复合微生态制剂对循环水养殖系统老化生物滤池的在线修复作用

张康，李秋芬，崔正国，胡清静，王庆奎

(1.天津农学院 水产学院，天津 300392；2.中国水产科学研究院黄海水产研究所 农业农村部海水养殖病害重点实验室，山东 青岛 266071)

循环水养殖系统(recirculating aquaculture system，RAS)是一种以水的综合循环利用为主要特征的新型高效养殖模式，具有节水、节地、节能和减排的优点，同时又能为水产动物提供健康的生长环境[1-2]。RAS是目前水产养殖研究的重点领域[3]，从20世纪80年代至今，中国循环水养殖水产经济物种已超过100种[4]。

循环水养殖动物会产生大量排泄物，如氨氮、亚硝酸盐、多种电解质和尿素等，其中，氮是大多数养殖鱼类排泄最多的物质[5]。此外，残饵在水体中大量分解，最终会在循环水中造成大量有害物质积累，影响养殖鱼类生长，甚至会造成鱼类死亡[6]。生物滤池(biological filter，BF)作为循环水中水质净化处理的一个环节，具有重要的生物除氮作用，目前，应用最为广泛的生物滤池是浸没式生物滤池，其特点是滤料全部浸没在水下[7]。RAS生物滤池内的介质应用较多的是表面积相对较大的塑料纤维丝和生物滤料，作用是提高生物膜上微生物承载量[8-9]。RAS中的微生物能够将系统中有害物质降解为无毒的物质，如将氨氮、亚硝酸盐转化为无害的分子氮、硝酸盐[10-11]。生物滤池净化水体的性能取决于所附着微生物的活性及溶解氧(DO)浓度、温度、pH和盐度等[12]。循环水系统运行时间过长会出现老化问题，同时微生物膜脱落会导致难闻气味及处理效率降低等问题[13]。生物滤池重新挂膜及更换滤料不仅成本较大，周期也较长，会影响水产动物养殖生产[14]。目前，已有利用微生态制剂进行修复水体的相关报道，即通过微生物固定化技术，使微生物附着在生物滤池介质表面，固定化微生物具有较强的耐受能力，从而能更好地净化水质及丰富生物膜组成[15]。改进水处理工艺与微生态制剂的配合使用，可加快水产养殖业绿色发展，然而，循环水养殖过程中通过在老化生物滤池中添加微生态制剂，达到在线快速修复老化生物滤池的报道尚不多见。本研究中，以养殖云龙石斑鱼(Epinehelusmoara♀×E.lanceolatus♂)的循环水养殖系统内老化生物滤池为研究对象，在养殖池及老化的生物滤池泼洒复合微生态制剂，通过监测生物滤池进水口和出水口的水质和细菌等指标变化，考察复合微生态制剂对生物滤池的修复效果，以期为海水循环水养殖系统的高效运行提供技术保障，并为微生态制剂在实际养殖生产中应用推广提供有益参考。

1 材料与方法

1.1 材料

试剂：2216E琼脂培养基、TCBS琼脂培养基(青岛海博生物技术有限公司生产)；浓硫酸(ρ=1.84 g/mL)、碘酸钾、硫代硫酸钠、磺胺、盐酸萘乙二胺、盐酸溶液(ρ=1.19 g/mL)、氢氧化钠和次溴酸钠等试剂均为分析纯(国药集团生产)。

仪器：生化培养箱SHP-250(上海精宏实验设备有限公司)，UV-2800A型紫外可见分光光度计(尤尼柯上海仪器有限公司)

1.2 方法

1.2.1 试验复合微生态制剂 试验所用微生态制剂(HS-CP-XXX系列水体修复复合菌群)为本研究团队与青岛宏洋生物科技有限公司共同研发，其由多个互利共生、协同作用菌群共同发酵的液态微生态制剂组成，包括芽孢杆菌、乳酸菌、酵母菌和放线菌等，有效菌量为109～1010CFU/mL，具有快速形成优势菌群并净化水质的特点。

1.2.2 试验设计 试验设置试验池和对照池，分别为山东省海阳市黄海水产有限公司7号车间的7号和8号循环水养殖系统，养殖品种均为云龙石斑鱼。试验和对照系统均包括10个6 m×6 m的养殖池和1个4 m×4 m介质为塑料纤维丝的4级曝气生物滤池(biological aerated filter，BAF)。7号循环水系统出现生物滤池老化、水质恶化现象，氨氮、亚硝酸和CODMn质量浓度分别达到0.517、0.483、7.28 mg/L，已无法正常投饵养殖。8号为正常生物滤池。每天向7号系统生物滤池和养殖池水体中泼洒复合微生态制剂，每次1 000 mL，早、晚各一次，连续泼洒15 d。试验期间，每3 d采集一次水样，监测生物滤池进水口、出水口的水质指标；停止添加微生态制剂之后，继续跟踪监测，试验周期为39 d。

