基于数据挖掘和分子对接技术探讨中药干预 AD的用药规律

杨娅妮,汤家明,李润芝,蔚洪恩,,3*

(1山西中医药大学第三临床学院脑病教研室,太原 030024;2山西省人民医院神经内科;3脑疾病防治山西省重点实验室;*通讯作者,E-mail:hongen.wei@sxmu.edu.cn)

阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)是一种老年期最常见的慢性疾病,临床表现主要有渐进性认知功能障碍、语言与记忆障碍、人格改变等[1]。中医将 AD纳入“呆病”“健忘”的范畴,认为肾精亏虚,脑髓消减,神机失用是 AD的基本病机[2]。有研究报告显示,截至2019年底我国现存 AD患者已经超过1 000万,而2050年,全球将会有1.52亿人患有痴呆,其中2/3为 AD患者[3,4]。据估计,2030年全球用于痴呆的治疗与护理费用将增至2万亿美元[5]。因此, AD的预防与治疗问题必须得到重视。然而 AD的发病机制尚不完全清楚,目前认为是多途径参与的复杂机制共同导致。目前 AD可能的发病机制有β淀粉样蛋白毒性学说、tau蛋白过度磷酸化学说、炎症学说、氧化应激学说等[6]。在药物治疗方面,胆碱酯酶抑制剂治疗轻、中度 AD,如多奈哌齐、利斯的明等,美金刚作为重度 AD治疗药物[7]。但是目前临床用药选择有限,品种较为单一,并且多具有恶心、胸闷、心慌等副作用,对于 AD只是症状上的暂时缓解,并不能根治疾病。因此我们迫切需要找到能够治疗 AD且副作用小的新药物,而作为传统文化瑰宝的中医药可为其提供新思路。

中药因其多成分、多靶点、多途径的治疗特点,在疾病治疗中能有效降低毒副作用,在临床应用中具有良好的效果。近年来,中药对于 AD的治疗取得很大进展,但是因中药有效成分复杂,对于疾病药效的作用基础以及用量的把控难以进行系统性的深入研究。2007年,来自英国的Hopkins[8]首次提出“网络药理学”一词,并于2008年发表相关文章表示网络药理学是“下一代药物研发模式”[9]。目前网络药理学被广泛应用于药物和中药活性化合物发现、药物组合和方剂配伍规律解析等方面,为中药体系研究指明了新道路,同时也为临床合理用药、新药研发等提供了新的理论与技术支撑[10]。

本研究采用网络药理学的方法,以 AD相关疾病靶点作为切入点,检索匹配出相对应的化合物和中药,构建并分析了核心靶点、化合物、中药三者之间的网络结构关系,而后通过分子对接进行验证,初步探寻中药治疗 AD的一般规律,为中医药干预 AD的基础理论提供了现代医学证据,同时也为后续治疗时中药的选择、中医复方加减配伍的选择、后续新药开发及中西医结合临床治疗提供了思路。

1 材料与方法

1.1 AD相关疾病靶点获取

通过检索文本挖掘DisGeNET数据库(https://www.disgenet.org/)、OMIM数据库(https://www.omim.org/),以“Alzheimer’s disease”为检索词,获取阿尔茨海默病相关靶点,通过微生信网站(http://www.bioinformatics.com.cn/)获取交集靶点,作为潜在靶点。将潜在靶点输入Unipot数据库(https://www.uniprot.org/)查询各潜在靶点全称。

1.2 候选化合物筛选及靶点-化合物网络结构图的构建

在中药系统药理学技术平台(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform,TCMSP)数据库(https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php)中以口服生物利用度(oral bioavailability,OB)≥30%,类药性(drug likeness,DL)≥0.18为条件筛选出可作用于 AD相关疾病靶点的化合物作为候选化合物,并保存为MOL2格式文件,再将其导入OpenBabel-2.4.1软件转化为pdb格式文件,为后期分子对接做准备。同时将候选化合物、靶点导入Cytoscape 3.9.1软件构建靶点-化合物网络,并对网络节点进行整理分析。本次研究涉及的TCMSP平台是一个全新的以系统药理学为基础的中药研究平台及数据库,囊括了《中国药典》(2010)注册的所有499种中草药,和其所含的共29 384个成分化合物,13 144个分子,给出了所有收录的中草药的组分和分子结构、关键 ADME参数、成分作用靶点以及相关疾病等关键信息[11]。

1.3 核心靶点与候选化合物的分子对接验证

为了进一步验证筛选出的靶点及其配体关系的可信度,将靶点-化合物网络中度值前四的核心靶点与所有的候选化合物进行分子对接。从RCSB PDB数据库(http://www.rcsb.org/pdb/)查询出4种核心靶点的3D结构,并与候选化合物的pdb格式文件一起导入AutoDockTools-1.5.7进行分子对接,得到靶点与化合物的3D对接图。若结合力<0 kcal/mol,表明配体分子能与受体蛋白进行自发的结合,但是目前对于高结合性分子的筛选标准尚无统一规定[12,13]。再将已经对接好的靶点-化合物文件转化为pdb格式,导入LigPlus生成2D结构进行对比观察。

