禽结核菌素生产用菌种的制备与鉴定

王楠，辛凌翔，徐磊，程君生，王团结，任小侠，毛开荣，李俊平

(中国兽医药品监察所，北京 100081)

禽分枝杆菌(Mycobacteriumavium)是鸟分枝杆菌复合体(MAC)的一种，包括4个亚种，即禽分枝杆菌禽亚种(M.aviumsubsp.avium，MAA)、人猪型亚种(M.aviumsubsp.hominissuis，MAH)、森林土壤亚种(M.aviumsubsp.silvaticum，MAS)和副结核亚种(M.aviumsubsp.paratuberculosis，MAP)。这些亚种虽然密切相关，但每个亚种都具有不同的致病性、宿主范围和环境分布[1-2]。

禽结核菌素纯化蛋白衍生物(PPD)是用于禽结核菌素试验的标准制剂，更重要的是禽类PPD也被用作牛皮内结核菌素比较试验，用于感染牛分枝杆菌和其他分枝杆菌的区分[3]。不同的国家用于生产禽结核菌素的菌株各不相同，我国用CVCC68201、CVCC68202和CVCC68203株制备禽结核菌素，这3株菌1985年分离自结核病死鸡。生产用种子和制备工艺应符合《中华人民共和国兽用生物制品规程》2000年版的有关规定[4]。本研究对生产禽结核菌素的种子进行了全面鉴定，并制备了提纯禽结核菌素。

1 材料与方法

1.1 菌种

禽分枝杆菌CVCC68201、CVCC68202、CVCC68203,1985年9月1日冻干，由中国兽医药品监察所菌种保藏中心提供。

1.2 培养基及试剂

禽结核菌素国家标准品由中国兽医药品监察所菌种保藏中心提供。配氏培养基、苏通培养基、普通肉汤，5%牛奶蔗糖溶液均购自北京中海生物科技有限公司，抗酸染色试剂盒和基因组提取试剂盒均购自索莱宝生物科技有限公司。

1.3 实验动物

SPF鸡(2 kg左右)和SPF豚鼠(300～400 g)均购自北京维通利华实验动物技术有限公司。本试验经中国兽医药品监察所实验动物福利与动物实验伦理委员会审核通过。

1.4 菌种复壮

无菌打开菌种，用0.2 mL普通肉汤溶解，划线接种2支/株配氏试管斜面。置37 ℃培养10 d以上。刮下、称重、磨碎，加少量生理盐水稀释至10 mg/mL，每株菌静脉注射SPF鸡7只(0.2 mL/只)。接种后的15～40 d，无菌解剖SPF鸡，取肝、脾、肺和肠系膜淋巴结，研磨后取上清液接种配氏培养基试管斜面各2支/株。复壮后分离的菌株冻干，按常规方法抽真空封口。

1.5 菌种鉴定

1.5.1 培养特性鉴定

取新批次冻干的菌种，无菌开启安瓿瓶，加入0.2 mL普通肉汤溶解，接种2支/株配氏培养基试管斜面。置37 ℃培养10 d以上，观察菌落形态。

1.5.2 形态和生化特性鉴定

按常规方法，挑取配氏培养基培养的单个结核菌落进行萋尔-尼尔逊(Z-N)抗酸染色，观察细菌形态。

烟酸试验：取培养物1支，加入15 mL热蒸馏水，浸泡菌落30 min，将浸泡的菌悬液分装入2支试管中，每管0.4 mL；每管加入3%联苯胺乙醇溶液0.2 mL，取其中1管，加入0.2 mL 10%溴化氰水溶液，观察试验现象。

耐热触酶试验：吸取0.5 mL 10 mg/mL的菌液于小试管内，在68 ℃水浴中孵育20 min，冷却后加入0.5 mL H2O2和吐温-80混合液(10%吐温80加等体积30% H2O2)，观察气泡产生情况。