1.2.3 指标的测定

1)水质指标。利用水质检测仪(AZ86031，苏州罗伯克测控技术有限公司)每天实时测定水体的温度(℃)、DO、pH和盐度等指标。

采集循环水系统生物滤池进水口及出水口水样，测定氨氮、亚硝酸盐和溶解性有机物含量。依据GB 17378.4—2007《海洋监测规范第四部分：海水分析》，采用次溴酸盐氧化法测定氨氮含量，采用萘乙二胺分光光度法测定亚硝酸盐含量，于543 nm波长下测定吸光值，采用碱性高锰酸钾法测定化学需氧量(CODMn)。

2)弧菌及异养菌。采集循环水系统生物滤池进水口及出水口水样，依据GB 17378.7—2007《海洋监测规范第七部分：近海生态调查和生物监测》中的方法测定异养菌总数和弧菌数量。对水样进行合适梯度稀释，取100 μL涂布2216E和TCBS平板，28 ℃恒温培养箱培养24～48 h后，进行菌落计数。

1.3 数据处理

试验数据均以平均值±标准差(mean±S.D.)表示，采用Origin 2018软件进行单因素方差分析(one-way ANOVA)，采用Ducan法进行组间多重比较，显著性水平设为0.05。

2 结果与分析

2.1 修复期间循环水养殖系统水质指标的变化

从表1可见，试验池和对照池水体的水温均在22.5 ℃左右，盐度约为31.50，pH为7.30～7.50，DO>5.70 mg/L，两个循环水系统的这些水质指标无显著性差异(P>0.05)。

表1 循环水养殖系统生物净化池及养殖池水质指标Tab.1 Water quality indices of biological purification pond and aquaculture pond in the circulating water aquaculture system

2.2 修复期间生物滤池亚硝酸盐去除效率的变化

从图1可见：加入微生态制剂3 d后，试验组生物滤池亚硝酸盐去除率开始上升，15 d时从修复前(0 d)的28.34%提高至47.24%，提高了18.90%，略高于对照组平均值(45.69%)；随着加入复合微生态制剂时间的延长，试验组生物滤池进水口亚硝酸盐的浓度不断下降，从修复前的0.483 mg/L显著降至15 d时的0.352 mg/L(P<0.05)。这表明，通过向生物滤池添加复合微生态制剂，使其在3 d内恢复去除亚硝酸氮的能力，15 d后去除率提高至47.24%，并保持稳定。

标有不同字母者表示同一水池位置不同时间点间有显著性差异(P<0.05)，标有相同字母者表示组间无显著性差异(P>0.05)，下同。Note：The means with different letters in different time in the same pool location are significantly different at the 0.05 probability level，and the means with the same letter in different time in the same group are not significant differences，et sequentia.图1 复合微生态制剂对生物滤池亚硝酸盐去除效率的影响Fig.1 Effects of compound probiotics on nitrite purification efficiency in the biofilter

2.3 修复期间生物滤池氨氮去除效率的变化

从图2可见：加入复合微生态制剂6 d后，试验组生物滤池对氨氮的去除率开始升高，15 d时去除率由修复前的27.28%提高至46.07%(P<0.05)，较修复前提高了18.79%，略低于对照组平均值(52.29%)；通过添加复合微生态制剂，生物滤池进水口氨氮含量同样不断下降，从修复前的0.517 mg/L显著降至15 d时0.417 mg/L(P<0.05)，养殖水质得以提高。

图2 复合微生态制剂对生物滤池氨氮去除效率的影响Fig.2 Effects of compound probiotics on ammonia nitrogen purification efficiency in the biofilter

2.4 修复期间生物滤池水体中有机物含量的变化

从图3可见：添加复合微生态制剂可显著降低生物滤池水体中的有机物含量(P<0.05)，添加微生态制剂3 d时水体中CODMn质量浓度由修复前的7.28 mg/L上升至8.17 mg/L，之后开始下降，12 d时降至5.70 mg/L，较添加微生态制剂前显著降低21.70%(P<0.05)；与对照组相比，修复9 d后的生物滤池水体中有机物含量显著降低(P<0.05)。

