ROR1 CAR-T疗法在肿瘤免疫治疗中的研究进展

米泽威 杨会江 徐 婕

临床上治疗肿瘤常以综合治疗为原则,常用的肿瘤治疗方法包括手术、化疗、放疗等。然而,常规的治疗方法并未有效提高肿瘤患者的生存期,肿瘤的侵袭和转移是造成患者死亡的主要原因,因此,寻找肿瘤的新型治疗方法是亟待解决的重要科学问题。近年来,免疫疗法已成为多种恶性肿瘤的潜在治疗方法,这为肿瘤的治疗打开了新的思路。其中,过继性细胞疗法是肿瘤免疫疗法中耀眼的新星,在推进免疫疗法的进展中做出了不可磨灭的贡献,尤其是嵌合抗元受体T细胞(chimeric antigen receptor engineered T cells,CAR-T)疗法。

受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(recombinant receptor tyrosine kinase like orphan receptor 1,ROR1)是一个被公认的非常有潜力的肿瘤治疗靶点。基于此,本文将对ROR1 CAR-T疗法在肿瘤免疫治疗中的研究进展做一综述,以期更全面地评估ROR1 CAR-T疗法的实际疗效,为ROR1 CAR-T的改善设计提供参考依据,进一步推动ROR1 CAR-T疗法的临床应用。

一、ROR1靶点的引入

过继性细胞疗法是指将人体内有抗肿瘤活性的细胞分离出来,在体外对其进行诱导、修饰、培养,再回输给患者,达到抗肿瘤目的的免疫疗法。其中CAR-T疗法在血液肿瘤治疗中表现惊艳,成为领域内唯一被FDA批准上市的细胞产品[1]。随后,越来越多的过继性细胞疗法向实体瘤发起冲击。近年来,已有多个CAR-T治疗项目成功应用于胶质母细胞瘤、乳腺癌、卵巢癌、肉瘤、肺癌、胃癌等实体肿瘤的治疗[2～6]。大量文献报道,ROR1在多种肿瘤组织中特异性高水平表达,在正常细胞中几乎不表达;同时,ROR1在促进肿瘤生长和转移、诱导肿瘤细胞耐药、抑制细胞凋亡等方面都发挥着重要作用,已逐渐成为肿瘤治疗药物靶标[7,8]。近年来,美国食品药品监督管理局已批准两款新药用于治疗ROR1+的恶性肿瘤,分别是生物制药公司Precigen的自体CAR-T疗法结合PD-1阻断剂而成的PRGN-3007以及JUNO Therapeutics研发的一款自体ROR1 CAR-T疗法JCAR024,目前后者已处于临床一期研究阶段。

ROR1是受体酪氨酸激酶样孤儿受体家族成员之一,属于Ⅰ型受体酪氨酸激酶家族。ROR1含有两种亚型,分别是完整的细胞膜受体型和截短型变异体,后者又主要分为无胞外结构的膜结合型ROR1和只含胞外结构的可溶型ROR1。由于可溶型ROR1在血清中的表达量很低或检测不到,且与疾病进展无关,因此笔者默认研究的是完整结构的膜结合型ROR1。ROR1编码基因共2814bp,位于染色体1p31.3,ROR1膜蛋白由937个氨基酸组成,相对分子质量约为105 kDa。人源ROR1由一个胞外的免疫球蛋白样结构域(Ig)、两个富含半胱氨酸的结构域(FZD)、近膜kringle结构域、单次跨膜结构以及一个胞内酪氨酸激酶结构域(TKD)、两个丝/苏氨酸富集结构域(S/TRD)和一个脯氨酸富集结构域(PRD)组成[9]。ROR1在生物种间高度保守,人与鼠的ROR1氨基酸序列同源性可达97%。

