联合应用Xpert MTB/RIF、SAT-TB及MTB/NTM PCR方法检测支气管肺泡灌洗液对痰涂阴性肺结核的快速诊断价值

甄利波，王静，刘立宾，孙亚萍，王慧杰，莫婷

联合应用Xpert MTB/RIF、SAT-TB及MTB/NTM PCR方法检测支气管肺泡灌洗液对痰涂阴性肺结核的快速诊断价值

甄利波，王静，刘立宾，孙亚萍，王慧杰，莫婷

浙江大学医学院附属杭州市胸科医院（杭州市红十字会医院）结核内科及结核实验室，浙江杭州 310003

评估联合应用多色巢式荧光定量PCR（Xpert mycobacterium tuberculosis and rifampicin sensitivity test，Xpert MTB/RIF）、RNA恒温扩增实时荧光检测（simultaneous amplification and testing of tuberculosis，SAT‐TB）、荧光探针分枝杆菌核酸检测（mycobacterium tuberculosis/non-mycobacterium tuberculosis polymerase chain reaction，MTB/NTM PCR）3种方法检测疑诊肺结核患者的支气管肺泡灌洗液标本对痰涂阴性肺结核的快速诊断价值。采集2019年10月至2021年9月杭州市红十字会医院收治的痰涂片至少3次阴性的疑诊肺结核的898例患者支气管肺泡灌洗液，以MIGT960液体培养阳性为金标准，评估Xpert MTB/RIF、SAT-TB及TB/NTM PCR在检出MTB感染、耐药结核感染以及NTM感染中的快速诊断价值。在对MTB的检出效能方面，Xpert MTB/RIF、SAT-TB及TB/NTM PCR对MTB的检出率分别为87.24%、80.73%、88.02%，3者均达到80%以上，其中SAT-TB的检出率最低，其余两者相当，差异有统计学意义（<0.001）。而3者组合的平行试验对MTB的检出率最高达97.14%，差异有统计学意义（<0.001）。在对耐药结核的检出效能方面，MIGT960液体培养及Xpert MTB/RIF分别检出8.59%及10.94%的耐药结核，虽Xpert较高，但差异无统计学意义（=0.122）；而两者组合的平行试验可以检出12.24%的耐药结核，显著高于单用Xpert的效能（=0.019）。在对NTM的检出方面，MIGT960液体培养（14.03%）高于NTM-DNA（8.24%），差异有统计学意义（<0.001），两者组合的平行试验的检出率更高（14.48%）。与传统细菌学检测方法相比，联合使用Xpert MTB/RIF、SAT-TB及MTB/NTM PCR可以快速、敏感地检测出痰涂阴性疑诊肺结核患者支气管肺泡灌洗液标本中的结核核酸，同步检出耐药，还同时可以鉴别MTB与NTM，缩短了确诊时间，给疑诊肺结核患者的早期快速诊断提供了有效的实验室方案，值得临床推广应用。

核酸扩增；结核分枝杆菌；非结核分枝杆菌；支气管肺泡灌洗液；诊断效能

结核病仍然是我国面临的重大公共卫生问题，世界卫生组织（World Health Organization，WHO）《全球结核病报告2022》[1]指出，我国仍然是全球22个结核病高负担国家之一，无论是新发病例数还是患病总人数仍居全球第2位，现有结核病患者约100万，每年死于结核病的患者约20万人，给我国经济和社会发展带来巨大负担。尤其是在新冠病毒感染此起彼伏的影响下，结核病疫情的防控局面仍受到严峻挑战[2]。WHO在2016—2035年的工作计划中指出，2025年结核病死亡率应在2015年的基础上下降75%，2035年下降95%；结核病发病率分别下降50%和90%[3]。要实现这一目标目前面临的困难很多，如2022年新发现的结核病患者中，估计被发现和报告的仅为67%左右[4]；要达到全球终止结核病的目标，需要在诊断方法和发现策略方面采取更有效的措施。在结核病的传播研究方面，我国结核病的传播以近期传播为主；感染北京基因型菌株和耐多药菌株是导致近期传播的危险因素；而1/3的近期传播是由涂阴培阳结核病患者所致[5]。国外研究也表明，痰涂阴性肺结核的接触者被感染的概率为7.3%～21.0%[6]，因此，如何提高涂阴肺结核的诊断发现率，做到早期发现、早期治疗，对及时截断传播途径，减少播散，并最终消灭结核病具有重要意义[7]。

