葛根总黄酮的水提工艺优化研究

张国栋，王晓彤，聂文娟，黄武军，徐向荣

（1.江西农业工程职业学院，江西樟树 331200；2.江西仁仁健康产业有限公司，江西樟树 331200；3.仁和集团发展有限公司，江西樟树 331200）

葛根（Pueraria DC）又名葛藤，葛麻叶，甜葛藤，粉葛藤等，是豆科（Laguminos ae）多年生藤本植物。世界上有18 种，我国有十余种[1]。其中，野葛（P.lobata(willd)ohwi）具有解肌退热、生津止渴、透疹、升阳止泻、通经活络、解酒毒等功效，自古以来主作中药，用于外感发热头痛、项背强痛、口渴、消渴、麻疹不透、热痢、泄泻、眩晕头痛、中风偏瘫、胸痹心痛、酒毒伤中等[2]。

较多学者对葛根主要成分进行了提取、分离和鉴定，发现葛根的成分有如下几类：异黄酮类，包括大豆苷元（大豆素、大豆黄素、黄豆苷元）、大豆苷、葛根素等；葛根苷类，包括葛根苷A、B、C 3 种；三帖皂苷类，包括以葛根皂苷A、B、C 命名的7 种新型齐墩果烘型皂角精醇、槐二醇、大豆皂醇B、大豆苷醇A 等；生物碱及其他化合物类。在葛根的有效成分中，研究的最多的是异黄酮类，其中对葛根素的研究更受关注[3]。

研究表明，葛根具有降低血压、减慢心率、降低心肌耗氧量、扩张冠状血管、改善正常和缺血心肌的代谢，改善脑循环、周围血管及微循环，抗心律失常、降血糖降血脂、抗肿瘤、抗氧化等作用[4-8]。由于葛根具有多种药理作用，目前，上市的产品有葛根片、葛根胶囊、葛根口服液和葛根饮料等，拟用葛根提取液进行发酵，制备成葛根酵素，以填补市场上葛根酵素类产品的空白，对葛根水提工艺进行研究，为葛根酵素的生产奠定试验基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

葛根（干制品），江西仁德中药饮片有限公司提供；芦丁（95%），国药集团化学试剂有限公司提供；乙醇、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠，均为分析纯，西陇科学股份有限公司提供。

1.2 仪器与设备

C21-HT2116HM 型多功能电磁炉，广东美的生活电器制造有限公司产品；L3 型可见分光光度计，上海佑科仪器仪表有限公司产品；SHA-C 型水浴恒温振荡器，杭州旌斐仪器科技有限公司产品；SHP-160 型生化培养箱，上海鸿都电子科技有限公司产品；HH-4 型数显恒温水浴锅，常州亿通分析仪器制造有限公司产品；高速万能粉碎机，天津市泰斯特仪器有限公司产品。

1.3 试验方法

1.3.1 葛根总黄酮的测定

采用硝酸铝显色法测定葛根提取液中的总黄酮含量[9]，精密称定50 mg 芦丁标准品置于50 mL 烧杯中，用浓度为0.1 mol/L 的氢氧化钠溶液溶解后转移至25 mL 容量瓶中，定容至刻度，摇匀，即可得质量浓度为2 mg/mL 的芦丁标准溶液。

精密吸取芦丁标准溶液0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL 至具塞试管中，分别加入1.0，0.8，0.6，0.4，0.2，0 mL 浓度为0.1 mol/L 氢氧化钠溶液，再加体积分数为30%的乙醇溶液至5 mL，加入的质量分数为5%的亚硝酸钠溶液0.3 mL，摇匀，静置6 min 后，加入质量分数为10%的硝酸铝溶液0.3 mL，摇匀，静置6 min，加入浓度为1 mol/L 的氢氧化钠溶液4 mL，加0.4 mL 的水，摇匀，静置15 min，测定其于波长510 nm 下的吸光度。以吸光度A 为纵坐标，浓度C为横坐标，绘制标准曲线，线性拟合得到回归曲线及相关系数。

1.3.2 提取工艺流程与方法

干葛根→粉碎→过筛→浸提→取上清液→分光光度计检测。

准确称量5 g 干葛根，置入高速粉碎机粉碎、过筛，倒入锥形瓶中加入蒸馏水，将锥形瓶置于数显恒温水浴锅中浸提，取出锥形瓶中提取液，过滤得到滤液，定容至150 mL，精密吸取0.5 mL 提取液，再加体积分数为30%的乙醇溶液至5 mL，加入质量分数为5%的亚硝酸钠溶液0.3 mL，摇匀，静置6 min后，加入质量分数10%的硝酸铝溶液0.3 mL，摇匀，静置6 min，加入浓度为1 mol/L氢氧化钠溶液4 mL，加0.4 mL 的水，摇匀，静置15 min，测定其于波长510 nm 下的吸光度，代入标准曲线回归方程，得出黄酮液质量浓度。每个试验重复2 次取平均值。

