西瓜NAS基因家族的全基因组鉴定与生物信息学分析

赵 展

(开封大学，河南 开封 475004)

烟酰胺(Nicotianamine，NA)是一种非蛋白质性氨基酸，最早在烟草中发现[1]，到目前为止，已被发现存在于所有高等植物中。NA是一种金属螯合剂，对植物体内金属(铁、锌、锰、铜)螯合和转运起重要作用[2]。烟酰胺合成酶(Nicotianamine synthase，NAS)是植物体内NA合成过程中一种重要的酶，参与植物体内多种调控机制，对植物的生长发育有重要调节作用，能够将3个s-腺苷蛋氨酸分子转化成NA[3]。大量研究表明，NAS基因的过表达不仅能够增强植物体内NA的含量，而且能够增加铁、锌等金属离子的含量，目前该结论已在大豆、水稻、玉米等多个作物中被证实，如，在CaMV35S启动子的控制下，hvnas1过表达会引起转基因大豆籽粒中NA浓度是未转基因大豆的4倍，而Fe和Zn浓度分别是NT植株的2倍和1.45倍[4]。NAS基因参与植物体内多种作用机制，对植物的生长发育有重要的调控作用。如，Zhu等[5]在hap5a突变体中发现AtNAS1基因显著下调表达，但与Fe的状态不相关，进一步酵母单杂交和ChIP分析表明，HAP5A直接结合到NAS1的启动子区域，且在缺铁条件下，过表达NAS1可以挽救hap5a的褪绿表型。

据报道，目前关于NAS基因家族已经在玉米、小麦、花生等多个物种中进行了全基因组鉴定和生物信息学分析。Zhou等[2]在玉米的基因组中共鉴定出9个NAS基因家族成员，并测定了其在不同器官(包括发育中的种子)中的表达模式，根据ZmNAS基因的进化关系和组织特异性表达谱，将其分成了2类，并推测2类ZmNAS基因可能在转录水平上受到不同铁摄取、转运和稳态需求的调控。Bonneau等[6]在小麦的基因组中鉴定出21个NAS基因，并对TaNAS基因在种子萌发、幼苗生长、生殖发育过程、缺铁响应的表达模式和蛋白质序列进行了详细研究，研究结果增加了人们对禾本科植物NAS基因家族的认识，以及对面包小麦铁营养遗传学基础的理解。罗艳芳等[7]在对花生NAS基因家族进行了全基因组鉴定和生物信息学分析，共鉴定出6个AhNAS基因，并通过对AhNAS基因家族进化关系、基因结构、保守结构域、亚细胞定位、顺式作用元件、表达模式及花生响应缺铁和镉胁迫中的作用等进行分析，指出AhNAS2.1和AhNAS2.2主要参与黄色条纹样蛋白3(YSL3)介导的铁的木质部运输，而AhNAS1.2、AhNAS3.1和AhNAS3.2可能参与花生对镉的解毒机制，为揭示NAS在花生(Arachis hypogaea)铁稳态调控中的生理功能奠定基础。

西瓜是世界十大水果之一，随着西瓜基因组的测序完成，西瓜的基因组学研究也越来越深入，但是目前关于西瓜NAS基因家族的全基因组鉴定和分析研究尚不深入。本研究以西瓜NAS基因家族为研究对象，利用HMMER、MEGA、TBtools等工具对西瓜NAS基因家族进行了全基因组鉴定与生物信息学分析，其中包括西瓜NAS基因家族的染色体定位、蛋白保守基序、系统进化树、启动子顺式作用元件和共线性等，该研究能够为进一步探讨西瓜NAS基因的功能和分子机制提供重要的理论依据。

1 材料与方法

1.1 西瓜NAS基因家族成员的鉴定与染色体定位

西瓜基因组数据集来源于葫芦科基因组CuGenDB数据库(Cucurbit Genomics Database(CuGenDB))。利用InterPro数据库(https：//www.ebi.ac.uk/interpro/)查找并下载NAS基因的特征结构域文件PF03059。在Linux系统中利用HMMER的hmmbuild功能构建NAS蛋白结构域的隐马可夫模型，并利用hmmsearch扫描西瓜蛋白数据集。获得的NAS家族成员分别通过SMART蛋白数据库(SMART：Main page(embl-heidelberg.de))和NCBI-CDD(Home -Conserved Domains-NCBI(nih.gov))网站进行确认，在2个数据库中均包含NAS家族成员作为候选，并对候选NAS家族成员进行命名。利用DNAMAN软件对候选NAS家族成员的蛋白质分子量大小、等电点、氨基酸数量等指标进行分析。对已获取的候选NAS家族成员的位置信息利用MG2C_v2.1在线软件(http：//mg2c.iask.in/mg2c_v2.1/)进行染色体定位。

