扰物质检出阳性时的最小质量浓度,μg/L。

1.2.5 假阴性率和假阳性率评价 依据《关于规范食品快速检测使用的意见》中附件4《食品快速检测产品符合性评价技术要求》,分别按式(3)、式(4)计算所有检测结果中的假阴性率和假阳性率。

(3)

(4)

式中:

N12——阳性样品的阴性结果数;

N1——总阳性样品数;

N21——阴性样品的阳性结果数;

N2——总阴性样品数。

1.2.6 实际鸡蛋样本的检测比较 50个实际鸡蛋样本分别用GB/T 21312—2007和量子点微球免疫层析试纸条快检方法进行检测,并比较结果符合率。

2 结果与分析

2.1 灵敏度

由表1可知,检出阳性结果的阳性样品数占总阳性样品数的百分比为100%,即灵敏度为100%。

表1 标准限量要求1倍浓度水平鸡蛋(10 μg/kg)的量子点微球免疫层析试纸条检测结果

2.2 交叉反应率

由表2可知,恩诺沙星(鸡蛋)量子点微球免疫层析试纸条在检测氟喹诺酮类药物环丙沙星、马坡沙星、洛美沙星、氧氟沙星、诺氟沙星、培氟沙星、达氟沙星、二氟沙星、氟甲喹、噁喹酸和沙拉沙星时,交叉反应率均<0.1%。

表2 量子点微球免疫层析试纸条的交叉反应率

2.3 假阴性率和假阳性率

由表3、表4可知,恩诺沙星量子点微球免疫层析试纸条在检测鸡蛋中恩诺沙星时,50个空白样品的检测结果均为阴性,50个标准限量要求的0.5倍浓度水平盲样的检测结果出现50个阴性,100个阴性盲样鸡蛋的整体假阳性率为0%。50个标准限量要求的1倍浓度水平盲样的检测结果均为阳性,即量子点微球免疫层析试纸条的假阴性率为0%。

表3 空白样品鸡蛋量子点微球免疫层析试纸条检测结果†

表4 标准限量要求的0.5倍浓度水平鸡蛋(5 μg/kg)量子点微球免疫层析试纸条检测结果

2.4 实际鸡蛋样本检测方法比较

由表5可知,采用液质联用法检测时,5、36、40、42号样品的检测结果分别为0.73,0.57,5.57,21.90 μg/kg,其他样品均未检出。采用量子点微球免疫层析试纸条检测时,40、42号样品检测结果分别为5.34,22.02 μg/kg,其他样品均未检出(量子点微球免疫层析试纸条的定量检测限为2.5 μg/kg),说明液质联用法和量子点微球免疫层析试纸条检测结果的符合率较高。

表5 实际鸡蛋样本检测方法的比较†

3 结论

通过对恩诺沙星量子点微球荧光免疫层析产品评价,结果显示该方法可以满足GB 31650.1—2022鸡蛋中恩诺沙星残留的国家限量要求,其灵敏度为100%,假阴性率为0%,假阳性率为0%,实际鸡蛋样本检测时,与国家参比方法符合率高(GB/T 21312—2007)。量子点微球荧光免疫层析法检测准确度高、特异性好,产品操作简便、快速且可以同时出具定性结果和数字化检测结果,适合鸡蛋中高风险因子的大批量样本现场筛查。后续可以基于量子点微球荧光免疫层析平台,建立更多的鸡蛋中兽药残留的快速检测方法。