1.5.3 真空度、剩余水分和纯粹检验

根据《中国兽药典》2015年版三部[5]规定的方法进行各项检验。

1.5.4 PCR测定

用生理盐水洗下固体培养基上生长良好的菌落，提取3株菌的全基因组DNA，以全基因组 DNA为模板，参考文献[5]的方法设计dnaJ、IS900、IS1245和IS901 4对引物，参考文献[6]优化的反应程序进行扩增。PCR反应结束后，取10 μL产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，观察结果。禽分枝杆菌各亚种的多重PCR判定标准：多重PCR检测的扩增条带呈现3条目的条带，即577 bp(IS901基因片段)、385 bp(IS1245基因片段)和140 bp(dnaJ基因片段)则判为禽分枝杆菌禽亚种/禽分枝杆菌森林土壤亚种；多重PCR检测的扩增条带呈现2条目的条带，即385 bp(IS1245基因片段)和140 bp(dnaJ基因片段)条带则判为禽分枝杆菌人猪亚种；多重PCR检测的扩增条带呈现2条目的条带，即215(IS900基因片段)和140 bp(dnaJ基因片段)条带则判为禽分枝杆菌副结核亚种。

表1 合成的引物序列

1.5.5 免疫原性测定

普通培养基液体表面生长良好的3株菌培养物，121 ℃高压灭菌 30 min，用0.4 μm的网纱过滤，取滤出的上清液，加入40%三氯乙酸混合，使其终浓度为4%。4 ℃静置，沉淀蛋白，5 000 r/min离心蛋白沉淀，用1 mol/L NaOH溶液溶解蛋白，调节pH=7.4，过滤除菌，即为禽结核菌素。

制备禽分枝杆菌致敏原，收集过滤后的菌膜，称取7 g 于7 mL生理盐水浸泡过夜，研碎，加入等体积的弗氏不完全佐剂，反复抽吸混匀，4 ℃冰箱保存备用。肌肉注射禽分枝杆菌致敏原0.5 mL/只，用Bradford法测定禽结核菌素和禽结核菌素国家标准品的蛋白含量，2种菌素稀释成相同浓度的蛋白含量，再分别作1∶100稀释后，与禽结核菌素国家标准品进行比对，皮内注射6只致敏合格的豚鼠，每种结核菌素各注射2个点，0.1 mL/点，注射后24 h用游标卡尺测量注射点的红肿面积。新制备结核菌素的平均反应面积和标准菌素的平均反应面积的比值在0.9～1.1之间时，判定为符合规定[7]。

2 结果与分析

2.1 培养特性鉴定

禽分枝杆菌CVCC68201、CVCC68202株均从感染的SPF鸡脾脏中分离，禽分枝杆菌CVCC68203株从肝脏中分离，上述菌株均常规冻干。复苏冻干后的菌株，配氏培养基培养15 d后，肉眼均能观察到禽分枝杆菌长出的菌落呈淡黄色、奶油状(图1)，菌落黏稠、扁平、薄，挑取菌落时可成拉丝状。

图1 CVCC68201(左)、CVCC68202(中)、CVCC68203(右)生长状态

2.2 形态和生化特性鉴定

挑取单个结核菌落，在载玻片上进行萋尔-尼尔逊(Z-N)抗酸染色，染色结果均为抗酸染色阳性，图2为CVCC68201的抗酸染色结果，菌体为细短、直或稍弯的小杆菌。烟酸试验结果为产生无色沉淀，未见桃红色沉淀，烟酸试验阴性；耐热触酶试验结果无气泡产生，耐热触酶试验为阴性。

图2 CVCC68201抗酸染色结果(1 000×)

2.3 真空度、剩余水分和纯粹检验

冻干的 3 株菌种剩余水分测定结果均小于4%，符合规定。真空度测定结果均呈现白色、粉色或紫色辉光，将不符合规定的冻干菌种进行无害化处理。分别各抽取5支真空度测定良好的3株菌种，用配氏培养基进行纯粹检验，结果均为纯粹生长(5/5)。

2.4 PCR测定

由图3看出，3株菌均能扩增出577 bp(IS901基因片段)、385 bp(IS1245基因片段)和140 bp(dnaJ基因片段)的条带，结果表明均为禽亚种/森林土壤亚种。

M. CVCC68201；1. CVCC68201；2. CVCC68202；3. CVCC68203

2.5 免疫原性测定

用Bradford法测定禽结核菌素国家标准品(2001)和新制备结核菌素的蛋白浓度，结果标准品的浓度为3.6 mg/mL，新制备结核菌素的浓度为5.1 mg/mL。将标准品和新制备结核菌素均稀释成1.8 mg/mL后，分别作1∶100稀释，对致敏合格的6只豚鼠皮内注射，0.1 mL/只。注射结核菌素24 h后，测量标准菌素和新制备菌素接种豚鼠的皮肤红肿面积，结果见图4。