1.2 西瓜NAS基因家族编码蛋白的二级结构和三级结构分析

利用SOPMA网站(https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=npsa_sopma.html)对西瓜NAS家族编码蛋白质的二级结构进行预测；利用PDB数据库(https：//www.rcsb.org/)中的PSI-BLAST筛选模板，利用SWISS MODLE网站(https：//swissmodel.expasy.org/)，以PDB数据库中筛选的模板对西瓜NAS家族编码的蛋白质进行三级结构预测。

1.3 西瓜NAS基因家族编码蛋白保守基序与基因结构分析

对西瓜NAS家族蛋白的保守基序利用MEME 5.5.0在线工具(https：//meme-suite.org/meme/tools/meme)进行分析，最大检索保守基序数量设为10，其他参数默认。利用MEGA7.0对候选NAS家族成员间的进化关系进行分析，并采用TBtools对候选NAS家族成员的保守基序和基因结构进行可视化。

1.4 西瓜NAS基因家族的系统进化树分析

从EnsemblPlants数据库(http：//plants.ensembl. org/Arabidopsis_thaliana/Info/Index)分别下载拟南芥、水稻、番茄和甜瓜4个物种的NAS基因的蛋白序列，利用MEGA 7.0内置的ClustalW，采用邻接法(Neighbor Joining，NJ)，对已获得的拟南芥、水稻、番茄、甜瓜、西瓜的NAS蛋白序列进行多序列比对，将自展法系数(Booststrap)设置为1000次重复，其他参数采用默认值，进行系统进化树的构建，并利用ITOL软件(https：//itol.embl.de/)进行展示。

1.5 西瓜NAS家族的顺式作用元件分析

利用TBtools软件提取西瓜候选NAS家族成员基因转录起始位点上游2000bp的序列。利用PlantCARE对已获得的西瓜NAS家族成员基因启动子区的顺式作用元件进行预测分析，并通过TBtools对预测的结果进行可视化。

1.6 西瓜NAS家族的共线性分析

利用TBtools软件对西瓜基因组内的ClaNAS基因进行物种内的共线性分析以及西瓜与拟南芥、番茄基因组间的NAS基因进行共线性分析。

2 结果与分析

2.1 西瓜NAS基因家族成员的鉴定与染色体定位

通过InterPro工具搜索，HMMER构建和查找，SMART和NCBI-CDD确认，共鉴定出4个西瓜NAS家族成员，分别命名为ClaNAS1～ClaNAS4，见表1。利用DNAMAN软件分析发现，4个西瓜NAS家族成员编码氨基酸序列长度从277aa到356aa，平均长度311aa；分子量变化范围从30.68kDa到39.88kDa，平均34.55kDa；理论等电点PI从4.71到7.46，其中ClaNAS1的等电点最小为4.71，该结果说明西瓜NAS家族成员编码的蛋白质含有较多酸性氨基酸。染色体定位结果显示，ClaNAS家族成员主要分布于第2号染色体、3号染色体、6号染色体上，其中2号染色体上有2个ClaNAS基因家族成员，分别是ClaNAS1和ClaNAS3，且2个基因在染色体上的位置很近；3号染色体和6号染色体上的西瓜ClaNAS家族成员分别是ClaNAS2和ClaNAS4。

表1 西瓜NAS基因家族成员信息

表2 西瓜NAS基因家族编码蛋白的二级结构分析预测

2.2 西瓜ClaNAS基因家族蛋白二级结构和三级结构分析

为了了解西瓜ClaNAS基因家族编码蛋白的二级结构，利用SOPMA进行分析预测，结果表明，4个西瓜ClaNASs家族成员编码蛋白质的二级结构主要由α-螺旋、延伸链、β-转角、无规则卷曲组成，均不含有β-折叠；ClaNAS1～ClaNAS4 4个成员中，与其他二级结构相比，α-螺旋的数量均最多，β-转角数量均最少；与ClaNAS1、ClaNAS3和ClaNAS4相比，ClaNAS2的延伸链数量最多为55；对于无规则卷曲，ClaNAS1和ClaNAS2的数量分别为112和119，而ClaNAS3和ClaNAS4的数量分别为72和86。