核酸扩增检测技术联合支气管镜下肺泡灌洗术，两者相辅相成，相对于传统的培养及涂片检测方法，缩短了检测周期，具有高灵敏度和准确度，已成为肺部感染病原体检测的有效工具[8]。本研究前期联合使用两种分子检测手段检测早期痰涂阴性肺结核患者的支气管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF），取得了较好的临床效果[9]，所以进一步研究支气管镜下靶向感染局部的支气管肺泡灌洗术联合多种分子生物学手段的检测在痰涂阴性肺结核的早期诊断中具有重要的临床意义[10]。本研究收集痰涂阴性疑诊肺结核患者的BALF标本，使用多色巢式荧光定量PCR（Xpert mycobacterium tuberculosis and rifampicin sensitivity test，Xpert MTB/RIF）、RNA恒温扩增实时荧光检测（simultaneous amplification and testing of tuberculosis，SAT-TB）及荧光探针分枝杆菌核酸检测（mycobacterium tuberculosis/non- mycobacterium tuberculosis polymerase chain reaction，MTB/NTM PCR）3种不同类型靶标核酸检测方法实行联合检测，评估单一方法及3者任一阳性的平行试验对痰涂阴性肺结核的诊断价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2019年10月至2021年9月在杭州市红十字会医院结核病诊疗中心及呼吸科就诊疑诊为肺结核的898例患者作为研究对象。纳入标准：①年龄>12周岁；②肺部影像学提示“活动性肺结核”；③至少3次镜检抗酸杆菌痰涂片阴性者（简称“涂阴”）；④可耐受支气管镜下支气管肺泡灌洗术；⑤患者及家属同意本研究并签署知情同意书。排除标准：①合并意识障碍、精神性疾病者；②合并严重心、肝、肾等器官功能不全者；③合并颜面部外伤后、畸形，或鼻咽、口咽手术等不适合行支气管镜检查者；④严重凝血功能异常，或血流动力学不稳定需使用血管活性药物者。所有患者均完成电子支气管镜下支气管肺泡灌洗术，BALF使用美国BD公司BactecMGIT 960专业分枝杆菌快速培养、鉴定和药敏实验系统培养提示分枝杆菌生长的疑诊肺结核患者898例，其中培养提示NTM为130例，耐多药肺结核66例，其余702例均为敏感肺结核。男535例，女363例，年龄（44.32±12.56）岁。本研究经杭州市红十字会医院伦理委员会批准（伦理审批号：2018研审第235号），并获得患者知情同意。

1.2 方法

1.2.1 支气管镜检查 患者空腹下接受局部麻醉或静吸复合麻醉下经鼻或经口电子支气管镜下常规检查术。

1.2.2 BALF标本采集 结合患者胸部CT表现，支气管镜头端吸引孔道靶向病灶局部支气管末端，抵住末端管口，经孔道注入生理盐水10～15ml入远端肺泡组织，静置5s后经孔道负压吸引，收集BALF 5～10ml。

1.2.3 样本液化处理和菌体富集 取5ml以上的BALF标本，视BALF清浊程度加入0.5%N‐乙酰‐L‐半胱氨酸（NALC）‐NaOH处理液漩涡震荡混匀（液化时间不能超过5min），离心得沉渣后采用6.8% PBS洗涤后分别进行抗酸染色、Bactec‐MGIT960结核分枝杆菌快速培养、DNA及RNA提取。

1.2.4 萋尼氏抗酸染色 按照结核病诊断实验室检验规程进行[9]。

1.2.5 Bactec MGIT 960结核分枝杆菌快速培养 按照试剂盒说明书进行（批号20190110和20205810等）。

1.2.6 菌型鉴定 采用德国HAIN Lifescience的The GenoType system 鉴定（简称HAIN试验），按照试剂盒说明书进行（批号20191020）。