多项研究发现,ROR1在脂肪组织、胰腺、肺、少量B前体细胞中低表达,在其他正常细胞中几乎不表达,而在多种肿瘤细胞中高度表达,如慢性淋巴细胞白血病、毛细胞白血病、髓细胞白血病、边缘区淋巴瘤等血液肿瘤以及肺癌、结直肠癌、卵巢癌、胰腺癌、胶质母细胞瘤、三阴性乳腺癌等实体肿瘤[10]。虽然肿瘤治疗中理想的治疗靶点是仅在肿瘤细胞表面特异性表达的肿瘤特异性抗原(tumor specific antigen,TSA),但目前发现的几乎所有靶点均是肿瘤相关抗原(tumor associated antigen,TAA),ROR1便是属于TAA类。即便如此,越来越多的研究显示,ROR1 CAR-T疗法在多种肿瘤治疗中都取得了理想疗效。ROR1 CAR-T疗法首先需要收集患者的外周血并提取T淋巴细胞,将T淋巴细胞在体外进行刺激扩增并通过病毒载体转入特定的CAR基因,构建成靶向特异性的CAR-T(如靶向ROR1+的ROR1 CAR-T),再将质检合格的CAR-T在体外扩增至合适数量后回输给患者,在患者体内行使其被设定的肿瘤杀伤作用[11]。现阶段,靶向ROR1的免疫疗法已成为肿瘤治疗的新发展趋势。

二、ROR1 CAR-T疗法在多种肿瘤中的研究进展

鉴于ROR1在多种肿瘤组织中特异性高水平表达,是癌症的潜在治疗靶点,ROR1 CAR-T对ROR1+肿瘤细胞具有显著的杀伤作用和较高的安全性,现对ROR1 CAR-T疗法在多种肿瘤中的研究进展进行详细阐述[12]。

1.白血病:ROR1 CAR-T疗法自开发起最先便是用于治疗血液肿瘤,如白血病等,并已取得了较为理想且成熟的临床前实验结果[13]。早期,Hudecek等[14]在临床试验中将特异性ROR1 CAR-T靶向ROR1+B型急性淋巴细胞白血病,产生了前所未有的抑癌效果。在此基础上,利用靶向ROR1胞外Ig-like/FZD的mAb 2A2制备2A2 CAR-T,并截短其间隔域,获得对ROR1+肿瘤的识别。进一步研究发现,利用靶向ROR1 Ig-like和FZD上的一个独立表位的兔抗人ROR1 mAb R12制备R12 CAR-T,与2A2 CAR-T比较时,展现出了更高的亲和性[15];而且针对体内ROR1+B细胞淋巴瘤和体外多种上皮性肿瘤都表现出了很好的反应活性[16];随后,通过改造与修饰R12 CAR-T的空间间隔,明显地提升其对ROR1+肿瘤的识别及扩大T淋巴细胞的生物学效应[17]。此外,Thomas Kipps等[18]在发表于PNAS的研究中指出,癌基因ROR1仅在慢性淋巴细胞性白血病的B淋巴细胞中表达,在正常组织中不表达,该基因与其他原癌基因共同作用会加速小鼠的慢性淋巴细胞性白血病发病进程,并在动物模型中成功证实ROR1 CAR-T疗法对白血病的良好疗效。现阶段由慢性淋巴细胞白血病的全球研究基金会联盟牵头开展的ROR1 CAR-T疗法应用于白血病的治疗已进入临床一期,社会多方都在热切关注这项临床实验的实际疗效。

2.三阴性乳腺癌:三阴性乳腺癌预后差、耐药性强、复发率高,而治疗手段又非常有限。近年来,有研究者研发出新型CAR-T疗法针对三阴性乳腺癌表现出前所未有的效果,有望打破三阴性乳腺癌的治疗格局。陈玥等[12]利用构建的ROR1 CAR-T,在体外实验中发现针对阳性靶细胞MDA-MB-231,在2∶1、4∶1、8∶1的效靶比条件下,CAR-T组中释放的γ干扰素(interferon-γ,IFN-γ)均高于对照组。但CAR-T与阴性靶细胞共培养后,IFN-γ几乎没有释放,即使在高效靶比(8∶1)时释放量也很少,酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)也产生较少,证明ROR1 CAR-T对于ROR1阳性的三阴性乳腺癌细胞具有特异性的杀伤作用,并且脱靶性的危险较小。