标有不同大写字母者表示同一时间下不同组间有显著性差异(P<0.05)，标有不同小写字母者表示同一组内不同时间点间有显著性差异(P<0.05)，标有相同字母者表示组间无显著性差异(P>0.05)，下同。Note：The means with different capital letters in same time are significantly different in different groups at the 0.05 probability level，means with different letters in different time in the same group being significantly different at the 0.05 probability level，and the means with the same letter are not significant differences，et sequentia.图3 复合微生态制剂对生物滤池水体中化学需氧量去除能力的影响Fig.3 Effects of composite probiotics on chemical oxygen demand removal capacity in the biofilter

2.5 修复期间生物滤池水体中异养菌和弧菌数量的变化

从图4可见：添加复合微生态制剂3 d后，试验系统水体内的弧菌数量开始下降，15 d时弧菌数量由修复前的7.9×103CFU/mL下降至4.5×103CFU/mL，弧菌数量减少43.04%；对照组弧菌数量始终在5.6×103CFU/mL上下浮动，试验组与对照组相比有显著性差异(P<0.05)。

图4 复合微生态制剂对生物滤池水体中弧菌数量的影响Fig.4 Effects of compound probiotics on the number of Vibrios in biofilter water

从图5可见，试验开始时，添加微生态制剂后，生物滤池中的异养菌含量增加，3 d时异养菌数量急增至6.4×105CFU/mL左右，6 d后异养菌含量缓慢下降，但也能维持在1.7×105CFU/mL左右，且始终显著高于同时期对照组异养菌数量(1.1×105CFU/mL)(P<0.05)。

图5 复合微生态制剂对生物滤池水体中异养菌数量的影响Fig.5 Effects of compound probiotics on the number of heterotrophic bacteria in biofilter water

从图6可见，试验组弧菌占比在试验开始时为4%左右，随着修复试验的进行，在试验的第42天时下降至2%以下，而对照组在第42天时弧菌占比增长至5%左右且显著高于试验初期(P<0.05)。说明有益菌在养殖系统中占有绝对优势地位，弧菌在总菌中的占比越低，疾病发生的风险就越低。

图6 复合微生态制剂对生物滤池水体中弧菌占比的影响Fig.6 Effects of compound probiotics on Vibrio proportion in biofilter water

3 讨论

3.1 复合微生态制剂对老化生物滤池水质的影响

利用循环水系统养殖海水鱼类，需要满足较高的环境指标要求，如温度、盐度、pH和DO水平等。这些指标过高或过低都会影响养殖水体中微生物的新陈代谢，降低相关酶活性[16]，进而影响鱼类生长。隗陈征等[17]通过聚碳酸亚丙脂(PPC)凝胶亲水填料和海绵铁以3∶1(质量比)混合形成复合固定化生物填料引入BAF系统，结果发现，0 h 曝气处理由于缺少氧气供应，无法强化硝化反应，导致系统整体脱氮能力低于12 h和24 h组。本研究中，生物滤池中采用塑料纤维丝作为介质，试验组和对照组循环水系统中曝气生物滤池及养殖池水温均高于22.4 ℃，pH为7～8，盐度约为31.50，DO为6 mg/L左右，能够保证微生物正常生命活动，硝化反应等能够正常进行，均满足云龙石斑鱼的正常生长。

循环水养殖系统中的常规水处理是应对可持续水产养殖挑战的一项关键技术，需要常常在循环水养殖中发明和引进新的技术，以推动水产养殖的发展[18]。生物滤池处于循环水处理核心环节，其净化水体的能力对养殖系统影响极大，通过添加不同的生物滤料或者其他介质来提高生物滤池净化水体能力的研究较多，如以水生浮游植物、海藻石莼[19]作为生物过滤器，可提高养殖尾水中氨氮和亚硝酸盐的去除效果。目前，也有直接在生物滤池中添加微生态制剂去除危害因子的研究，如Gross等[20]将通过土壤富集的硝化菌应用于实验室的南美白对虾水族箱养殖，其处理氨氮的效率大大提高，可用于开发细菌改良剂(益生菌产品)，用作系统的启动剂以恢复受损的生物过滤器。本试验结果与之相似，微生态制剂不但能够提高系统的净化效率，且生物滤池净化功能也迅速恢复了正常。通过添加复合微生态制剂，CODMn质量浓度呈先上升后下降的趋势，可能是由于加大曝气量后，老化生物膜脱落，被微生态制剂中的有机物降解菌分解，引起有机物含量短暂升高；而后微生态制剂中有益菌对一些大分子物质进一步分解[21]，使CODMn质量浓度随之下降，且复合微生态制剂中的大量有益菌在载体上附着，形成新的生物膜，故在停止加菌后，养殖系统仍能维持较好的水质净化能力。