1.2.7 MTB/NTM PCR检测 采用分枝杆菌（MTB/ NTM）核酸检测试剂盒（PCR‐荧光探针法），购自凯杰生物工程（深圳）有限公司，按照试剂盒说明书进行（批号 20191104和 20201511等）。

1.2.8 RNA恒温扩增实时检测 采用结核分枝杆菌（，TB）核酸检测试剂盒（RNA恒温扩增），购自上海仁度公司，按照试剂盒说明书进行（批号 20192015和20201591等）。

1.2.9 多色巢式荧光定量PCR（Xpert MTB/RIF）检测 采用赛沛公司GeneXpert分子诊断系统，标本使用2:1的试剂进行液化和灭活，然后转入试验盒中，然后插入MTB/RIF试验台，由设备自动进行标本的滤过和清洗、超声溶解、DNA释放，并在整合反应管里自动进行巢式实时扩增和检测，并自动生成检测结果。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 3种检测方法对痰涂阴性患者BALF中MTB检出效果分析

剔除NTM后，对液体快速培养提示结核分枝杆菌阳性768例患者BALF的检测方面，Xpert MTB/RIF、SAT-TB、MTB/NTM-PCR 3种方法检测阳性例数分别为670例、620例、676例，检出率分别为87.24%、80.73%、88.02%，差异无统计学意义（>0.05）。3者同时为阳性的检出例数为562例，阳性率为73.18%。如果把3者组合为一个平行试验，即同一患者的BALF标本3种检测方法中任一阳即认定为阳性，以此作为标准其阳性病例检出数为746例，阳性率为97.14%，显著高于3种方法单一使用的检出效能（<0.001）。SAT-TB+Xpert MTB/RIF双阳、SAT-TB+MTB/NTM-PCR双阳的检出的病例数分别为578例、620例，检出率分别为75.26%、80.73%，后者的检出率显著高于前者，（=0.010），见表１。

表1 3种检测方法对BALF中MTB检出效果分析[n（%），n=768]

注：与Xpert及PCR比较，*<0.001；与SAT+Xpert双阳比较，#=0.010

2.2 Xpert MTB/RIF与MGIT 960对痰涂阴性患者BALF耐利福平结核菌（RR-TB）检出效果比较

BALF标本培养提示结核分枝杆菌阳性768例患者中，MGIT 960提示耐多药肺结核66例，耐多药检出率8.59%，其中，Xpert同步提示利福平耐药者56例，阳性率为84.85%。768例患者中，Xpert提示利福平耐药者84例，阳性率为10.94%，同步MGIT 960检出56例，阳性率为66.67%。Xpert MTB/RIF检测RR-TB的敏感度为66.67%（95%：59.61～72.45），特异性为98.54%（95%：93.65～98.89）。而两者联用检出耐药共计94例，耐药检出率为12.24%。同时还发现，768例患者中，Xpert提示利福平耐药且DNA阳性者78例，阳性率为10.10%，高于培养耐药检出率，见表2、3。

表2 Xpert MTB/RIF与MGIT 960对BALF中MTB耐药情况检出效果分析

表3 3种检测方法对BALF中MTB耐药情况检出效果分析[n（%），n=768]

注：与培养耐药比较，*=0.122，#=0.019

2.3 MTB/NTM-PCR与液体快速培养在NTM检出方面的效果分析

因为TB/NTM-PCR同时整合了结核分枝杆菌（MTB）及NTM的特异性探针，所以可以鉴别MTB与NTM，若是MTB-DNA阳性同时NTM-DNA阴性，则明确为MTB感染；而MTB-DNA阴性同时NTM-DNA阳性，则明确为NTM感染。本研究中，在培养提示NTM的126份BALF标本中，NTM-DNA检出阳性70例，检出率为55.56%，检出率并不高，尚不能满足临床对于快速诊断NTM肺病的需要。NTM-DNA检出阳性的74例标本中，同步培养提示NTM者达到70例，培养检出率为94.59%。960快速培养联合NTM-DNA共计检出NTM130例，在898份BALF样本中总体检出率为14.48%，见表4。

表4 MTB/NTM PCR联合Bactec MGIT 960快速培养在NTM检出方面的效果分析[n（%）]