图1 西瓜NAS基因家族成员在染色体上的分布

为了进一步了解西瓜ClaNAS基因家族编码蛋白的三级结构，利用SWISS-MODEL，以PDB中3fpf.1.A为模板，进行分析预测并构建模型。结果表明，ClaNAS1和ClaNAS3编码的蛋白质三级结构相似度较高，具有较复杂的三级结构；而ClaNAS2、ClaNAS4与ClaNAS1和ClaNAS3编码的蛋白质整体相似度差异较大，可能与ClaNAS2和ClaNAS4 2个成员的二级结构中含有的延伸链、β-转角、无规则卷曲数量差异较大有关。

2.3 西瓜ClaNAS基因家族蛋白保守基序与基因结构分析

为了探究西瓜ClaNAS家族的进化关系、蛋白保守基序与基因结构，分别利用MEGA7.0、MEME、TBtools进行分析，见图2。结果表明，西瓜4个ClaNAS家族成员主要分为I、II、III 3个亚家族，其中ClaNAS1和ClaNAS3为I类，成员ClaNAS2属于II类，ClaNAS4属于III类；蛋白保守基序结果显示，4个ClaNAS家族成员中ClaNAS1和ClaNAS2均含有从Motif1到Motif10共10个Motif，而ClaNAS3和ClaNAS4均含有7个Motif，从Motif1到Motif7；基因结构分析结果显示，4个ClaNAS家族成员的外显子数均只有1和2，其中ClaNAS1和ClaNAS2均含有2个外显子，且具有相同的外显子-内含子排列方式，而ClaNAS3和ClaNAS4的外显子数均为1，说明ClaNASs家族成员的基因结构整体比较简单。

图2 西瓜NAS基因家族蛋白的二级结构预测

2.4 西瓜ClaNASs家族的系统进化树分析

为了理解ClaNASs的功能和进化关系，利用MEGA7.0及其内置的ClustalW对5个拟南芥AtNASs，3个水稻OsNASs，4个甜瓜SlNASs，1个番茄SlNASs和4个西瓜ClaNASs的蛋白质序列进行多序列比对，见图3，并构建拟南芥、水稻、甜瓜、番茄和西瓜5个物种中NAS基因家族的系统进化树。结果表明，5个物种的NAS基因家族可分成3个亚家族，分别为I、II和III，其中I和II亚族均不含西瓜ClaNASs成员，而在III亚族中均是葫芦科植物，能够找到4个西瓜ClaNASs成员，分别是ClaNAS1～ClaNAS4，说明葫芦科植物与其他植物的差异较大。

图3 西瓜NAS基因家族蛋白的三级结构预测

2.5 西瓜ClaNASs家族启动子顺式作用元件分析

为了探究西瓜ClaNASs家族启动子中可能的顺式作用元件及其作用，利用TBtools软件获取西瓜ClaNASs家族转录起始位点上游2000bp的序列，并进行顺式作用元件分析，见图4，结果表明，西瓜ClaNASs启动子区含有激素应答、光响应、胁迫应答、转录因子结合位点等多种顺式作用元件，其中ClaNAS1～ClaNAS4中均含有光响应和脱落酸应答相关的响应元件；除了ClaNAS4，ClaNAS1～ClaNAS3还均含有水杨酸应答元件；ClaNAS1和ClaNAS3的启动子区均含有赤霉素应答元件，而ClaNAS2和ClaNAS4中均含有生长素应答元件；对于低温胁迫应答元件，仅在ClaNAS1和ClaNAS4中含有；此外，MYB转录因子相关序列均集中在ClaNAS1、ClaNAS3和ClaNAS4中，说明西瓜ClaNASs基因家族可能对激素、胁迫等多种信号有响应。