西雅图华盛顿大学Jennifer Specht博士团队则利用ROR1 CAR-T细胞进行了人体试验,该研究纳入了7例ROR1表达超过20%的三阴性乳腺癌患者。在接受5个剂量水平的ROR1 CAR-T疗法过程中,并未出现明显的剂量限制性毒性。只有1例患者出现了三级细胞因子释放综合征,经地塞米松和托珠单抗治疗后反应迅速,没有出现严重的神经毒性或细胞因子释放综合征或肿瘤溶解综合征或任何与ROR1表达相关的其他毒性。该研究的治疗结果令人欣喜,经ROR1 CAR-T疗法后,患者生存期持续延长,2例患者病况稳定,分别维持了15周和19周,其中1例患者在病况稳定一段时间后又接受了第2次ROR1 CAR-T回输,肿瘤明显缩小。目前还没有任何其他后续治疗方案的疗效超过ROR1 CAR-T疗法。

3.肉瘤:患有转移性、复发性和(或)难治性肉瘤的患者通常预后较差,迫切需要新的有针对性的治疗方法。研究显示,ROR1在肉瘤细胞系(11/15)中有很高的表达率,这些肉瘤细胞系包括尤文肉瘤、骨肉瘤、肺泡或胚胎性横纹肌肉瘤、纤维肉瘤。Huang等[19]利用Sleeping Beauty系统将来源于8名志愿者的免疫细胞构建ROR1 CAR-T,发现其对肉瘤细胞具有细胞毒性,并且以抗原特异性方式产生高水平的IFN-γ、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)和白细胞介素-13(interleukin-13,IL - 13),而来源于3个肉瘤患者的ROR1 CAR T响应肉瘤的刺激并释放显著量的IFN-γ。研究发现,ROR1 CAR-T可显著降低小鼠骨肉瘤模型中的肿瘤生长率,延长小鼠寿命,证实ROR1可作为利用Sleeping Beauty构建的CAR-T有效靶点,并且这种CAR-T有可能会在高危肉瘤患者的治疗中起到重要作用。

Berger等[20]利用猕猴构建的骨肉瘤灵长类动物模型来评估ROR1 CAR-T的治疗效果,结果显示ROR1 CAR-T具有较强的抗肿瘤作用,并且对低表达ROR1的B前体细胞、脂肪细胞、胰腺和肺无毒性作用,具有良好的安全性,是骨肉瘤理想的免疫治疗方法。此外,由于目前大多数CAR-T靶点都属于TAA类,为避免“on-target off-tumor”毒性,Srivastava等[21]设计了一种逻辑门控ROR1 CAR-T。在改善后的设计中,CAR-T仅消除同时表达抗原A和B的肿瘤。针对抗原A合成的Notch受体可诱导针对特异性抗原B的CAR表达,通过整合多种信号来调节T淋巴细胞功能,从而可以更精确地区分肿瘤组织和正常组织。这种新型设计的ROR1 CAR-T已被证明能够很好地治疗尤文肉瘤,此项目目前正在进行临床招募(NCT02706392),表现出巨大的发展潜力。

4.卵巢癌:卵巢癌作为一种早期较难检测、晚期致死率高、复发性高的肿瘤,传统的治疗手段尚不能满足目前的医疗需求,在妇科恶性肿瘤中,卵巢癌被称为“沉默杀手”。近年来,CAR-T疗法的问世,让人们看到了“治愈”的希望。在利用传统CAR-T疗法治疗各种恶性肿瘤的同时,科学家也在致力于通过前期基因工程技术,多维度提高CAR-T疗法的疗效。来自Fred Hutchinson癌症研究中心的科学家设计了一种生物相容性良好的多孔网状镍钛薄膜,可高效装载CAR-T,并能在植入部位触发它们快速扩增。研究者将ROR1 CAR-T置于膜的两侧,使其被吸收到材料中,在应用于卵巢癌小鼠临床前模型时,惊喜地发现此薄膜可准确定位至肿瘤病灶上,并促进嵌入的抗癌淋巴细胞快速扩增,使得肿瘤组织中CAR-T密度比传统的静脉注射T淋巴细胞高232倍,能有效消除小鼠肿瘤、延长生存期,并且整个实验过程中,此金属薄膜安全可靠,周围的组织或器官也没有出现坏死[22]。新型改善技术的出现,无疑让CAR-T疗法如虎添翼。