注：与PCR比较，*<0.001

3 讨论

我国作为全球结核病疫情第二大国，一直存在结核病的早期检出率不高，诊断治疗不及时的问题，并带来耐药结核检测率及治疗率低的问题[10-11]，不利于结核病疫情的防控，也给经济社会带来巨大负担。随着常规肺部影像筛查方法的日渐普及，早期痰涂阴性肺结核的检出率越来越高，但痰涂阴性肺结核的确诊比较困难，普通痰涂片病原学检测的敏感度、阳性率太低，培养的周期较长，均不能满足临床开展病原诊断精准、快速的需求。所以在县级及以上医疗机构针对疑诊肺结核患者开展支气管镜下BALF进行MTB核酸的检测开展得越来越普遍。

结核病临床及实验室应用较多的检测项目包括基于DNA的Xpert MTB/RIF、MTB/NTM PCR，以及基于RNA的SAT-TB，3者无论是从技术原理还是临床应用上均有一定差异。

基于荧光定量PCR的Xpert MTB/RIF检测系统，为一整套全自动的结核分枝杆菌分子诊断系统，人工加样后系统可以在2h内自动完成MTB的分子鉴定及利福平耐药性的检测，最低检测限约为131CFU/ml，敏感度和固体培养接近，特异性接近100%，操作简单、安全，对实验室条件要求不高，还可以同时检测利福平耐药基因位点突变，是2010年到目前为止WHO强烈推荐用于结核和利福平耐药的快速诊断技术[12]。由于其对实验室清洁度要求不高，在县级医院的普通细菌实验室就可以实现，可以极大方便偏远地区肺结核患者的快速诊断需求。本研究发现Xpert MTB/RIF检测BALF标本总体阳性率达到87.24%，利福平耐药肺结核检出阳性率为10.94%，比培养检出耐药率8.59%要高。且Xpert MTB/RIF检测24h出结果，快速诊断价值更高。两者联用对于耐药肺结核检出共计94例，耐药检出率为12.24%，这与世卫组织对我国预估耐药率的水平相当[1]，说明联合使用Xpert MTB/RIF和960液体快速培养对于早期快速检出耐多药肺结核意义重大。

但是基于DNA的检测方法有不足之处，即无法区分死菌与活菌、不能区分活动性结核与非活动性结核，因为基于我国的国情，有规范抗结核治疗史的非活动性肺结核患者有一个庞大的人群，这给基于DNA检测方法的解读带来了极大的挑战。且DNA标本之间容易交叉污染，一旦污染又难以消除，这一方面，可以提示病原转录活性RNA可以弥补。

SAT‐TB技术是建立在RNA恒温扩增技术和实时荧光检测技术基础上的检测技术，是以MTB特异的16S rRNA为检测靶标，通过恒温RNA扩增技术扩增靶标片段，从而快速准确地判断待检样本中是否有MTB活菌的存在。在《肺结核活动性判断规范及临床应用专家共识》[13]中，强烈推荐使用基于RNA的SAT‐TB等检测技术来判定肺结核活动性。本研究中因为纳入的均为培养阳性的病例，故无法体现RNA诊断活动性肺结核的优越性，但在活动性肺结核的检出方面优势明显，768例活动性肺结核患者中，SAT-TB检出676例，检出率为88.02%，对于快速诊断活动性肺结核价值巨大，与既往的研究也类似[14]。借助于SAT-TB区分死菌和活菌的特点，有利于肺结核治疗疗效的监测和辅助判愈，为治疗方案提供参考，减少过度医疗，也比培养法更有时效性，更具有快速诊断价值。同时，联合使用Xpert MTB/RIF既可以明确肺结核活动性，又可以明确利福平耐药情况，两者双阳病例578例，检出率为75.26%，对于临床的诊断价值也较高。