1.4 中药筛选及靶点-化合物-中药网络图的构建

为了进一步整合中药和化合物及疾病靶点之间的关系,通过Cytoscape 3.9.1中的merge插件将靶点-化合物网络、化合物-中药网络进行合并,构建出“靶点-化合物-中药”网络结构图。

1.5 中药数据整理以及频数分析

在TCMSP数据库中匹配出潜在靶点的对应中药材,参照“十三五”规划教材《中药学》[14]以及中国药典2020年版[15]中对中药的性味归经进行频数统计。

2 结果

2.1 疾病靶点筛选结果

通过检索DisGeNET数据库以及OMIM数据库收集 AD相关疾病靶点,在微生信网站进行交集获得 AD靶点69个(见图1)。其中在TCMSP数据库中能匹配到化合物,且DL≥0.18,OB≥30%的靶点共有11个,将这11个靶点定义为潜在靶点,其基本信息见表1。

表1 Uiport数据库阿尔茨海默病潜在靶点的基本信息

DisGeNET OMIM

2.2 靶点-化合物网络结构图的构建

以“可关联至相关靶点”“DL≥0.18”以及“OB≥30%”为条件在TCMSP数据库中筛选出26个候选化合物。在Cytoscape 3.9.1中导入潜在靶点和候选化合物绘制靶点-化合物网络结构图(见图2),将度值前四的靶点定义为核心靶点。分别是白介素6(interleukin-6,IL-6)、表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)、白介素10(interleukin-10,IL-10)、尿激酶型纤溶酶激活剂(urokinase-type plasminogen activator,PLAU)。候选化合物信息见表2,度值前六的化合物分别为槲皮素(quercetin,度值7)、表没食子儿茶素没食子酸酯[(-)-epigallocatechin-3-gallate,度值5]、木犀草素(luteolin,度值3)、漆黄素(fisetin,度值3)、芝麻素(sesamin,度值2)、青藤碱(sinomenine,度值2)。这些化合物可作用于多个 AD相关蛋白,活跃性更强,可作进一步研究。

表2 阿尔茨海默病的候选化合物信息

图中绿色为潜在靶点,黄色为候选化合物,节点大小以该节点度值为标准,度值越大,节点越大

2.3 中药的获取结果及靶点-化合物-中药网络的构建

通过TCMSP数据库将26个候选化合物进行匹配,共获得380味中药,其中有47味药物未被“十三五”规划教材《中药学》及中国药典2020年版收录,除此之外广枣、天山雪莲、冬葵果3味中药仅记录性味而无归经,对此50味中药进行排除,故最终收集到330味中药,其中筛选出的中药度值不小于4的有35个(见图3)。通过候选化合物的桥接作用收集各个中药的靶点,结果显示银杏叶、菟丝子、夏枯草、香附、白果、半枝莲、浮萍、苦参、连翘、木蝴蝶、山豆根包含的靶点较多,因此推测11种中药对 AD发病机制具有一定的调控作用。本研究通过选取中药(度值≥4)及相关化合物、靶点来构建靶点-化合物-中药网络结构图(见图4)。其中,银杏叶、菟丝子等中药度值较高,与 AD的靶点以及化合物关联更为密切。

中药度值

图中椭圆形节点表示靶点,长方形节点表示化合物,菱形节点表示中药,中药的度值越大,节点越大

2.4 核心靶点与候选化合物的分子对接验证结果

通过TCMSP数据库获得26个候选化合物的成分结构,导入AutoDockTools-1.5.7进行分子对接验证。对接结果的结合热力图显示4个核心靶点与其已知的配体对接得分最高分别是EGFR-MOL003187(6.76分)、IL10-MOL003187(5.46分)、PLAU-MOL003187(5.78分)、IL6-MOL005944(5.97分)(见图5)。为了更好地展现其靶点分子结构,在4个靶点中选择各自结合力最强的进行2D和3D结构展示,结果见图6。

EGFR:表皮生长因子受体;IL-10:白介素10;PLAU:尿激酶型纤溶酶激活剂;IL-6:白介素6;图中颜色越红代表结合力越强

右侧链接的绿色虚线表示氢键作用,红色虚线表示疏水作用,字母表示结合位点氨基酸

2.5 中药性味归经频数统计

共收集到中药380味,其中能在“十三五”规划教材《中药学》以及中国药典2020年版中查询到的中药共330味,查询这些中药的性味、归经等信息并进行频数统计分析,结果显示可能对 AD进行调节的中药以苦味药最多,其次为辛味、寒味和甘味,出现频率共计67.99%;药性方面则以寒性中药数目最多(见图7)。从归经来看,归肝经的中药最多,占22.80%,其次是归肺经,占17.10%,归肝、肺经的药物共计39.90%(见图8)。