1.3.3 单因素试验分析

以葛根颗粒大小、提取时间、料液比、提取温度为参数，提取液黄酮质量浓度为指标进行提取，确定主要影响参数。

单因素试验分析各因素与水平设计见表1。

表1 单因素试验分析各因素与水平设计

进行单因素试验分析时，除试验因素的水平按表1 进行，其他因素的水平固定为葛根颗粒大小0.5 cm，提取时间60 min，提取料液比1∶20，提取温度80 ℃。

1.3.4 正交试验分析

根据单因素试验结果确定3 个影响总黄酮提取的主要因素及各个因素的影响葛根总黄酮得率水平，进行L9（34）正交试验。

正交试验因素与水平设计见表2。

表2 正交试验因素与水平设计

1.3.5 正交试验结果验证

以正交试验获得的各个因素的最佳水平组合为参数，进行提取，计算提取液黄酮质量浓度，试验平行进行3 次。

1.4 数据分析

数据处理软件Microsift Excel 2010。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 葛根颗粒大小对总黄酮质量浓度的影响

葛根颗粒大小对葛根总黄酮质量浓度的影响见图1。

图1 葛根颗粒大小对葛根总黄酮质量浓度的影响

由图1 可知，葛根颗粒大小为0.25 cm 时，其提取率为最大，达到1.6 mg/mL，随着葛根颗粒的增大，总黄酮质量浓度降低，但到1 cm 及以上大小时，其总黄酮的提取率变化趋缓。

2.1.2 提取时间对总黄酮质量浓度的影响

提取时间对葛根总黄酮质量浓度的影响见图2。

图2 提取时间对葛根总黄酮质量浓度的影响

由图2 可知，提取时间在80 min 以内，葛根总黄酮的质量浓度随提取时间的增加而升高，但提取到达100 min，其葛根总黄酮的质量浓度反而下降。

2.1.3 料液比对总黄酮质量浓度的影响

料液比对葛根总黄酮质量浓度的影响见图3。

图3 料液比对葛根总黄酮质量浓度的影响

由图3 可知，料液比在1∶25 以内时，其葛根总黄酮的质量浓度随料液比的降低而升高，在1∶25时到达顶峰，最后料液比降低到1∶30 时，葛根总黄酮的质量浓度下降。

2.1.4 提取温度对总黄酮质量浓度的影响

提取温度对葛根总黄酮质量浓度的影响见图4。

图4 提取温度对葛根总黄酮质量浓度的影响

提取温度对总黄酮质量浓度影响较大，提取温度越高，总黄酮质量浓度越高，其变化规律具有可预见性。因此，在正交试验时将提取温度设定为100 ℃。

2.2 正交试验结果

正交试验结果见表3。

表3 正交试验结果

试验采用直观分析法，对各因素的K 及R（极差）值的大小进行有关分析可知，极差RA＞RB＞RC。

因此，用水对葛根总黄酮进行提取时，影响总黄酮质量浓度的主要因素为提取时间，其次是料液比，再次是颗粒大小。再由K 值越大越好得出优化后最佳组合为A3B2C1，即提取时间100 min，料液比1∶25，葛根颗粒大小0.25 cm。

2.3 验证试验

根据正交试验结果，选取0.25 cm 葛根颗粒，称取5 g 分别放置在3 个锥形瓶中，按照1∶25 的料液比加入水，在100 ℃下进行提取，提取时间为100 min，提取液自然冷却后加水补足损失的质量，测定总黄酮质量浓度，重复3 次试验，结果分别为1.274，1.261，1.276 mg/mL，平均总黄酮质量浓度为1.27 mg/mL，对比其各参数其他水平下所获得的质量浓度，该结果为最高，表明正交试验方法得当，结果可靠。

3 结论

通过单因素试验分析影响葛根总黄酮提取的4 个因素，表明4 个因素对于总黄酮质量浓度的影响均较大，但是由于温度越高，质量浓度越高，为了提升试验效果，因此在正交试验时将提取温度这个参数定为100 ℃，以提取时间、料液比和颗粒大小3 个因素开展三因素三水平正交试验。结果表明，葛根颗粒大小0.25 cm，料液比1∶25，提取温度100 ℃，提取时间为100 min 条件下进行提取，获得葛根总黄酮质量浓度为最高，为1.27 mg/mL。

在企业中以葛根为原料生产相关的药品或者食品时，其提取一般按照师傅传承下来的经验进行，参数为固定的，未进行科学的优化。通过对葛根提取进行单因素试验和正交试验，能够提高葛根的利用率，缩短提取时间，降低能量的消耗，降低企业的生产成本，提升企业的效益。通过单因素试验和正交试验确定了葛根提取的工艺参数，为后续葛根酵素的发酵生产奠定了良好的试验基础。