MTB/NTM PCR检测同时整合了MTB与NTM的DNA靶点，对于疑诊肺结核并需要鉴别NTM肺病的患者有较大价值。本研究中，MTB-DNA阳性者620例，检出率为80.73%，与培养的符合率100%，与既往研究结果基本一致[14]，可见MTB/NTM PCR对MTB感染的检出效果较为理想，具有较好的快速诊断价值。在对NTM感染的检出方面，在培养提示NTM的126份BALF标本中，NTM-DNA检出阳性70例，检出率为55.56%，检出率并不高，尚不能满足临床对于快速诊断NTM肺病的需要。NTM-DNA检出阳性的74例标本中，同时培养提示NTM者达到70例，培养检出率为94.59%，提示960快速培养在NTM的检出方面较为优秀。960快速培养联合NTM-DNA共计检出NTM 130例，在898份BALF样本中总体检出率为14.48%，与其他研究相仿[15]。另外，NTM-DNA阳性标本可以直接加做熔解曲线或基因分型从而在24h内鉴定出NTM菌种，为早期快速制定抗NTM治疗方案提供依据。由于临床致病的大部分NTM在960快速液体培养系统中生长速度较MTB显著增快，所以联合使用NTM-DNA和快速液体培养系统在NTM肺病的诊断中具有显著优势。同时，MTB-DNA阳性者可在48h内完善熔解曲线耐药基因检测，同时明确异烟肼、利福平、氟喹诺酮类药物的耐药情况，有利于快速制定耐多药治疗方案，减少住院时间，减轻患者负担及医保负担，也有利于减少耐多药肺结核患者的社会面暴露时间，对于耐多药肺结核疫情的防控至关重要。

在Xpert MTB/RIF、SAT-TB及MTB/NTM PCR 3种方法组合使用的平行试验中，3者任一阳性即认定为阳，共计检出MTB感染746例，检出率为97.14%。可见SAT-TB、MTB/NTM PCR、Xpert MTB/RIF 组合使用的平行试验的阳性率最高，与快速培养的金标准相比较也几乎能完全覆盖，充分体现了联合使用3种方法检测BALF对于快速诊断痰涂阴性肺结核患者的临床价值。

当然，本研究的研究设计存在一定局限，未纳入排除结核的患者进行统计和讨论，这样就无法进行各种方法的特异性和敏感度的精确统计和研究。本研究结果证明，支气管镜下肺泡灌洗术联合3种方法联合检测，对不能开展结核分枝杆菌快速培养、NTM 鉴定的医院或非结核病专业的呼吸科医生而言，在结核病的快速精准诊断、耐多药肺结核的快速早期检出、NTM肺病的精准诊疗中的巨大价值应该引起足够重视。

[1] World Health Organization. Global tuberculosis report 2022[R]. Geneva: World Health Organization 2022.

[2] AGARWAL V, GANESH L, SUNITHA B K. Impact of COVID-19 on the mental health among children in China with specific reference to emotional and behavioral disorders[J]. Int J Hum Rights Health, 2020, ahead-of- print (ahead-of-print).

[3] World Health Organization. Guidelines on the management of latent tuberculosis infection[M]. Geneva: World Health Organization, 2015: 13–20.

[4] TIEMERSMA E W, VAN DER WERF M J, BORGDORFF M W, et al. Natural history of tuberculosis: duration and fatality of untreated pulmonary tuberculosis in HIV negative patients: a systematic review[J]. PLoS One, 2011, 6(4): e17601.

[5] STEINGART K R, HENRY M, NG V, et al. Fluorescence versus conventional sputum smear microscopy for tuberculosis: a systematic review[J]. Lancet Infect dis, 2006, 6(9): 570–581.

[6] POUROSTADI M M-Pill, RASHEDI J M S, MAHDAVI POOR B M S, et al. Frequency of smear-negative tuberculosis in Northwest Iran[J]. Iran J Med Sci, 2018, 43(3): 269–275.

[7] GALAN A, SIMON C. Monitoring stemness in long-term hesc cultures by real-time PCR [J]. Methods Molecul Bio, 2014, 1307: 89–104.

[8] EOM J S, PARK S, JANG H, et al. Bronchial washing using a thin versus a thick bronchoscope to diagnose pulmonary tuberculosis: a randomized trial[J]. Clin Infect Dis, 2023, 76(2): 238–244.

[9] 王静, 刘立宾, 岳永宁, 等. RNA恒温扩增实时检测技术与荧光定量PCR联合检测肺泡灌洗液对痰涂阴性肺结核的快速诊断价值[J]. 中华医院感染学杂志, 2017, 27(2): 6.

[10] JO Y S, PARK J H, LEE J K, et al. Discordance between MTB/RIF and real-time tuberculosis-specific polymerase chain reaction assay in bronchial washing specimen and its clinical implications[J]. PLoS One, 2016, 11(10): e0164923.