5.肺癌:肺癌是发生率和病死率增长最快、对人类健康和生命威胁最大的恶性肿瘤之一,将CAR-T疗法应用于治疗肺癌是诸多研究者的奋斗目标。Wallstabe等[23]在研究中利用ROR1 CAR-T治疗肺癌A549细胞系和肺癌三维模型,结果显示ROR1 CAR-T具有较强的抗肿瘤活性。而Srivastava等[24]通过在KP鼠肺癌模型中引入ROR1基因,建立KP-ROR1鼠(高表达ROR1),系统研究CAR-T疗法在肺癌治疗中的作用,结果发现ROR1 CAR-T的浸润性较差并且存在功能性失调。于是他们进行联合疗法的尝试,结果发现,在注射奥沙利铂和ROR1 CAR-T 1天后,再注射抗PD-L1抗体,可显著提高ROR1 CAR-T在病灶处的富集,显著抑制肿瘤生长。进一步将联合疗法用于临床试验,结果显示,同时注射奥沙利铂和ROR1 CAR-T的肺癌患者,T淋巴细胞水平显著上升、巨噬细胞水平显著下降,此趋势在治疗203天后仍旧显著,表明奥沙利铂的使用在临床上可以有效提高T淋巴细胞在病灶处的富集。目前三联疗法的临床应用仍在进行中,但现有结果已足以说明,联合疗法可显著增强ROR1 CAR-T疗法的抗肺癌效果。

除上述已开展的利用ROR1 CAR-T疗法治疗白血病、三阴性乳腺癌、肉瘤、卵巢癌、肺癌之外,由于ROR1在肝癌、结直肠癌、胰腺癌、胶质母细胞瘤等实体瘤中同样特异性高表达,因此将ROR1 CAR-T疗法用于治疗此类癌症将是今后持续探讨的研究方向。

三、展 望

CAR-T疗法是有别于包括抗体药物、抗体偶联药物(antibody-drug conjugate,ADC)、重组蛋白等在内的传统生物药物的新型治疗手段,具有“活的药物”的特性,其治疗深度和持续性是上述传统生物药物不具备的。ADC代表性药物的缓解率为60%,未来可能需要联合其他疗法进行治疗;而CAR-T代表性药物bb2121和LCAR-B38M的缓解率分别为94%和100%。抗体介导的抗肿瘤药物只能杀死细胞表面抗原高表达的肿瘤细胞,而CAR-T可以有效杀死细胞表面抗原表达量较低的肿瘤细胞,反应深度更深。此外,CAR-T在治疗过程中会在患者体内大量扩增,相对传统的生物药物,具有起效快速、缓解率高和缓解时间长等优势。

与传统的利用基因工程技术构建特异性CAR靶向ROR1靶点不同的是,现阶段针对ROR1 CAR-T技术的研究已经开始关注如何通过改善CAR前期设计、多方法联合应用等提高ROR1 CAR-T的实际疗效。比如逻辑门控ROR1 CAR-T技术,它通过双特异性靶标,精确CAR-T的靶向性,降低对正常低表达ROR1细胞的损伤性;又比如Fred Hutchinson癌症研究中心研发的多孔网状镍钛薄膜,利用该膜高效装载CAR-T,使得肿瘤组织中CAR-T密度比传统的静脉注射法提高了232倍;再比如Stanley R. Riddell等尝试的联合疗法,通过将ROR1 CAR-T与成熟的临床药物、经典的肿瘤治疗方法联合,评估不同方法的实际疗效,寻找ROR1 CAR-T疗法的更高效使用方法。Cho等[25]设计的通用型CAR-T,通过在ScFv与穿膜和胞内结构域间插入一个可调控的亮氨酸,使得抗原结合区可以任意地更换成各种ScFv,提高了CAR-T疗法的灵活性。目前关于ROR1 CAR-T疗法在肿瘤免疫治疗中的研究已进入新的阶段,不仅在治疗的肿瘤类型上更加丰富,在CAR-T技术的改善设计上也日渐完善,从而多方面推动了ROR1 CAR-T疗法的临床应用。

综上所述,ROR1靶点是CAR-T疗法中新的尝试,致力于提供更强效、可耐受、易获得的免疫疗法,解决疾病标准疗法无法应对的复发及其他难治问题,为患者的临床治疗带来新的希望。