图7 可能对阿尔茨海默病进行调节的中药归经频数统计

图8 可能对阿尔茨海默病进行调节的中药性味频次统计散点图

3 讨论

阿尔茨海默病是一种慢性神经退行性疾病[16],其致病因素较多、病理机制复杂。目前对于 AD的发病机制,相关中药新药研究也在逐步推进。但是新药的研发往往是一个需要消耗大量的人力与财力的长期过程,而现有的医疗模式是针对所有患者的单一疾病、单一靶点、单一药物和单一疗法,成本高昂[17],因此中药因“多成分”“多靶点”“多途径”的优势在 AD的临床治疗中发挥着重要作用。本研究基于DisGeNET、OMIM、Uniport等多个数据库,以 AD疾病靶点为核心,匹配出对应的化合物和中药,拟通过网络药理学和分子对接技术,构建并分析靶点-化合物-中药的网络结构图,总结出中药治疗 AD的一般规律。

以DL≥0.18和OB≥30%为条件筛选出的候选化合物中槲皮素、表没食子儿茶素没食子酸酯、木犀草素、漆黄素、芝麻素、青藤碱,这6种化合物均包含抗氧化及抗炎的作用,对于 AD的发病机制中的氧化应激学说和炎症学说较为吻合。其中槲皮素已经被证明可作为一种新的治疗氧化应激神经退行性疾病的药物,它能够抑制炎症因子和MDA、Keap1的水平,抑制氧化应激反应,从而改善含有3个突变等位基因(PS1、APP、Tau)的纯合子(3×Tg-AD)小鼠的认知功能障碍[18]。在脑卒中的治疗中,槲皮素清除多余的活性氧,维持线粒体的功能,保护神经元[19]。同时,构建的网络中,另一种化合物青藤碱目前研究多应用于类风湿关节炎等自身免疫性疾病,而来自重庆医科大学的张毅及其研究团队[20]发现,青藤碱保护海马神经元免受脑出血处理的小胶质细胞介导的间接毒性,其抗炎和脑保护作用机制也为脑出血的潜在治疗提供了新的线索。由此可见,中药防治 AD具备很大的潜能,并且所筛选的候选化合物中有许多可从常见的植物及食物中获取,成本相对较低。因此本研究也对 AD的食疗具有一定的指导意义。

分子对接结果显示:4个核心靶点与26种成分均能够进行对接,这说明靶点与配体有较强的结合力,证明靶点-化合物-中药网络关系结果是可靠的。而分子对接结合能热力图显示,对接结果良好,达到了一定的结合活性标准。其中表皮生长因子受体(EGFR)与26种成分整体对接活性较高,提示其可作为潜在有效的治疗靶点。目前有研究证实了EGFR过度的激活与许多的神经退行性疾病有关,而EGFR抑制剂能够减轻Aβ的毒性以及改善神经炎症,但因其血脑屏障渗透性较差,仍需进一步研究[21]。对于这一劣势,中医有着独特的见解。据《素问玄机原病式》记载:“玄府者,无物不有,人之脏腑、皮毛、肌肉、筋膜、骨髓、爪牙,至于世之万物,尽皆有之,乃气出入升降之道路门户也。”将玄府定义为通行气机、调节气血津液运行的通道。脑作为元神之府,总领五脏之神,脑玄府开阖功能正常是大脑发挥正常生理功能的结构基础,其功能类似于血脑屏障[22]。中药引经及方剂配伍,能够做到因人制宜,引药入脑,开通脑玄府,使得药物通过血脑屏障作用于脑疾病靶点,因而EGFR靶点可作为潜在的中药治疗阿尔茨海默病的作用靶点,值得更进一步的研究。

根据中药的性味、归经等信息的频数统计分析可知, AD机制与肝经、肺经关系紧密。在治疗方面则可多考虑苦、寒味药的应用。所筛选的中药中,银杏叶、菟丝子、夏枯草、香附、白果、半枝莲、浮萍、苦参、连翘、木蝴蝶、山豆根这11味中药调控多个阿尔茨海默病的核心靶点。现代药理学对于银杏叶基础研究较多,研究证明银杏叶具有扩张血管、拮抗血小板活化因子、保护缺血损伤及抗炎等多种药理作用,在脑功能障碍、脑外伤后遗症、神经系统疾病和清除氧自由基等方面具有确切的疗效[23]。苦参中多成分、多部位均具有抗氧化作用[24,25],韩亚非等[26]发现苦参素能够通过抑制海马神经元凋亡改善及降低氧化应激损伤来改善慢性脑缺血大鼠学习记忆能力。

综上所述,本研究以 AD的疾病靶点为出发点,通过网络药理学和分子对接技术的方法,初步探讨了中药干预 AD的一般用药规律,为后期继续深入研究EGFR等相关靶点以及作用机制提供了一定的理论基础。然而本研究主要是通过挖掘数据库以及计算机软件计算获得的数据来构建网络,无法顾及实际应用时中药的剂量、一些毒性作用以及中药复方加减配伍的计量搭配等因素,具有一定局限性,因此具体结果仍需进一步验证。