图4 西瓜NAS基因家族编码蛋白的保守基序和基因结构析

图5 西瓜、拟南芥、水稻和番茄的NAS基因家族进化树分析

图6 西瓜NAS基因家族启动子区顺式作用元件分析

2.6 西瓜ClaNASs家族共线性分析

利用TBtools对西瓜基因组内以及西瓜与拟南芥、番茄基因组间的NAS基因进行共线性分析，见图7、图8，结果表明，在西瓜基因组内NAS基因没有发现串联重复和片段复制，见图7；在西瓜与拟南芥基因组间共鉴定出2个ClaNAS基因与拟南芥存在共线性关系，分别是ClaNAS1与AT1G09240.1、ClaNAS1与AT1G56430.1、ClaNAS2与AT1G09240.1、ClaNAS2与AT1G56430.1；在西瓜与番茄基因组间同样鉴定出2个ClaNAS基因与番茄存在共线性关系，分别是ClaNAS1与Solyc01g100490.3.1、ClaNAS2与Solyc01g100490.3.1。

图7 西瓜NAS基因家族成员的共线性分析

图8 NAS基因在西瓜、拟南芥、番茄基因组间的共线性分析

3 讨论与结论

NAS是麦根酸(mugineic acid，MA)类家族生物合成途径中的关键酶，能够催化三分子的S-腺苷甲硫氨酸形成一分子的NA，在植物生长发育过程中具有重要的调节作用[8]。随着高通量测序技术和生物信息学技术的发展，目前已经在水稻、玉米、小麦、花生等多个物种中进行了NAS基因的鉴定和分析，并发现不同物种中NAS基因的数量与表达水平以及蛋白质的结构、长度和功能均存在显著差异[2，6]，而NAS基因在西瓜中的研究及其功能尚不清楚。

本研究利用生物信息学的方法对西瓜NAS基因家族进行了全基因组的鉴定和分析，共鉴定出4个NAS基因家族成员，与水稻、玉米、小麦和花生相比，基因数量差异较大，其中水稻基因组中共鉴定出3个OsNAS基因[9]，玉米全基因组中鉴定出9个ZmNAS基因[2，10]，花生全基因组中鉴定出6个AhNAS基因[7]，在面包小麦中共鉴定出21个TaNAS基因[6]。编码氨基酸的理化性质与其他物种差异也较大，本研究中西瓜NAS基因家族成员编码的氨基酸数量277～356aa，分子量30.68～39.88kDa，等电点4.71～7.46；而花生中AhNAS基因编码的氨基酸数量284～320aa，分子量32.03～35.65kDa，等电点5.37～6.37[7]。西瓜ClaNAS家族蛋白质的二级结构主要包含α-螺旋、延伸链、β-转角、无规则卷曲，而不含β-折叠，该结果与水稻SBP家族蛋白的二级结构组成一致[11]；对西瓜ClaNAS家族蛋白质的三级结构模型构建时，最优模板是3fpf.1，该结果与花生AhNAS蛋白质的三级结构模型构建时获得的最佳模板一致[7]。对西瓜4个NAS基因家族成员的基因结构分析显示，ClaNAS1和ClaNAS2均含有2个外显子，且具有相同的外显子-内含子排列方式，而ClaNAS3和ClaNAS4的外显子数均为1，该结果与花生中AhNAS1.1和AhNAS1.2的编码区含有2个外显子，AhNAS2.1、AhNAS2.2、AhNAS3.1和AhNAS3.2只有1个外显子的结果一致[7]。对拟南芥、水稻、番茄、西瓜、甜瓜5个物种共14个NAS蛋白质进行系统发育分析发现，禾本科、葫芦科植物与其他植物均单独聚为一类，其中在禾本科与其他非禾本科单独聚为一类方面与罗艳芳等[7]、Zhou等[2]的研究结果一致。

西瓜NAS基因家族启动子区的顺式作用元件主要含有激素应答、光响应、胁迫应答等；其中，激素应答顺式作用元件主要包括脱落酸、赤霉素、水杨酸、生长素等；胁迫应答主要是低温胁迫应答，而花生的NAS基因家族启动子区还包含茉莉酸甲酯激素应答，胁迫应答还包括干旱胁迫应答[7]。本研究中，在西瓜基因组内没有发现NAS基因的串联重复和片段复制，类似结果同样在其他物种中也存在，如红花基因组内也未发现SPL基因的串联重复和片段复制[12]，但在花生基因组内发现A组的AhNAS1.1、AhNAS2.1和AhNAS3.1分别与B基因组AhNAS1.2、AhNAS2.2和AhNAS3.2存在片段复制。西瓜NAS基因与拟南芥、番茄的NAS基因间分别存在2个共线性基因对，ClaNAS1与ClaNAS2分别连锁了2个基因对，表明ClaNAS1与ClaNAS2可能是保守的，在进化中发挥着重要的作用。