图4 标准菌素(C)与新制备菌素(T)注射豚鼠后的皮肤红肿情况

计算平均反应面积比值，结果见表2。新制备菌素与标准菌素的皮肤变态平均反应面积比值为1.07，此结果符合质量标准规定。

表2 标准菌素和新制备菌素注射豚鼠的皮肤红肿面积

3 讨论

禽分枝杆菌被认为是“非典型分枝杆菌”，与结核分枝杆菌不同，禽分枝杆菌是需氧、无运动性的杆状细菌，其长度在1～3 μm之间[8]。通过抗酸(Z-N)染色法可特异性着色。禽分枝杆菌可以在土壤中生存长达4年，对环境有很强的抵抗力[9-10]。与结核分枝杆菌和牛分枝杆菌相比，禽分枝杆菌最适生长温度为25～45 ℃。初代分离时，含有5%～10%的CO2和全卵或蛋黄的培养基可促进其生长[4，10]。通常，禽分枝杆菌在培养后2～4周内产生“平滑”菌落，如果培养基中含有甘油，菌落会更大。光滑透明的菌落对鸡有较强毒力，而具有光滑圆顶或粗糙菌落则无毒力[11]。本文中分离和鉴定的禽分枝杆菌在含有蛋黄的配氏固体培养基，以及含有大量甘油的液体苏通培养基中均生长良好，固体培养为光滑透明的菌落，提示对鸡有较强的毒力，而且在SPF鸡体内复壮时也发现了典型病变，液体培养后提纯的禽结核菌素在致敏的豚鼠表现出良好的免疫原性。

禽结核病是一种传染性疾病，可以感染包括人在内的多种动物，家禽的结核病主要表现为肠道和肝脏疾病，也可扩散到肺和脾脏等器官[7，9-12]。禽结核病潜伏期长，病程长，症状可持续数周或数月。它在幼禽中的流行率较低，与成年禽相比，病变也较轻，蛋鸡感染禽结核病机会较大，损失也较严重。禽分枝杆菌感染的诊断基于临床症状、剖检病变，病理切片和病变组织的抗酸染色。活禽的出口贸易中，常通过皮内接种禽结核菌素进行检疫[4]。阳性反应被确定为接种部位出现热性肿胀或直径约5 mm的小结节。结核菌素试验诊断鸟类感染禽分枝杆菌相对于临床病变诊断法的准确率大约为80%，但在感染的晚期，鸟类可能没有反应[10，13]。

自1952年世界卫生组织(WHO)公布第一批结核菌素国际标准以来[14]，结核菌素为迄今为止诊断结核病感染的最重要诊断试剂。由于禽分枝杆菌广泛分布于环境中，尤其是地表水、土壤和污染的饲料中。张建东等[15]对我国牛场中禽分枝杆菌的流行情况进行调查，检测到禽分枝杆菌阳性率是34.9%，说明我国牛场普遍存在禽分枝杆菌感染。

世界动物卫生组织(WOAH)推荐的国际贸易中牛结核病的检疫方法是结核菌素皮肤试验(TST)。TST是诊断结核病感染最常用的方法之一，尤其在发展中国家，因为其成本相对较低，易于应用，且对基础设施的要求也低。TST方法包括皮内注射牛结核菌素纯化蛋白衍生物(PPD)，然后在72 h后测量注射部位的肿胀(迟发性超敏反应)。TST可以单独使用牛结核菌素进行试验，也可以使用禽结核菌素和牛结核菌素进行比较试验。在皮内比较试验的解释中，如果牛结核菌素注射部位的牛皮肤厚度增加比注射禽结核菌素的部位不低于4 mm，则通常认为TST反应阳性；如果牛结核菌素注射部位的牛皮肤厚度增加大于禽类注射部位结核菌素，且差值小于4 mm，则认为TST反应不确定；如果牛结核菌素注射部位皮肤厚度的增加小于或等于禽结核菌素注射部位，则认为TST反应阴性[4，15]。

应用本文中鉴定的3株禽分枝杆菌制备禽结核菌素，目的在于区分动物感染的分枝杆菌的种属是牛分枝杆菌还是禽分枝杆菌，对于落实人畜共患的结核病防控具有非常重要的意义。