本试验中，通过在养殖池和老化生物滤池内添加复合微生态制剂，一方面维持了养殖系统的水质净化能力，另一方面完成了生物膜的更替，其去除氨氮、亚硝酸盐及CODMn的能力得以恢复，老化生物滤池净化水体的效率提高了20%以上。生物滤池净化水体的能力恢复，水交换率、水产养殖成本和潜在的环境污染就会降低。生物滤池净化水体的效率还与水力停留时间、冲洗周期等相关[22]，后期需要找到合适的点来配合微生态制剂的使用，以得到更好的净化效果。

3.2 复合微生态制剂对老化生物滤池内微生物数量的影响

副溶血性弧菌等弧菌类细菌是海水养殖系统中一类常见的细菌病原体，是世界范围内食源性疾病的主要病原[23]，严重威胁人类的健康，因此，迫切需要寻找相关措施预防并治疗副溶血弧菌等引起的疾病，在此方面微生态制剂成为首选。Shareer等[24]研究表明，枯草芽孢杆菌MFB10、无芽孢杆菌MFB2和坚定芽孢杆菌MFB7这3种分离菌株具有抑制毒力基因表达的作用，在体内攻毒试验中，这些芽孢杆菌可保护斑节对虾幼虫抵抗哈维氏弧菌MFB3感染。Wang等[25]从健康的南美白对虾后肠中分离出的菌株CDM8和CDA22，通过纸片法研究发现，其对副溶血弧菌均有拮抗作用，且混合饵料培养，可显著降低凡纳滨对虾(Penaeusvannamei)的死亡率。本研究中，复合微生态制剂中含有芽孢杆菌、酵母菌和乳酸菌等，水体中添加复合微生态制剂后发现，试验组水体中弧菌数量一直下降，与上述研究结果相似，另外，弧菌与总菌的比值也一直在下降，而且显著低于对照组，说明该复合微生态制剂也具有抑制弧菌生长的能力，与叶海斌等[26]在循环水系统中添加不同复合微生态制剂可降低弧菌数量的结果相同。推测原因，可能是复合微生态制剂具有增强鱼类抗氧化防御机制[27]，与有害菌竞争营养物质，占据生存繁殖空间，从而抑制或者灭除了病原菌，具体机制还要进一步试验证明。

3.3 复合微生态制剂对老化生物滤池内微生态平衡的影响

本试验开始前，生物滤池水体中弧菌数量较多，其原因可能是由于生物滤池老化，生物膜脱落较严重，难以发挥有益菌对于弧菌的拮抗作用所致；添加复合微生态制剂后，有益菌数量慢慢增加，并形成优势菌群，生物膜的生物净化作用恢复，同时弧菌数量显著下降。本研究说明，在循环水养殖系统中，利用微生物固定化技术进行生物强化挂膜是一个简单高效的方法。通过添加复合微生态制剂，将有益微生物固定在介质表面，正常生长繁殖代谢，可丰富水体中的微生物组成，使水体中微生物结构发生变化，从而优化了循环水养殖系统的生态环境[28]。因此，对养殖环境的适当改变可以提高养殖效益，本研究中这一优势尤其显著，控制养殖环境的同时，加入的复合微生态制剂，不但增加了异养菌数量，而且有效降低了弧菌等有害菌的数量，微生物的丰度水平随之提高，生态环境也得以改善。另外，直接泼洒微生态制剂可能会造成流失，若利用微生态制剂重新挂膜，制成固定化生物膜，可能会有更好的效果，且微生态制剂的使用要根据动物生长周期及养殖条件合理配合使用，以期能最大程度地发挥微生态制剂的作用。

4 结论

1)在循环水养殖系统老化生物滤池中添加复合微生态制剂，通过微生物固定在生物滤池介质表面，可快速在线恢复生物滤池净化水体的能力，有效提高亚硝酸盐及氨氮等危害因子的去除率，微生态制剂对生物滤池的修复作用效果明显。

2)在循环水养殖系统老化生物滤池中添加复合微生态制剂，提高了水体中微生物的丰度，水体中异养菌的数量维持在1.7×105CFU/mL，提高了生物膜的完整性；水体中弧菌数量减少了43.04%，可以有效地防治细菌性病害，减少致病性细菌对水产动物的危害，促进了石斑鱼的生长。