[11] LEE H Y, SEONG M W, PARK S S, et al. Diagnostic accuracy of Xpert® MTB/RIF on bronchoscopy specimens in patients with suspected pulmonary tuberculosis[J]. Int J Tuberc Lung Dis, 2013, 17(7): 917–921.

[12] World Health Organization. WHO consolidated guidelines on tuberculosis. Module 5: management of tuberculosis in children and adolescents[R]. Geneva: World Health Organization, 2022.

[13] 国家感染性疾病临床医学研究中心, 深圳市第三人民医院, 中国防痨杂志编辑委员会. 肺结核活动性判断规范及临床应用专家共识[J]. 中国防痨杂志, 2020, 42(4): 301–307.

[14] SALI M, DE MAIO F, CACCURI F, et al. Multicenter evaluation of anyplex plus mtb/ntm mdr-tb assay for rapid detection of mycobacterium tuberculosis complex and multidrug-resistant isolates in pulmonary and extrapulmonary specimens[J]. J Clin Microbiol, 2016, 54(1): 59–63.

[15] LUUKINEM B V, VUENTO R, HIRVONEN J J. Evaluation of a semi-automated Seegene PCR workflow with MTB, MDR, and NTM detection for rapid screening of tuberculosis in a low-prevalence setting[J]. APMIS, 2020, 128(5): 406–413.

Value of Xpert MTB/RIF, RNA isothermal amplification real‐time testing and MTB/NTM PCR combined with detection of bronchoalveolar lavage fluid in rapid diagnosis of sputum smear‐negative pulmonary tuberculosis

Department of Tuberculosis and Tuberculosis Laboratory, Affiliated Hangzhou Chest Hospital, Zhejiang University School of Medicine (Hangzhou Red Cross Hospital), Hangzhou 310003, Zhejiang, China

To evaluate the value in detection of bronchoalveolar lavage fluid with Xpert mycobacterium tuberculosis and rifampicin sensitivity test (Xpert MTB/RIF), RNA simultaneous amplification and testing of tuberculosis (SAT-TB) and mycobacterium tuberculosis/non-mycobacterium tuberculosis polymerase chain reaction (MTB/NTM PCR) combined in diagnosis of sputum smear‐negative pulmonary tuberculosis.From October 2019 to September 2021, the bronchoalveolar lavage fluid specimens were collected from patients with suspected pulmonary tuberculosis who were tested negative for sputum smear for at least 3 times, With Bactec MGIT 960 culture set as the golden standard, rapid diagnostic value of Xpert MTB/RIF combined with SAT‐TB and MTB/NTM PCR in testing MTB infection, drug-resistant TB infection, and NTM infection were evaluated and compared with single Xpert MTB/RIF, SAT-TB and MTB/NTM PCR.A total of 898 cases were positive cultured with Bactec MGIT 960 system, 130 specimens were NTM, others were MTB. In the detection of tuberculosis, Xpert MTB/RIF, SAT-TB and MTB/NTM PCR could detect 670 specimens, 620 specimens and 676 specimens respectively, detection rate were 87.24%, 80.73% and 88.02% respectively; there was no significant difference in the value of diagnosis between the single detection of Xpert MTB/RIF and MTB/NTM PCR; the detection rate of SAT-TB was significantly lower than other two (<0.001), detection rate of 3 combined parallel test (single positive) was significantly higher than Xpert or MTB/NTM PCR (<0.001).As compared with traditional bacteriological detection, using Xpert MTB/RIF, SAT-TB and MTB/NTM PCR in combination is rapid and sensitive in diagnosis of sputum‐negative drug-sensitive and -resistance pulmonary tuberculosis and can discriminate from MTB to NTM, shorten the diagnosis time, raise the accuracy, and offer an effective auxiliary mean for diagnosis of the sputum smear‐negative pulmonary tuberculosis, and it is worthy to be promoted in hospital.

Nucleic acid amplification; Mycobacterium tuberculosis; Nontuberculosis mycobacteria; Bronchoalveolar lavage fluid; Diagnostic efficiency

R651.15

A

10.3969/j.issn.1673-9701.2023.26.001

浙江省医药卫生科技计划项目（2023KY968）；杭州市卫生科技计划项目（0020190112）

甄利波，电子信箱：zhenlibodoctor@163.com

（2023–02–01）

（2023–08–27）